Name: Whole Sırasının NGS Analiz için bir transpozaz tabanlı Technology tarafından gDNA Zenginleştirme BRCA1 BRCA2 ve 9 Genler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Öğrenin, transposaz teknolojisiyle 11 DNA onarım geninin tam dizisini eş zamanlı analiz etme yöntemini. Bu protokol, NGS için gDNA zenginleştirme sağlar ve genetik varyasyon tespitini hızlandırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ligue contre le Cancer de Côte d'Or'a ve Centre Georges-François Leclerc'e finansal destekleri için teşekkür ederiz. Makalenin editörlüğü için Philip Bastable'a teşekkür ederiz.

<ol><li>Cornelisse, C. J., Cornelis, R. S., Devilee, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+responsible+for+familial+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol.+Res.+Pract%22%5BJournal%5D)">Genes responsible for familial breast cancer.</a> Pathol. Res. Pract. 192 (7), 684-693 (1996).</li>
<li>Culver, J., Lowstuter, K., Bowling, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+breast+cancer+risk+and+BRCA1%2F2+carrier+probability%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Dis%22%5BJournal%5D)">Assessing breast cancer risk and BRCA1/2 carrier probability.</a> Breast Dis. 27, 5-20 (2007).</li>
<li>Cox, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+variants+of+the+BRCA1+wild-type+allele+modify+the+risk+of+breast+cancer+in+BRCA1+mutation+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Common variants of the BRCA1 wild-type allele modify the risk of breast cancer in BRCA1 mutation carriers.</a> Hum. Mol. Genet. 20 (23), 4732-4747 (2011).</li>
<li>Maia, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+BRCA2+cis-regulation+in+normal+breast+and+cancer+risk+amongst+BRCA2+mutation+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of BRCA2 cis-regulation in normal breast and cancer risk amongst BRCA2 mutation carriers.</a> Breast Cancer Res. 14 (2), 63(2012).</li>
<li>Anczuków, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA2+deep+intronic+mutation+causing+activation+of+a+cryptic+exon%3A+opening+toward+a+new+preventive+therapeutic+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">BRCA2 deep intronic mutation causing activation of a cryptic exon: opening toward a new preventive therapeutic strategy.</a> Clin. Cancer Res. 18 (18), 4903-4909 (2012).</li>
<li>Brewster, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+fifteen+novel+germline+variants+in+the+BRCA1+3%27UTR+reveals+a+variant+in+a+breast+cancer+case+that+introduces+a+functional+miR-103+target+site%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mutat%22%5BJournal%5D)">Identification of fifteen novel germline variants in the BRCA1 3'UTR reveals a variant in a breast cancer case that introduces a functional miR-103 target site.</a> Hum. Mutat. 33 (12), 1665-1675 (2012).</li>
<li>Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+and+BRCA2%3A+different+roles+in+a+common+pathway+of+genome+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection.</a> Nat Rev Cancer. 12 (1), 68-78 (2012).</li>
<li>Ma, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+evidence+for+the+contribution+of+the+genetic+variations+of+BRCA1-interacting+protein+1+%28BRIP1%29+to+the+genetic+susceptibility+of+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">First evidence for the contribution of the genetic variations of BRCA1-interacting protein 1 (BRIP1) to the genetic susceptibility of cervical cancer.</a> Gene. 524 (2), 208-213 (2013).</li>
<li>Haanpää, M., Pylkäs, K., Moilanen, J. S., Winqvist, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+need+for+routine+clinical+testing+of+PALB2+c.1592delT+mutation+in+BRCA+negative+Northern+Finnish+breast+cancer+families%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the need for routine clinical testing of PALB2 c.1592delT mutation in BRCA negative Northern Finnish breast cancer families.</a> BMC Med. Genet. 14, 82(2013).</li>
