Name: Histolojik ve Fonksiyonel Özellikleri: Methylnitrosourea (MNU) Retina Dejenerasyonu ve Rejenerasyon Zebra balığı -kaynaklı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Keşfedin MNU ile yetişkin Danio rerio'da retina dejenerasyonu ve rejenerasyonunu tetikleme yöntemini. Optokinetik yanıt ölçümü ve immünohistokimyasal analizlerle görsel işlev ve morfolojik değişiklikleri nicelendirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Mükemmel teknik yardımları için Monika Kilchenmann, Federica Bisignani ve Agathe Duda'ya teşekkür ederiz.

Bütün deneyler Oftalmik ve Vizyon Araştırma Derneği Vizyon Araştırma ve Oftalmoloji (ARVO) Hayvanların Kullanım Bildirimi yapıştırılır. 1. Hayvanlar <ol><li> 26.5 ° C&#39;lik bir sıcaklıkta ve 14/10 saatlik aydınlık / karanlık döngüsünde 15, su içinde standart koşullar altında, 6-12 ay arasında değişen AB (Oregon) soyunun, vahşi tip zebrafish (Br.rerio) koruyun. </li><li> Kanton Veteriner Dairesi tarafından onaylandıktan sonra hayvan deneyleri için ilgili kurumların hayvan bakım yönergeleri izleyin. </li></ol> 2. MNU Tedavi <ol><li> N-metil-N -nitrosourea (ÇUB) 150 mg / L kuru madde ihtiva eden su hazırlayın. DİKKAT! ÇUB toksiktir; Doğmamış çocuğa kanser, kalıtsal genetik hasara veya zarar görmesine neden olabilir. </li><li> , Oda sıcaklığında 60 dakika boyunca MNU ihtiva eden su içinde zebrafish inkübe edin. </li><li> Hızlı bir şekilde Zebra balığı durulayıntatlı su ve MNU olmadan yeni bir balık tankına balık koymak. Deneyler için arzu edildiği sürece, standart koşullar altında balık koruyun. </li></ol> 3. Görme Keskinliği Ölçümü <ol><li> , Optomotor sistemini başlatmak menüden &#39;test&#39; seçin ve seçenekleri ayarlayın &quot;Basit Staircase&quot;, &quot;Keskinliği (Frekans)&quot; ve &quot;Tesadüf / Ayrı&quot; 16. </li><li> Optomotor sistemi üzerinde 1 m ile yaklaşık 500 ml su ile doldurulmuş bir infüzyon şişesi takın. </li><li> Sınav odasında bir Zebra balığı yerleştirin ve infüzyon şişesi bağlayın. Optomotor sistemde muayene odasına yerleştirin. </li><li> Ölçümü başlatın ve bilgisayar ekranında gerçek zamanlı olarak göz hareketi gözlemlemek. Böylece, olumlu bir yanıt (&quot;evet&quot;) olumsuz yanıt (&quot;hayır&quot;) ise, doğru yönde ardışık sakkadlardan olarak tanımlanır istasyonu ile gözlenen benzeyen rastgele göz hareketleri temsilary ızgaralar. Zebra balığı sergi gözünde ise üç veya daha fazla sonraki optokinetik tepkiler (OKR), basın &#39;evet&#39;; değilse, basın &#39;hayır&#39;. </li><li> Menüsünden &quot;Sonuçlar&quot; başlığı altında, optokinetik uyaranın uzaysal frekansa eşik belirleyerek yazılım tarafından hesaplanmıştır görme keskinliği, ayıklayın. </li></ol> 4. Histoloji <ol><li> Etil 3-aminobenzoat metansülfonat (200-300 mg / L) bir doz aşımı zebrafish Euthanize ve gözleri enükleasyonu. </li><li> Bir kademeli alkol serisi içinde dehidre örnekleri daha sonra 12 saat boyunca 4 ° C&#39;de fosfat tamponlu tuz içerisinde% 4 paraformaldehit (PFA) (PBS) içinde bütün gözleri saptamak ve. </li><li> Parafinde örnekleri embed optik sinir başı (OSB) ile 5 mikron bölümleri kesip bir cam slaytlar monte ederek. </li><li> 4 dakika boyunca hemalum ile deparaffized parafin kesitleri Leke ve% 0.2 hidroklorik ACI, ardından damıtılmış su içinde slaytlar iki kez daldırmad ve% 0.8 amonyak. En az 10 dakika (H &amp; E) musluk suyu hemalum boyamanın geliştirilmesi sonra 3 dakika boyunca eosin ile bölümleri Leke. </li><li> Orta montaj susuz slaytlar embed ve ışık mikroskobu altında slaytlar gözlemlemek. </li></ol> 5. İmmünhistokimya <ol><li> Terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP çentik uç etiketleme (TÜNEL) <ol><li> 15 dakika boyunca, oda sıcaklığında 20 ug / ml proteinaz K ile inkübe bölümleri deparafınize edildi. Tris ile bölümlerinin üç kez yıkayın 5 dakika her biri için tuzlu su (TBS) tamponlu. </li><li> 60 dakika boyunca 37 ° C&#39;de nemlendirilmiş bir haznede 50 ul TÜNEL tepkime karışımıyla (% 10 etiketleme çözeltisi ve% 90 enzim solüsyonu) ile inkübe bölümleri. 