Name: Membran Protein Gerçek zamanlı ölçümler: Reseptör Etkileşimleri Yüzey Plazmon Rezonans Kullanma (SPR) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Öğrenin membran protein reseptör etkileşimlerini gerçek zamanlı ölçmek için yüzey plazmon rezonans (SPR) kullanmayı. Bu etiketsiz yöntem, bağlanma afinitesi ve kinetik verileri sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Lewinson laboratuvarındaki araştırmalar, İsrail Bilim Akademisi, Rappaport Biyomedikal Araştırma Enstitüsü, Meriuex Araştırma Vakfı ve Marie Curie kariyer yeniden entegrasyon hibesi (OL) tarafından sağlanan hibelerle desteklenmektedir. EV, Fine bursu ve Technion Tıp Fakültesi tarafından desteklenmektedir. NLL, İsrail Bilim Akademisi'nden alınan hibelerle desteklenmektedir.

1. Protein Numune Hazırlama ve Tampon <ol><li> Numune hazırlama: ilgi konusu proteinleri saflaştırmak ve bir jel filtrasyon kolonu üzerine ya da ultra-santrifüj ile deney öncesinde proteini enjekte edilerek, tüm gruplar kaldırılır emin olun (100,000 x g yeterlidir genellikle 10 dak). NOT: arzu edilen, yüksek ölçüde saf protein preparatları bir zorunluluk olmamakla birlikte,. SPR başarıyla az-daha-mükemmel arındırmalardan ve hatta toplam özü 8,9 ile kullanılmıştır. </li><li> Tampon hazırlama: <ol><li> (&quot;Tampon çalışan&quot; olarak adlandırılan, veya RB) deney tampon hazırlayın. Protokol, burada açıklandığı için, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl ve% 0.05 (ağırlık / hacim) DDM (n-Dodesil β-D-maltozit) kullanın. Tampon bileşiminin seçimi kolayca çalışılan sisteme göre modifiye edilebilir unutmayın. </li><li> 0.22 mikron filtreleri kullanarak tüm tamponları ve protein örnekleri Filtre. Filtreler protein olduğundan önceden emin olunUyumlu. Genel olarak, son zamanlarda pazara SPR platformlar bir in-line de-gasser ihtiva eder; Bu durumda, de-gaz değilse önce tamponlar kullanın. </li><li> Gecede Dialyze veya tampon uyuşmazlıklarını önlemek için RB karşı örnekleri sulandırmak. Yüksek viskozite kimyasal kullanıldığında Diyaliz (ya da tampon alışverişi başka bir yöntemle), özellikle tavsiye edilmektedir (örneğin, sükroz, gliserol, DMSO). Pompa girişine RB şişe bağlamadan önce ayrı bir tüp içinde bir kenara RB 10 ml tutmak. </li></ol></li><li> 20 ug / ml olan bir son konsantrasyona kadar RB içine konsantre bağ stokunu. Yüksek konsantrasyonlarda, yüksek akış ve kısa enjeksiyon aksine kural olarak, istikrarlı ligand Hareketsizleştirmesi için, düşük debide daha uzun enjeksiyonları ile düşük ligand konsantrasyonları kullanın. </li><li> Istenen konsantrasyona RB içine analit sulandırmak. Tipik haliyle, on misli seyreltmeler 10 nM ile 10 uM bilinmeyen afinite bir sistem için konsantrasyonlarının aralığı test edin. Her zaman başlayacakbirinci alt konsantrasyonlar mevcut olabilir. </li></ol> 2. Sensör Çip <ol><li> Çip seçme a nitrilotriasetik asit (NTA), bir oligo-histidin etiketi olan proteinleri tutulması için müsait bağlanmış çip kullanın. </li><li> Çip kullanımı: <ol><li> Yeni bir çip kullanırken, kılıfından çipi çıkarmak çift distile su (DDW) ile hafifçe yıkayın, hassas silecekler kullanılarak dikkatlice kalan sıvıları kapalı kuru ve altın tabakası yüzeyine dokunmamaya dikkat edin. (Çip düzgün yerleştirildiğinde ekleme pürüzsüz) doğru