<li>Southey, M. C., Teo, Z. L., Winship, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PALB2+and+breast+cancer%3A+ready+for+clinical+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Clin.+Genet%22%5BJournal%5D)">PALB2 and breast cancer: ready for clinical translation.</a> Appl. Clin. Genet. 6, 43-52 (2013).</li>
<li>Ulahannan, D., Kovac, M. B., Mulholland, P. J., Cazier, J. B., Tomlinson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+and+implementation+issues+in+using+next-generation+sequencing+of+cancers+in+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Technical and implementation issues in using next-generation sequencing of cancers in clinical practice.</a> Br. J. Cancer. 109, 827-835 (2013).</li>
<li>Hernan, I., Borràs, E., de Sousa Dias, M., Gamundi, M. J., Mañé, B., Llort, G., Agúndez, J. A., Blanca, M., Carballo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+genomic+variations+in+BRCA1+and+BRCA2+genes+by+long-range+PCR+and+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Detection of genomic variations in BRCA1 and BRCA2 genes by long-range PCR and next-generation sequencing.</a> J. Mol. Diagn. 14, 286-293 (2012).</li>
<li>Knierim, E., Lucke, B., Schwarz, J. M., Schuelke, M., Seelow, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+three+methods+for+fragmentation+of+long-range+PCR+products+for+next+generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of three methods for fragmentation of long-range PCR products for next generation sequencing.</a> Plos One. 6, e28240(2011).</li>
<li>de Sousa Dias, M., Hernan, I., Pascual, B., Borràs, E., Mañé, B., Gamundi, M. J., Carballo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+novel+mutations+that+cause+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa+in+candidate+genes+by+long-range+PCR+amplification+and+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Detection of novel mutations that cause autosomal dominant retinitis pigmentosa in candidate genes by long-range PCR amplification and next-generation sequencing.</a> Mol. Vis. 19, 654-664 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Breast+Cancer+Linkage+Consortium.+Cancer+Risks+in+BRCA2+Mutation+Carriers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">The Breast Cancer Linkage Consortium. Cancer Risks in BRCA2 Mutation Carriers.</a> J. Natl. Cancer Inst. 91, 1310-1316 (1999).</li>
<li>Levy-Lahad, E., Friedman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+risks+among+BRCA1+and+BRCA2+mutation+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer risks among BRCA1 and BRCA2 mutation carriers.</a> Br. J. Cancer. 96 (1), 11-15 (2007).</li>
<li>Risch, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+BRCA1+and+BRCA2+mutation+frequencies+and+cancer+penetrances%3A+a+kin-cohort+study+in+Ontario%2C+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer penetrances: a kin-cohort study in Ontario, Canada.</a> J. Natl. Cancer Inst. 98 (23), 1694-1706 (2006).</li>
<li>Slater, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PALB2+mutations+in+European+familial+pancreatic+cancer+families%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Genet%22%5BJournal%5D)">PALB2 mutations in European familial pancreatic cancer families.</a> Clin. Genet. 78, 490-494 (2010).</li>
<li>Brennan, G. T., Relias, V., Saif, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA+and+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.O.P%22%5BJournal%5D)">BRCA and pancreatic cancer.</a> J.O.P. 14 (4), 325-328 (2013).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