5 dakika her biri için üç kez TBS ile yıkayın. </li><li> DAPI içeren yerleştirme ortamı ile slaytlar takın ve flöresanlı mikroskop altında slaytlar izleyin. </li></ol></li><li> Prolifere Hücre Nükleer Antijen (PCNA) boyama <ol><li> 3 dakika boyunca antijen geri alma tamponu (Tris-EDTA +% 0.05 Tween 20, pH 9.0) içinde deparafinize edilmiş kesitlerin kaynatılır ve 5 dakika her biri için üç kez TBS ile yıkayın. 100 ul, 1 saat boyunca oda sıcaklığında çözeltisi (TBS +% 10 normal keçi serumu +% 1 sığır serum albümini, pH 7.6) ile bloke ile bloklayın. </li><li> Gece boyunca 4 ° C&#39;de nemlendirilmiş bir haznede 200 seyreltme: 1 anti-PCNA primer antikorlar ile Leke. 5 dakika her biri için TBS + Tween 20 ile üç kez yıkayın. </li><li> 1 saat boyunca oda sıcaklığında 500 seyreltme: 1 uygun sekonder antikor ile algılamayı bitirin. </li><li> DAPI içeren yerleştirme ortamı ile slaytlar takın ve flöresanlı mikroskop altında slaytlar izleyin. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+age-related+macular+degeneration%3A+a+review+of+progress+to+date%5BTitle%5D)+AND+%22Surv.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date.</a> Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).</li>
<li>Bhatti, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa%2C+pigmentary+retinopathies%2C+and+neurologic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Neurol.+Neurosci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa, pigmentary retinopathies, and neurologic diseases.</a> Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 6 (5), 403-413 (2006).</li>
<li>Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa.</a> Lancet. 368, 1795-1809 (2006).</li>
<li>Tsubura, A., Yoshizawa, K., Kuwata, M., Uehara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+retinitis+pigmentosa+induced+by+MNU%3B+disease+progression%2C+mechanisms+and+therapeutic+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Animal models for retinitis pigmentosa induced by MNU; disease progression, mechanisms and therapeutic trials.</a> Histol. Histopathol. 25, 233-248 (2010).</li>
<li>Machida, K., Urano, K., Yoshimura, M., Tsutsumi, H., Nomura,, Usui, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinogenic+comparative+study+on+rasH2+mice+produced+by+two+breeding+facilities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Carcinogenic comparative study on rasH2 mice produced by two breeding facilities.</a> J. Toxicol. Sci. 33, 493-501 (2008).</li>
<li>Morton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Methyl-N-Nitrosourea+%28MNU%29%3A+A+positive+control+chemical+for+p53%2B%2F-+mouse+carcinogenicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Pathol%22%5BJournal%5D)">N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU): A positive control chemical for p53+/- mouse carcinogenicity studies.</a> Toxicol. Pathol. 36, 926-931 (2008).</li>
<li>Terracini, B., Testa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinogenicity+of+a+single+administration+of+N-nitrosomethylurea%3A+a+comparison+between+newborn+and+5-week-old+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Carcinogenicity of a single administration of N-nitrosomethylurea: a comparison between newborn and 5-week-old mice and rats.</a> 24, 588-598 (1970).</li>
<li>Zulliger, R., Lecaudé, S., Eigeldinger-Berthou, S., Wolf-Schnurrbusch, U. E. K., Enzmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-3-independent+photoreceptor+degeneration+by+N-methyl-N-nitrosourea+%28MNU%29+induces+morphological+and+functional+changes+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Caspase-3-independent photoreceptor degeneration by N-methyl-N-nitrosourea (MNU) induces morphological and functional changes in the mouse retina.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249, 859-869 (2011).</li>
<li>Tappeiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+rod+regeneration+in+a+novel+zebrafish+retinal+degeneration+model+using+N-methyl-N-nitrosourea+%28MNU%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Characteristics of rod regeneration in a novel zebrafish retinal degeneration model using N-methyl-N-nitrosourea (MNU).</a> PLOS One. 12, (2013).</li>
<li>Bilotta, J., Saszik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model visual system.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 19, 621-629 (2001).</li>