yönde geri kılıf içine çip yerleştirin. </li><li> Bir çip yeniden yaparken, tampon saklanan çip almak, yukarıda belirtildiği gibi yavaşça DDW ve kuru ile iyice durulayın ve orijinal kılıf içine yerleştirin. NOT: çip üzerinde spesifik olmayan önemsiz malzeme birikimi onun &#39;canlılığı&#39; etkileyebilir. Bu ligand hareketsizleştirme ve sonrası sıyırma önce RUs karşılaştırarak izlenebilir. Birçok ölçümler olabilir rağmenAynı Ninta çip kullanılarak yapılır, onun uzun ömürlü sorunu &#39;kesin&#39; değildir ve farklı yongaları arasında büyük ölçüde değişir. </li></ol></li><li> Çip yerleştirme: sensör çipi kapağını açın ve kılıf içinde çip yerleştirmek. Yeni bir çip kullanırken, giriş çipin seri numarası kullanım kaydını tutmak için. Kapı ve basın &#39;dok çip&#39; kapatın. </li></ol> 3. Sıcaklık Ayarları <ol><li> 25 ° C (ya da tercih deney sıcaklığı) çip hücre sıcaklığını ayarlayın. </li><li> İsteğe bağlı: deney boyunca sabit proteinleri tutmak için 7 ° C örnekleri bölme ayarlayın. </li></ol> Yükleme ve Sıyırma 4. Çözümler H2O RB (RB gibi nihai bir konsantrasyona kadar EDTA çözeltisi deterjan ekleme) RB 0.5 mM NiCl2, 350 mM EDTA,% 0.25 SDS ve H 100 mM HCI: yükleme ve sıyırma için aşağıdaki çözümleri hazırlanması 2 O. Mikro santrifüj küvet kullanıldığındaes ve belirlenen tüpler SPR, tüplerin kapaklarını kesmek unutmayın. 5. Başbakan SPR Enstrüman RB ile 6. Yeni Run Başlat <ol><li> Deney sırasında kullanılacak akış hızını ayarlayın. Burada anlatılan sonuçları elde etmek için 50 ul / dk akış ayarlayın. NOT: Bu parametre deney sırasında değiştirilebilir. </li><li> Akış yolları ve referans çıkarma tanımlayın. Burada açıklanan yolları Fc = 1 ve Fc = 2, çıkarma Fc = 2-1 set sonuçlar elde etmek için. NOT: Program gerçek zamanlı olarak ölçülen iki hücre çıkarma gösterecektir. Bu parametre deney sırasında değiştirilemez unutmayın. </li><li> Uygun numune raf seçin (örnek hacmi tüketimini etkileyebilir). </li><li> Sonuçlar dosyayı kaydedin. </li></ol> 7. Deney döngüleri Her deney döngüleri oluşur, ea yapılan enjeksiyonlar net bir kaydını tutmakch döngüsü ve ligandlar &#39;yükleme, tamponunun boş enjeksiyon, ve farklı döngüleri içine analit enjeksiyonu ayrı. <ol><li> Döngü 1: Chip hazırlama ve nikel yükleme <ol><li> 6.1 ve 6.2 adıma göre akış ve yolları ayarlanmış olduğundan emin olun. </li><li> 1 dk kalanlar yıkayacak için 350 mM EDTA enjekte. </li><li> 10 ul / dk akış ayarlayın. </li><li> 2 dakika boyunca 0.5 mM NiCl2 enjekte edilir. NOT: Şimdi çip reçine nikel iyonlarının tarafından kaplanır. </li></ol></li><li> Döngü 2: immobilizasyonunu ligandlar <ol><li> 15 ul / dk, akış yolu Fc = 2 Set akışı. </li><li> Moleküler ağırlığının 10-20 misli olan RU değerleri elde edilene kadar bir ligand enjekte edilir. Örneğin, RU 500-1,000 kadar 50 kDa&#39;lık bir ligand yükleyin. Elde RU değer bir kaydını tutun. </li><li> 15 ul / dk, akış yolu Fc = 1 Set akışı. </li><li> Ligand A. bu kontrol yardımcı on-line çıkarma sensogram (Fc = 2-1) Monitör aynı RU değerine kadar ligand B (kontrol) enjekteEnjeksiyon uzunluğu. </li><li> 50 ul / dk, akış yolu Fc = 1 ve Fc = 2 Set akışı, başlangıçta kadar 5-20 dakika yıkayın sistemi (Fc = 2-1) stabilize. </li></ol></li><li> Döngü 3: Boş enjeksiyonu. Bu enjeksiyon, bu nedenle analitin