NGS cihazların ve teknolojilerin yaygın kullanımı kanser ve genetik bozuklukların çalışmada yeni fırsatlar sunmuştur. Tüm genom sekanslaması ya da RNA sıralamasına ek olarak, çok sayıda hasta için seçilen gDNA dizilerinin büyük bir miktarda analizi aynı anda tan büyük potansiyel sunmaktadır. Burada, bir orta verim sıralama cihazı (Malzeme / Ekipman Tablo) ile eş zamanlı olarak 24 hastada 11 tam genlerin çalışma NextEra teknolojisini kullanarak (talep üzerine mevcuttur) belirli bir tasarım geliştirdi. Bu protokol hata ri...

2010 yılında, (esas kadın) yaklaşık 1.5 milyon kişi meme kanseri gelişmiş. Bu vakaların% 5-10 kalıtsal olduğu tahmin edilmektedir. Kalıtsal meme ve yumurtalık kanserlerinde 1 katılan neredeyse 20 yıl önce, BRCA1 ve BRCA2 tespit edilmiştir. 15 yıl öncesine kadar, BRCA1 ve BRCA2 kodlama bölgeleri, meme ve yumurtalık kanseri genetik yatkınlık belirlemek için dizilenmiştir. BRCA1 ve BRCA2 değişiklikler, bu bölgelerin yapılan analiz, etkin taraması için yeterli olmadığını göstermektedir seçilen ailesine 2&#39;nin 10-20% olarak tespit edilir. Son zamanlarda, BRCA1 ve BRCA2 olmayan kodlama dizileri (promotör, intronlu 3-&#39;UTR) analizi yeni mutasyonlar / çeşitleri meme kanseri 3-6 daha yüksek bir risk ile bağlantılı olabileceğini vurguladı. BRCA1 ve BRCA2 proteinleri (homolog rekombinasyon tamir katılmaktadırlarSayısız partnerle 7 tamamlanır HHR). BRCA1 veya BRCA2 değişiklikler DNA onarımı kusurları neden olurken, diğer ortaklar da meme kanseri riskini etkileyebilir. Bu hipotez BRIP1 beri 8 valide edilmiş görünüyor ve PALB2 9 sırasıyla, serviks ve meme kanseri üzerinde kanıtlanmış bir etkisi var. Buna ek olarak, diğer iki &quot;orta riskli&quot; meme kanseri yatkınlık genleri, ATM ve CHEK2, ayrıca rutin 10 incelenebilir. Bu çalışmalardan elde ardından, biz aynı anda nispeten çok kolay ve kullanan 24 hastada 11 genleri (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80 ve TP53) analiz etmek için bir protokol geliştirmeye karar verdi orta çıktı aygıtında zenginleştirme ve sıralama ile transposaz teknolojisine dayalı hızlı protokol,. TeşekkürlerBu teknik için, 2500 bp&#39;lik bir intronik bölgeleri dahil verildiği RAP80, (: 176,381,588-176,390,180 CHR5) hariç olmak üzere, 3&#39;-UTR sonuna promotörün başlangıç ​​aşamasında tam genleri dizildi. Bu 2.734 problar ile çalışıldı yaklaşık 1.000.300 bp toplam temsil eder. Genellikle, BRCA1 ve BRCA2 egzonik dizileri az 20 hasta için 1.5 ay ihtiyaç Sanger dizileme ile analiz edilmektedir. Mevcut protokol (Şekil 1) ile, aynı zamanda, fazla 75 hasta için 11 tam genler analiz edilebilir.

<table><tbody><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1001</td><td>Dizi/orta verim cihazı</td></tr><tr><td>Nextera Zenginleştirme kiti</td><td>Illumina</td><td>FC-123-1208</td><td>Transpozaz tabanlı teknoloji</td></tr><tr><td>300 döngü kartuşu</td><td>Illumina</td><td>15033624</td><td></td></tr><tr><td>AMPure boncukları</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Manyetik arıtma boncukları</td></tr><tr><td>Manyetik stand</td><td>Alpaqua</td><td>A32782</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu Plakalar</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>MIDI 96 kuyulu plakalar</td><td>Biorad</td><td>AB0859</td><td></td></tr><tr><td>Microseal A</td><td>Biorad</td><td>MSA-5001</td><td>Bu mühür yalnızca PCR amplifikasyonu için gereklidir. Deney boyunca başka standart contalar da kullanılabilir</td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td>Sıralama cihazı Experiment Manager yazılımı ile sağlanır İnternet adresi: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new Üretici web sitesi aracı</td></tr></tbody></table>

whole sırasının ngs analiz için bir transpozaz tabanlı technology tarafından gdna zenginleştirme brca1 brca2 ve 9 genler

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

Yeni Nesil dizileme yaygın kullanımı kanser araştırmaları ve tanı için yeni yollar açtı. NGS büyük kanser yeni miktarlarda veri ve özellikle kanser genetiğini getirecektir. Mevcut bilgi ve gelecekteki keşifler gerekli kansere genetik yatkınlık rol olabilir genlerin büyük bir dizi çalışma yapacak. Bu amaçla, DNA hasarı tamir katılan 11 komple genlerin çalışma NextEra bir tasarım geliştirildi. Bu protokol güvenle, aynı anda 24 hastada 11 genler (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80 ve TP53) promoterinden 3&#39;-UTRsine incelemek için geliştirilmiştir. Transposaz teknoloji ve gDNA zenginleştirme dayanan bu protokol, çoklama, örnek genetik tanı sayesinde zaman açısından büyük bir avantaj sağlar. Bu protokol, güvenli bir şekilde, kan gDNA kullanılabilir.

Örnek QC Sonuçlar Hedef genlerin sekansları belirlemek için bu yöntemin özelliği gDNA (Şekil 2A) ve kalitesi tagmentation aşamasının kalitesine bağlıdır. Tagmentation (Şekil 2B, üst panel) yeterli değilse, sıralama tatmin edici olmayacaktır. Yukarıda zikredildiği gibi, tagmentation saflaştırmadan sonra, 300 bp civarında gDNA parçalarının çoğunluğu (Şekil 2B, alt panel) ile yaklaşık 1,000 bp'ye kadar olan 150 bp parça halinde tagmented olmalıdır...