<li>Fleisch, C., Neuhauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+Behavior+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Visual Behavior in Zebrafish.</a> Zebrafish. 3, 191-201 (2006).</li>
<li>Hodel, C., Neuhauss, S. C. F., Biehmaier, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+and+development+of+light+adaptation+processes+in+the+outer+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22InterScience%22%5BJournal%5D)">Time course and development of light adaptation processes in the outer zebrafish retina.</a> InterScience. 288, 653-662 (2006).</li>
<li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).</li>
<li>Brockerhoff, S. E., Fadool, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+photoreceptor+degeneration+and+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Genetics of photoreceptor degeneration and regeneration in zebrafish.</a> Cell Mol. Life Sci. 68, 651-659 (2011).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+M+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%22">Zebrafish: A Practical Approach</a>. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , IRL Press. 7-38 (2002).</li>
<li>Tappeiner, C., Gerber, S., Enzmann, V., Balmer, J., Jazwinska, A., Tschopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+acuity+and+contrast+sensitivity+of+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Zool%22%5BJournal%5D)">Visual acuity and contrast sensitivity of adult zebrafish.</a> Front. Zool. 9 (1), 10(2012).</li>
<li>Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibitor+of+phagocytosis%2C+O-phospho-L-serine%2C+suppresses+M%C3%BCller+glia+proliferation+and+cone+cell+regeneration+in+the+light-damaged+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina.</a> Exp. Eye Res. 91, 601-612 (2010).</li>
<li>Nelson, C. M., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glia+as+a+source+of+neuronal+progenitor+cells+to+regenerate+the+damaged+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Müller glia as a source of neuronal progenitor cells to regenerate the damaged zebrafish retina.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 723, 425-430 (2012).</li>
<li>Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantification+of+adult+and+developing+mouse+spatial+vision+using+a+virtual+optomotor+system%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system.</a> Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 45 (12), 4611-4616 (2004).</li>
<li>Beck, J. C., Gilland, E., Tank, D. W., Baker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+ontogeny+of+optokinetic+and+vestibulo-ocular+behaviors+in+zebrafish%2C+medaka%2C+and+goldfish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Quantifying the ontogeny of optokinetic and vestibulo-ocular behaviors in zebrafish, medaka, and goldfish.</a> J. Neurophysiol. 92 (6), 3546-3561 (2004).</li>
<li>Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Inner+Retinal+Neurons+after+Intravitreal+Injection+of+Ouabain+in%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Inner Retinal Neurons after Intravitreal Injection of Ouabain in.</a> Zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).</li>
<li>Sherpa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglion+cell+regeneration+following+whole-retina+destruction+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. 68, 166-181 (2008).</li>
<li>Yurco, P., Cameron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+M%C3%BCller+glia+to+retinal+injury+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish.</a> Vision Res. 45, 991-1002 (2005).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Daha önce, bizim grup Zebrafish sistemine 9 içine kemirgenler fotoreseptör dejenerasyonu MNU modelini transfer etti. Takip eden olaylar anlatılmış ve 30 güne kadar takip edildi. Bu süre içinde tam retina morfolojik dejenerasyon ve rejenerasyon ilk tedaviden sonra meydana geldi. İlk olarak, histoloji azalmış bir çubuk hücre Buna 8. günde en az on gün 3 saymak ortaya, TUNEL boyama 3 gün MNU tedaviden sonra çubuk fotoreseptör apoptozisini tanımlar. Rejenerasyon Prolifere eden hücreler, bu çoğalması artmıştır INL...

Vizyon insan için en önemli duyu ve değer düşüklüğü, yüksek sosyo-ekonomik etkisi vardır. Gelişmiş dünyada, retina dejeneratif hastalıklar yaşlı yetişkinler 1 arasında görme kaybı ve körlük önde gelen nedenidir. En dejeneratif retina hastalıklarının nedeni kısmen anlaşılır ve tedavi çözümleri kayıp vizyon kazanmak için çok sınırlı. Retinitis pigmentosa N -nitrosourea (ÇUB), retinal dejenerasyon meydana metiltio, primer fotoreseptör kaybı 2-3. N retinal dejeneratif bir hastalığın tipik bir örneğidir ve bu nedenle yaygın primer fotoreseptör hücre ölümü ile 4 hastalıkların modellemek için kemirgenlerde kullanılır. Bu bir alkilleyici madde ve genellikle 5-7 maruz bir kaç ay sonra görünür huylu ve kötü huylu tümörler, yol açar. Buna ek olarak, kısa süreli bir gözlem süresi içinde özel bir fotoreseptör hücre ölümüne neden olur. Böylece, retina tabaka Yapıdaki kaybıre ve anlamlı bir retina incelmesi konsantrasyona bağlı bir şekilde tespit edilmiştir. Retina glia hücreleri aktive edildi, ancak retina pigment epiteli (RPE) hiçbir değişiklik bulundu. Endoplazmik retikulum (ER), stres ile ilgili apoptoz retinada 8 ÇUB etkisinin en temel bir yol olarak görünmektedir. Biz son zamanlarda Zebrafish 9 fotoreseptör dejenerasyonu ikna etmek için bir kimyasal model olarak MNU girmiştik. Diğer nedenler arasında, Zebra balığı (Br.rerio) çünkü diğer omurgalıların 10 o kendi görsel sistemin benzerlikler görsel araştırma önemli hale gelmiştir. Dış retina ultraviyole, kısa, orta tepe hassasiyetleri ve görünür spektrumu uzun dalga boyu ve bir çubuk fotoreseptör türüyle dört farklı koni gruba ayrılabilir olabilir fotoreseptörleri içerir. Iç nükleer tabaka (INL) olarak, bipolar, yatay ve amacrine internöron hücre gövdeleri, wel olarak bulunurlarMuller, glia hücreleri, hücre soma olarak L.. Dış pleksiform katman (OPL) içinde fotoreseptör ve iç retina arasındaki sinaptik iletişim lensin en yakın hücre tabakası ise optik sinir ve optik sistemini içeren uzun aksonlar oluşturan bileşenler ve ganglion hücre tabakası (GC) olan oluşturulmaktadır . Salgı bezleri ve iç nükleer tabakadaki hücrelerin arasında olduğu, sinaptik temasların olarak iç pleksiform tabakasındaki (IPL) 11 oluşur. RPE nörosensöriyel retina dışında yer alır ve uzun apikal mikrovilluslu 12 ile fotoreseptör dış segmentleri çevreler. Ayrıca, Zebrafish yüksek rejeneratif ve lezyonlu beyin, retina, omurilik, kalp ve diğer dokuları 13 yetiştirmeleri için yapabiliyor. Retinal hasar oluştuğunda, Muller hücreleri olduğu düşünülmektedir INL hücreleri, aktive edilmiş ve çeşitli retinal hücre tipleri içine ayırt etmek için bir potansiyele sahiptir. Buna ek olarak, aynı zamanda ONL bulunan çubuk progenitörlerle üretir. Başka bir nedenleYeni hücreler ile yetişkin zebrafish retina malzemeleri urce siliyer marjinal bölgesidir. Bu kaynak, sürekli olarak büyüyen Zebrafish göz 14 çubuk fotoreseptör sabit bir yoğunluğu elde etmek için gereklidir. ÇUB modeli retina dokusu için basit ve tekrarlanabilir bir dejenerasyon / yenilenmesi yaklaşımı olarak da kullanılabilir. Nedeniyle Zebra balığı biyolojik süreçler bazı benzerlikleri ve insanlarda bu ilgili hücre ölümü yolları belirlemek için kapıları açmak ve potansiyel nöroprotektif ilaç ekrana. Bizim gruptan bir önceki çalışmaya göre, biz şimdi retina de- ve laboratuvar videoları 9 uygun fonksiyonel değişiklikler dahil olmak üzere izleyen rejenerasyon bu MNU kaynaklı zebrabalıkları modelinin yöntemlerini göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>Asetik asit</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, İsviçre</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Amonyak</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, İsviçre</td><td>294993</td><td>%0.80</td></tr> <tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, İsviçre</td><td>05470</td><td></td></tr><tr><td>Dako Pen</td><td>Dako, Glostrup, Danimarka</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>DAPI montaj ortamı</td><td>Vector Labs, Burlingame, CA, ABD</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, İsviçre</td><td>45260</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, İsviçre</td><td>2860</td><td>%100, %96, %70</td></tr> <tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, İsviçre</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, İsviçre</td><td>E10521</td><td>Trikain</td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, İsviçre</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan Alexa 594</td><td>Life Technologies, Zug, İsviçre&nbsp;</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Keçi normal serumu</td><td>Dako, Glostrup, Danimarka</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, İsviçre</td><td>320331</td><td>%0.20</td></tr> <tr><td>Yerinde Hücre Ölümü Tespit Kiti</td><td>Roche Uygulamalı Bilimler, Rotkreuz, İsviçre</td><td>11684795910</td><td>TUNEL Kiti</td></tr><tr><td>Mayer'in hemalum solüsyonu</td><td>Merck, Darmstadt, Almanya</td><td>109249</td><td></td></tr><tr><td>Metilnitrosourea (MNU)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, İsviçre</td><td>N4766</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>OptoMotry</td><td>SerebralMekanik, Lethbridge, AB, Kanada</td><td>n.a.Paraformaldehit</td><td></td></tr> <tr><td>(PFA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, İsviçre</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, İsviçre</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Dako, Glostrup, Danimarka</td><td>S3004</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-PCNA&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji, Santa Cruz, ABD</td><td>SC-33756</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus cam kaydıraklar</td><td>Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Almanya</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>Tris tamponlu salin (TBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, İsviçre</td><td>P5912</td><td></td></tr><tr><td>Trizma tabanı</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, İsviçre</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, İsviçre</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, İsviçre</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Zebra balığı (Danio rerio) AB (Oregon) türü</td><td>Fribourg Üniversitesi, Biyoloji Bölümü</td><td>n.a.Kendi</td> <td>balık tesisi</td></tr></tbody></table>