NGS dizilimi için gDNA zenginleştirme, yapısal mutasyonların incelenmesi için kolay ve güçlü bir araçtır. Bu makalede, DNA hasarının onarımında yer alan 11 genin tam dizisini basitçe analiz etme prosedürünü sunuyoruz.

Whole Sırasının NGS Analiz için bir transpozaz tabanlı Technology tarafından gDNA Zenginleştirme BRCA1 BRCA2 ve 9 Genler

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

Aşağıdaki deneyin amacı, transpozaz tabanlı teknolojiye dayalı çok kolay ve nispeten hızlı bir protokol ile 11 genin dizisini eş zamanlı olarak analiz etmektir. Bu, adaptörlerle doğrudan bağlanmış 300 baz çifti DNA fragmanı elde etmek için bir transpozazın etkisiyle elde edilir. Belirli problar kullanılarak yapılan ilk yakalama, ilgilenilen bölgelerdeki örnekleri zenginleştirir.Bu adım, yalnızca hedef dizileri elde etmek için bir kez daha tekrarlanır. Daha sonra, dizi hizalama ve biyoinformatik analize dayalı olarak genlerde genetik varyasyonlar gösteren dizi sonuçları elde edilecek materyal miktarını artırmak için PCR amplifikasyonu gerçekleştirilir. Bu tekniğin Sanger dizileme gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, iki haftadan daha kısa bir sürede 11 tam gen için 24 tutkuyu analiz etmemizi sağlayan büyük kapasitesidir.Prosedürü göstermek, laboratuvarım için bir teknisyen olan Sandy olacak. Başlamak için, DNA zenginleştirme kitindeki tüm reaktifleri hazırlayın. Hazır olduğunda, 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna yaklaşık 50 nanogram genomik DNA ekleyin, 25 mikrolitre TD tamponu ve ardından beş mikrolitre TDE bir tampon ekleyerek mentasyona başlayın.Her bir oyuğa 50 mikrolitreye bir pipet ayarlayın ve tüm hacmi 10 kez yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin. Kısa bir süre santrifüjleyin ve hazır olduğunda plakayı bir termocycler'a yerleştirin. ST çözeltisini vorteksleyin ve numune içeren her bir oyuğa 15 mikrolitre ekleyin.Pipeti 65 mikrolitreye ayarlayın ve tüm hacmi 10 kez yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin, santrifüjden önce beş dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Daha sonra, her bir kuyucuk karışımına 52 mikrolitre önceden karıştırılmış saflaştırma manyetik boncuk ekleyin ve santrifüjlemeden önce 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Boncukları etanol ile yıkadıktan sonra, plakayı manyetik standdan çıkarın ve 22,5 mikrolitre RSB tamponu ekleyin.Karıştırdıktan sonra, plakayı manyetik standın üzerine yerleştirin ve iki dakika inkübe edin. Süpernatantın tamamen berrak göründüğünden emin olun. Snat'ın 20 mikrolitresini yavaşça yeni bir 96 kuyulu plakaya aktarın.PCR amplifikasyonunun ilk turuna başlamak için, 20 mikrolitre LP PMM ve her birine indeks bir ve indeks ikiden beşer mikrolitre ekleyin. İyice karıştırın ve plakayı yapışkan bir Micros EAL filmi ile kaplayın. Santrifüjlemeden sonra, plakayı Thermocycler'a yerleştirin ve birinci programı çalıştırın.Saflaştırdıktan ve ilk PCR turundan elde edilen verimi belirledikten sonra, 12 adede kadar numune çekerek ilk hibridizasyona başlayın. Yeni 96 kuyulu plakada, her havuzun nihai hacminin 40 mikrolitreyi geçmemesine dikkat edin, iyice NCT'yi bir çözelti karıştırın ve her kuyucuğa 50 mikrolitre ekleyin. 