histolojik ve fonksiyonel Özellikleri: methylnitrosourea (mnu) retina dejenerasyonu ve rejenerasyon zebra balığı -kaynaklı

Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Endüstriyel dünyada görme kaybının çoğunluğu için fotoreseptör hasar hesabı ile sonuçlanan retina dejeneratif hastalıklar, örneğin retinitis pigmentosa,. Hayvan modelleri, bu tür hastalıkları incelemek için temel bir öneme sahiptir. Bu bağlamda, N-metil-N -nitrosourea (ÇUB) yaygın olarak kemirgenlerde kullanılmıştır fotoreseptör spesifik toksin farmasötik olarak retina dejenerasyonuna tetiklemek için karıştırılabilir. Daha önce, Zebra balığı bir MNU kaynaklı retina dejenerasyonu modeli, görsel araştırmalar başka popüler model sistem kurduk. Memelilere büyüleyici bir fark yetişkin zebrabalıkları retina ve hasar sonra rejenerasyon kalıcı nöron olduğunu. Biz yetişkin zebrabalıkları görme keskinliği ölçümleri istihdam var bu gözlemi ölçmek için. Böylece, optokinetik refleks olmayan anestezi balık fonksiyonel değişiklikleri izlemek için kullanılmıştır. Bu immünhistokimyasal staini yanı sıra histoloji ile takviye edildiapoptosis için ng (TÜNEL) ve çoğalması (PCNA) gelişmekte morfolojik değişiklikler ilişkilendirmek için. Özet olarak, fotoreseptör apoptoz üç gün dış çekirdek katmanında (ONL) hücrelerin belirgin bir azalma izler ÇUB tedaviden sonra ortaya çıkar. Bundan sonra, iç nükleer tabaka (INL) ve onl hücre çoğalması gözlenmiştir. Burada, bir tam histolojik kalmaz, aynı zamanda etkin bir yenilenmesi, 30 günlük bir süre boyunca oluşturduğunu ortaya koymuştur. Şimdi ölçmek ve video formatında MNU kullanarak Zebra balığı retina DE- ve yenilenmesini takip yöntemleri açıklamaktadır.

Görme keskinliği: Deneysel set-up [mekansal frekans: 0.042 daireler / derecesi (c / d); kontrast: 100%; sürüklenme hızı: 20 derece / saniye (d / src); arka ışık parlaklık: 152 cd / m 2] Bu çalışmada, yetişkin zebrabalıkları OKR değerlendirmesini sağladı. Iyi prosedürü tolere her zebrabalıkları, 10 dakika - VA ölçüm süresi ortalama yaklaşık 5 oldu. MNU maruz önce görme keskinliği 0.577 ± 0.014 devir / derece (c / d) idi. 1 150 mg / L MNU'nun uygulamasından sonra gö...

Bu yazıda retina de- ve rejenerasyon ve yetişkin zebrabalıkları N-metil-N -nitrosourea kullanarak görme fonksiyonu üzerindeki etkisinin ölçümü göstermektedir. Görme keskinliği kaybı ve azalmış fotoreseptör numaraları iç nükleer tabakada çoğalması ile takip edildi. Komple morfolojik ve fonksiyonel rejenerasyon 30 gün ilk tedaviden sonra meydana geldi.

Histolojik ve Fonksiyonel Özellikleri: Methylnitrosourea (MNU) Retina Dejenerasyonu ve Rejenerasyon Zebra balığı -kaynaklı

Retinal degenerative diseases, e.g. retinitis pigmentosa, with resulting photoreceptor damage account for the majority of vision loss in the industrial ...

Bu prosedürün genel amacı, n metil ve nitro ueaa kullanarak yetişkin zebra balığında retina dejenerasyonunu ve ardından gelen rejenerasyonu indüklemektir. Bu, ilk olarak yabani tip zebra balığının N metil, N azot üre veya MNU içeren suda kuluçkaya yatırılmasıyla gerçekleştirilir. Bir sonraki görme fonksiyonu, optokinetik yanıtın veya OKR'nin ölçülmesi ve farklı zaman noktalarında görme keskinliğinin hesaplanmasıyla ölçülür.Tedavi sonrası, zebra balığı ötenazi yapılır ve retina dokusundaki morfolojik değişiklikleri gözlemlemek için h ve e boyama kullanılarak histolojik incelemeler için gözler çekirdeklenir. Son olarak, hücre ölümü ve proliferasyonu için spesifik boyama ile retinada hücresel değişiklikler görselleştirilir. Sonuç olarak, görme keskinliğinin ölçülmesi ve morfolojik ve hücresel değişikliklerin ölçülmesi, retina D ve rejenerasyonu görselleştirmek için kullanılır.Bu farmakolojik modelin temel avantajı, kullanımının basit ve hızlı olması ve yetişkin zebra balıklarında güvenilir bölgesel dejenerasyon ve rejenerasyona neden olmasıdır: NM, metil, n, nitroso, üre veya MNU muamelesini gerçekleştirmek için, litre başına 150 miligram kuru MNU içeren su hazırlayarak başlayın. Nm metil ve nitröz üre ile çalışırken dikkatli olun, çünkü toksiktir ve kansere, kalıtsal genetik hasara veya zarara neden olabilir. Doğmamış bir çocuk, AB tipi suşu iken, zebra balığı standart koşullar altında altı ila 12 aylık.Zebra balığını MNU suyuna aktarın ve oda sıcaklığında 60 dakika kuluçkaya yatırın. Ardından, balıkları MNU içermeyen yeni bir akvaryuma aktarmadan önce hızlı bir şekilde durulamak için tatlı su kullanın. Balıkları, deneyler için istenildiği kadar standart koşullar altında tutun.Motor sistemini başlatarak görme keskinliği ölçümleri yapmaya hazırlanın. Ardından menüden testi seçin ve seçenekleri basit merdiven olarak ayarlayın. Motor sisteminin yaklaşık bir metre yukarısına 500 mililitre su ile doldurulmuş bir infüzyon şişesi takın.Bir zebra balığını muayene odasına yerleştirin ve infüzyon şişesine bağlayın. Ardından muayene odasını otomotiv sistemine yerleştirin. Ardından, ölçümü başlatın ve bilgisayar ekranında gerçek zamanlı olarak göz hareketini gözlemleyin.Olumlu bir yanıt veya evet, doğru yönde ardışık saniyeler olarak tanımlanırken, olumsuz bir yanıt veya hayır, sabit ızgaralarda gözlemlenenlere benzer rastgele göz hareketlerini temsil eder. Zebra balığının gözleri üç veya daha fazla ardışık optokinetik tepki veya OKR sergiliyorsa, evet'e basın. Değilse, hayır'a basın.Menüdeki sonuçlar altında, histolojik analiz yapmak için optik kinetik uyaranın uzamsal frekansının eşiğini belirleyerek yazılım tarafından hesaplanan görme keskinliğini çıkarın. Zebra balığını metin protokolüne göre ötenazi yaptıktan ve çekirdeklendirdikten sonra, gözler, numuneleri kurutmak için dereceli bir alkol serisi kullanmadan önce sağlam gözleri 12 saat boyunca dört santigrat derecede sabitlemek için PBS'de% 4 formaldehit gücü kullanır, numuneleri parafine gömer, daha sonra optik sinir başı veya ONH'den beş mikrometre kesiti kesin ve bunları cam slaytlara monte edin. Ardından, slaytları iki kez damıtılmış suya batırmadan önce karbondan arındırılmış bölümleri beş dakika boyunca boyamak için Alam'ı kullanın, ardından %0,2 hidroklorik asit ve %0,8 amonyak ekleyin.Slaytları en az 10 dakika musluk suyuna koyun. Slaytları bir etanol serisi ile yıkadıktan ve dehidre ettikten sonra bölümleri üç dakika boyunca eozine aktarın. Bunları gömmek için montaj ortamı ve terminal, oksi nükleotid transferaz, DUPT Nick n etiketleme veya tünel için numuneleri gözlemlemek için bir ışık mikroskobu kullanın.De parize bölümlerine mililitre pronaz K başına 20 mikrogram ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Bölümleri beş dakika boyunca üç kez yıkamak için tris tamponlu salin kullandıktan sonra, bölümlere 50 mikrolitre tünel reaksiyon karışımı ekleyin ve bunları 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir odada 60 dakika inkübe edin. Numuneler yıkandıktan ve her biri beş dakika boyunca üç kez denendikten sonra, proliferatif hücre nükleer antijeni veya PCNA boyaması gerçekleştirmek için slaytları önlerine bir floresan mikroskop altında monte etmek için dappy içeren montaj ortamı kullanın.Numuneleri antijen alımına yerleştirin, tamponlayın ve bloke edici tampon kullanarak her saat beş dakika boyunca TB S3'te yıkamadan önce üç dakika kaynatın, numuneleri oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Daha sonra bir ila 200 anti-PC NA seyreltimi ile. Birincil antikorlar, numuneleri TBS artı ile her biri beş dakika boyunca 23 kez yıkadıktan sonra dört santigrat derecede gece boyunca nemlendirilmiş bir odada inkübe edin. Numuneleri oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe etmek için bir ila 500 oranında ikincil antikor seyreltmesi kullanın.Slaytlar dpi içeren montaj ortamı ile monte edildikten sonra, bunları floresan mikroskobu altında gözlemleyin. Bu şekil, litre başına 150 mikrogram MNU uygulandıktan sonra yetişkin zebra balığı için görme keskinliği seyrini göstermektedir. Birinci günden başlayarak, ölçümler, değerlerde bir artıştan önce üçüncü günde minimum değerlere ulaşan görme keskinliğinde belirgin bir azalma olduğunu ortaya koydu.Sekizinci günde ilerledi ve zebra balığı gözü retina dejenerasyonunun histolojik analizinde görüldüğü gibi 30. günde tam bir iyileşmeye ulaştı, MNU tedavisinden sonra 30 gün boyunca takip edildi, üçüncü günden itibaren ONL'nin boşluk oluşumu ile INL'nin bozulmasını içeriyordu ve sekizinci günde duyusal retinanın çeşitli katmanlarında pozitif tünel boyaması yoluyla gözlenen maksimum Rod ONL kaybı ile. MNU tedavisinden sonra retina dejenerasyonunun, üçüncü günde ONL'de bulunan tünel pozitif hücrelerin çoğunluğu ile apoptozdan kaynaklandığı gözlendi. Bununla birlikte, ölmekte olan hücreler de aynı zaman noktasında INL'de görüldü.Bu videoyu izledikten sonra, yetişkin zebra balıklarında retina dejenerasyonunun m ve u tedavisi kullanılarak nasıl indükleneceğinin yanı sıra OKR ölçümü ve immünohistokimyasal prosedürler kullanılarak fonksiyonel ve morfolojik değişikliklerin nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