10 mikrolitre CSO ekledikten sonra plakayı karıştırın ve kapatın.Santrifüjlemeden sonra, plakayı bir termodöngüleyiciye yerleştirin ve Programı çalıştırın. İki. İlk hibridizasyon yıkaması için, plakayı termosiklerden ve santrifüjden çıkarın. Yapışkan kapağı çok dikkatli bir şekilde kısaca çıkarın.100 mikrolitre reaksiyon karışımını plakadan yeni bir MIDI 96 kuyulu plakaya aktarın ve 250 mikrolitre kuyu Vortex SMB çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe etmeden önce plakayı karıştırın ve kapatın. Supenayı yıkadıktan ve attıktan sonra, boncuk içeren kuyucuklara 200 mikrolitre iyi karıştırılmış WS iki solüsyonu ekleyin ve tüm hacmi yeni bir 96 Kuyulu plakaya aktarın.Plakayı kapatın ve bir termocycler'a yerleştirin. Termocycler'ı 30 dakika boyunca 42 santigrat derecede çalıştırın. Tamamlandığında, plakayı hemen iki dakika boyunca manyetik standın üzerine yerleştirin.Süpernatantın tamamen berrak göründüğünden emin olun. Contayı çıkarın ve tüm süpernatanı hemen atın. Plakayı manyetik standdan çıkarın.Boncuk içeren kuyucuklara 200 mikrolitre iyi karıştırılmış Ws üç çözelti ekleyin ve iyice karıştırın. Supinatı yıkadıktan ve çıkardıktan sonra, plakayı kapatın ve kalan sırtüstü natanı aşağı çekmek için kısa bir süre santrifüjleyin. Plakayı iki dakika boyunca manyetik standın üzerine yerleştirin.Kalan supinatı atın. Ardından, plakayı manyetik standdan çıkarın. Önceden hazırlanmış karışımdan 23 mikrolitre ekleyin.Karıştırdıktan sonra plakayı kapatın ve santrifüjlemeden önce beş dakika oda sıcaklığında bırakın. 21 mikrolitre sate'yi yeni bir 96 oyuklu plakaya aktardıktan sonra, her birine iki çözelti olan dört mikrolitre ET ekleyin. Santrifüjden önce plakayı iyice karıştırın ve kapatın.İkinci hibridizasyona başlamak için, yapışkan filmi çıkarın ve 25 mikrolitre kütüphaneye 50 mikrolitre NCT, bir adet 10 mikrolitre CSO ve 15 mikrolitre PCR Grade su ekleyin. Santrifüjlemeden sonra, plakayı bir termocycler'a yerleştirin ve programı çalıştırın. İki. Yeni bir 96 kuyulu plakada, önceki adımdan 20 mikrolitre evrim karıştırıldı.25 mikrolitre T-C-P-M-M ve beş mikrolitre PPC ile karıştırma ve santrifüjlemeden sonra plakayı kapatın. Daha sonra, plakayı bir termodöngüleyiciye yerleştirin ve ertesi gün üçüncü programı çalıştırın, plakayı santrifüjleyin ve boncukları etanol ile yıkayın. Plakayı manyetik standdan çıkarın ve 30 mikrolitre RSB tamponu ekleyin.Plakayı karıştırın ve iki dakika inkübe edin. Oda sıcaklığında, 96 oyuklu plakayı manyetik standın üzerine yerleştirin ve beş dakika veya S süpernatanı tamamen berrak görünene kadar inkübe edin. Snat'ın 28 mikrolitresini yavaşça 96 oyuklu yeni bir plakaya aktarın.Son adım, bir parça analizörü veya QPCR kullanarak kitaplığın kalitesini belirlemektir. Çalışma sırasında, küme yoğunluğu milimetre kare başına 801.000 K arasında olmalıdır. Farklı görüntüler düşük yoğunluk, yüksek yoğunluk ve mükemmel yoğunluğa karşılık gelir.Bu teknoloji ile elde edilen sonuçların, biyoinformatik kullanılarak nokta veya indel mutasyonları olarak yorumlanması çok kolaydır. Baz değişikliği belirtilir ve silinen veya eklenen sıra doğrudan tanımlanır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa üç günden daha kısa sürede yapılabilir.

gdna-enrichment-transposase-based-technology-for-ngs-analysis-whole

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Memeli Hücrelerde DNA çift iplikli Break (DSB) Tamir Analizi

Tarafsız bir yaklaşım kullanarak karsinogenez bilinmeyen sürücüsü tespit için bir yöntem tarif edilmektedir. Yöntem...