methylnitrosourea-mnu-induced-retinal-degeneration-regeneration

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Çoklu ışık zarar protokolleri zarar fotoreseptör tarif ve dolayısıyla yetişkin zebrafish bir retina rejenerasyon tepki neden olmuştur. Bu protokol, pigmentli hayvanlarda kullanılabilen geliştirilmiş bir yöntem açıklanır ve bu çubuk ve tüm retinada arasında koni fotoreseptörlerin büyük çoğunluğu zarar verir.

Yetişkin Zebra balığı Retina Rejenerasyon Çalışmaları Kullanım için Yeni Bir Işık Hasar Paradigma

Nörolojik ve non-nörolojik hastalıkların çok zebra balığı model yetişkin balık ziyade embriyo / larva incelenir için, erişkin zebrabalıkları hastalık modellerinde uygulanabilen bir nicel yan hat rejeneratif deneyi geliştirilmiştir. Deney 1) neuromast ve 2) tek tek saç hücre düzeyde çözünürlüğü dahil.

Yetişkin Zebra balığı Lateral Hat Rejenerasyon için bir Deneyi

Zebra balığı yetişkin böbrek böbrek yenilenmesi ve hastalık çalışmalar için mükemmel bir sistemdir. Böyle bir araştırmanın önemli bir yönü nefron yapısı ve fonksiyonu değerlendirmesidir. Bu protokol nefron borucuk kompozisyonunun ve böbrek geri emiliminin değerlendirilmesi için uygulanabilecek çeşitli yöntemler anlatılmaktadır.