Tanımlanması<em&gt; Sleeping Beauty</emLinker-aracılı PCR kullanarak Solid Tümörlerde&gt; Transposon Eklemeler

Onkoloji örneklerinin hedeflenen yeni nesil dizilimi için entegre bir sistem tanımlanmıştır. Bu çapraz platform sistemi, düşük kaliteli ve düşük miktarlı tümör biyopsileri için optimize edilmiştir, düşük DNA girdilerini barındırır, iyi karakterize edilmiş çok varyantlı kontroller içerir ve kantitatif pre-analitik kalite kontrol önlemleriyle bilgilendirilen yeni bir varyant arayan içerir.

Düşük kaliteli ve düşük miktar Tümör Biyopsilerinde ve Islak ve kuru Bench Süreçleri Entegrasyonu Hedefli optimize eder nesil Sıralama

Transkripsiyon faktörü (TF) DNA bağlanmasını etkileyen kodlamayan genetik varyantları tanımlamak için stratejik bir plan ve protokol sunuyoruz. Genotipe bağlı TF DNA bağlanmasının elektroforetik hareketlilik kayma testi (EMSA) ve DNA afinite çökeltme testi (DAPA) analizi için ayrıntılı bir deneysel protokol sağlanmıştır.

Elektroforetik Hareketlilik Assay (EMSA) ve Shift kullanarak Fonksiyonel Olmayan kodlama Genetik Türevleri için tarama DNA afinite Yağış Deneyi (DAPA)

Bu iletişim kuralı iş akışı sistemi onarıma memeli hücrelerinde noktası mutasyonların düzenleme CRISPR/Cas9-tabanlı bir gen özetliyor. Burada, gen Indel oluşumu hedef sitesindeki ölçmek için detaylı bir follow-on deneysel stratejisi ile düzenleme bir Kombinatorik yaklaşım kullanın — özünde, yerinde mutagenesis analiz.

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

Bu el yazması mutasyonlar düşük frekans ctDNA, ER-Seq. algılamak için bir teknik anlatılmaktadır Bu yöntem iki yönlü hata düzeltmesi, özel arka plan filtre ve verimli moleküler acquirement eşsiz kullanımı tarafından ayrıştırılan.

Sonraki nesil sıralama kullanarak CtDNA nadir mutasyonların tespiti

BRCA1 mutasyonu olan kişilerin kansere yakalanma riski daha yüksektir, bu da BRCA1 varyantlarının işlevinin doğru bir şekilde değerlendirilmesini garanti eder. Burada, brca1 varyantlarının canlı hücrelerde hedeflenen C:G ila T:A dönüşümünü sağlayan CRISPR aracılı sitozin baz editörleri kullanılarak işlevsel olarak değerlendirilmesi için bir protokol açıkladık.

CRISPR Aracılı Temel Editörler kullanılarak BRCA1 varyantlarının fonksiyonel değerlendirmesi

Bu makalede immünostaining ve kromatin immünödeksiasyonunun temel adımları tanıtılmaktadır. Bu protokoller genellikle DNA hasarına bağlı hücresel süreçleri incelemek ve DNA onarımına karışan proteinlerin alımını görselleştirmek ve ölçmek için kullanılır.

Endononülaz Bazlı Meydana Özgü DNA Hasarlarını Görselleştirme ve Ölçme

Burada sunulan sgRNA / CAS9 endonükleaz ve CD4 promotörünün yakınındaki çift iplikçik kopması onarımı ile ilişkili mutasyonları tanımlamak için kullanılabilecek yeni nesil dizileme protokolüdür.

CD4 promotörünün yakınında CAS9 kaynaklı çift iplikçik kopmasının onarımıyla ilişkili mutasyonları tanımlamak için yeni nesil dizilemenin kullanılması

Bu video in situ hibridizasyon, 2 farklı genler mekansal ve zamansal ifade desen genç civciv embriyolarında görüntülenebilmekte hangi bir yöntem 2-renk tüm montaj göstermektedir. Bu yöntem başlangıçta David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham ve David Ish-Horowicz tarafından tanıtıldı.

Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

Öğrenin, transposaz teknolojisiyle 11 DNA onarım geninin tam dizisini eş zamanlı analiz etme yöntemini. Bu protokol, NGS için gDNA zenginleştirme sağlar ve genetik varyasyon tespitini hızlandırır.

Whole Sırasının NGS Analiz için bir transpozaz tabanlı Technology tarafından gDNA Zenginleştirme BRCA1 BRCA2 ve 9 Genler

Daha fazla video keşfet