Yetişkin Zebra balığı Böbrek Nefron Kompozisyon ve Fonksiyon Analizi

Zebra balığı safra güdümlü karaciğer rejenerasyonunun altında yatan moleküler mekanizmaları değerlendirmeye yardımcı olmak için, nitroredüktaz eksprese eden hepatositlerin metronidazol tedavisi üzerine genetik olarak ablasyon edildiği bir karaciğer hasarı modeli oluşturduk.  Bu protokolde, hepatosit ablasyonunun ve biliyer güdümlü karaciğer rejenerasyonunun nasıl ustaca manipüle edileceğini, izleneceğini ve analiz edileceğini açıklıyoruz.

Biliyer odaklı Karaciğer Rejenerasyon Eğitim Zebra balığı hepatosite özgü Ablasyon

teratojen Pozlama doğum kusurlarına neden olabilir. Balığı kimyasal teratojenik potansiyeli belirlemek için faydalıdır. Biz maruz kalma farklı zamanlarda da nitrit değişik düzeylerde embriyoların açığa tarafından zebrabalıkları yararını göstermektedir. Biz nitrit toksik ve ağır gelişimsel bozukluklara neden olduğunu göstermektedir.

Bir Model Olarak Zebra balığı Nitrit teratojenik potansiyelini değerlendirmek için

Zebra balığı retina rejenerasyon çoğunlukla sabit retina kullanılarak incelenmiştir. Ancak, bu tür interkinetic nükleer göç gibi dinamik süreçler rejeneratif tepki sırasında meydana gelen ve altında yatan mekanizmaları araştırmak için canlı hücre görüntüleme gerektirir. Burada, biz multiphoton mikroskopi kullanılarak Interkinetic Nükleer Göç (INM) gerçek zamanlı olarak izlemek için kültür ve görüntüleme koşulları açıklar.

Multiphoton Mikroskopi Canlı hücre Görüntüleme için Yetişkin Transgenik Zebra balığı Retina Eksplantlarından Kültür

Zebra balığı retina dejenerasyonu/rejenerasyon omurgalılarda mekanizmaları incelemek için popüler bir hayvan modelidir. Bu iletişim kuralı yerelleştirilmiş yaralanma dış retina iç retina en az hasar ile kesintiye neden yöntemi açıklanır. Daha sonra in vivo retina morfoloji ve Müller glia yanıt retina yeniden oluşturma işlemi boyunca izliyoruz.

Bir lazer kaynaklı retina dejenerasyonu, Zebra balığı rejenerasyon modelini Müller Glia hücre aktivasyonu

Bu protokol, transgenik zebra balığı modeli kullanarak retinal pigment epitelini (RPE) genetik olarak ablate etme metodolojisini açıklamaktadır. Farmakolojik bileşikler kullanarak sinyal yolu modülasyonunu içerecek şekilde protokolün uyarlanması kapsamlı bir şekilde detaylandırılmıştır. Pigmentasyona dayalı RPE rejenerasyonunu ölçmek için bir MATLAB platformu geliştirildi ve sunuldu ve tartışıldı.

Zebra Balığı Retinal Pigment Epitelinin Rejenerasyonunu İncelemek için Nitroredüktaz / Metronidazol Aracılı Ablasyon ve Bir MATLAB Platformu (RpEGEN)

Değerlendirilmesi için yeni kök hücre tedavileri ile enjekte edilen hücrelerin in vivo takip non-invaziv önemlidir. Bu video demir oksit bazlı kontrast ajanlar ile insan mezenkimal ve embriyonik kök hücreleri, in vivo sonraki MR, in vivo olarak nasıl etiketlemek için size gösterecektir.

Demir Oksit hESC ve hMSCs Etiketleme MR Görüntüleme in vivo Takip Non-Invasive Nanopartiküller

Insanlarda akut böbrek hasarı (AKI), böbrek nefron oluşturan epitel hücrelerin zarar görmesine neden olduğu yaygın bir klinik sorundur ve AKI, yüksek ölüm oranları% 50-70 ile...

Zebra balığı Pronephros Lazer Ablasyon Böbrek Epitel Rejenerasyon Eğitim

Keşfedin MNU ile yetişkin Danio rerio'da retina dejenerasyonu ve rejenerasyonunu tetikleme yöntemini. Optokinetik yanıt ölçümü ve immünohistokimyasal analizlerle görsel işlev ve morfolojik değişiklikleri nicelendirin.

Histolojik ve Fonksiyonel Özellikleri: Methylnitrosourea (MNU) Retina Dejenerasyonu ve Rejenerasyon Zebra balığı -kaynaklı

Daha fazla video keşfet