kendi dışında bir analit ile birlikte enjekte edilecek olan tüm bileşenleri içeren boş çıkarma hizmet edecektir. NOT: Enjeksiyon uzunluğu denge (sinyal yaylalar) ulaşmak için gereken süre bağlı olarak değişebilir. <ol><li> 15 ul / dk, akış yolu Fc = 1 ve Fc = 2, Fc = 2-1 çıkarma Set akışı. </li><li> 30 saniye (&#39;bekle&#39; olarak bundan sonra anılacaktır) &#39;bekle&#39; komutunu yerleştirin (istikrarlı bir temel sağlamak için). </li><li> 15 sn RB enjekte. Not: enjeksiyon süresi öncesi denge kinetik sabitler (çoğunlukla k) bağlı olarak, farklı sistemleri arasında değişir. </li><li> Ayrışma safhasının kaydetmek için 120-600 saniye. NOT: Bu adım uzunluğu göre değişir <em&gt; k d: ayrışma artık bu adımı olmalıdır yavaş. Çok yavaş ayrıştıracak kompleksleri (k d &lt;10 -4 sn -1) için, 10-15 dakika bekleyin ve sonra (daha sonra bakın) rejenerasyon yüzey geçin. </li></ol></li><li> Döngü 4: analit enjeksiyon <ol><li> Kopya / referans enjeksiyonu (döngüsü 3) bu yüzden bu iki enjeksiyonları sonra çıkartılabilir kullanılan tam koşullar yapıştırın. Analit çözümü tutan bir kontrol çözümü tutan birinden rafa yuvanın yerini değiştirin. Beklenen K D biraz üzerinde bir konsantrasyon seçin. Hiçbir ön bilgi varsa, iyi bir başlangıç ​​noktası olarak 1 mcM seçin. </li></ol></li><li> Döngü 5: Tampon enjeksiyon <ol><li> Tekrar döngüsü 3. </li></ol></li><li> Döngü 6: analit enjeksiyon <ol><li> Tekrar döngüsü 4. </li></ol></li><li> Döngü 7: Chip kapalı şerit <ol><li> 50 ul / dk akış ayarlayın. &lt;/ Li&gt; <li> 1 dakika için 350 mM EDTA enjekte edilir. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın. Bu çip zarar verebilir 3 dakika tek bir enjeksiyon kullanmayın. </li><li> 1 dakika boyunca% 0.25 SDS enjekte edilir. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın. Bu çip zarar verebilir 3 dakika tek bir enjeksiyon kullanmayın. </li><li> Taban çizgisi seviyesi ulaşılamaması halinde, ilave sıyırma aşaması olarak 1 dakika için 100 mM HCI enjekte edilir. </li><li> Bekleme moduna geçer &#39;uç koşmak&#39; komutunu yerleştirin. </li></ol></li><li> Çip depolama <ol><li> Sensör çip çıkarın ve cihazın dışarı almak. </li><li> Kendi kılıfından sensörü çıkartın yüzeyine dokunmaktan kaçının, DDW ile durulayın ve RB içeren 50 ml&#39;lik bir tüp içinde yer. 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li></ol> 8. Veri Analizi Değerlendirme Yazılımı Belirlenmiş kullanma <ol><li> Kinetik parametrelerin türetme önce SPR tarafından elde edilen ham verilerin işlenmesi için aşağıdaki adımları uygulayın. <ol><li> Değerlendirme yazılımını kullanarak, açıksonuç dosyası seçin döngüleri 3-6 Fc = 2-1 (referans verilerini çıkarılır). </li><li> Eksen kayması: <ol><li> Ekran döngüleri 3-6. </li><li> Sıfır dört eğriler için taban (her döngüsünde ilk 30 sn bekleme süresi) Y-ekseni değeri. </li></ol></li><li> Dört Eğrilerin X eksenini hizalayın. Belirgin özellikleri seçin (örneğin, enjeksiyon başlangıç ​​veya bitiş zamanları) mükemmel X-ekseni boyunca dört eğrileri hizalamak için. Sıfıra analit (veya kontrol tamponu) başladığı zamanı ayarlayın. </li></ol></li><li> Referans çıkarma <ol><li> Kullan Y-ekseninde bulunabilir eğri çıkarma işlemi menüsünü kaydırır döngüsü 6. eğriden döngüsü 4 ve döngüsü 5 eğrisinin gelen döngüsü 3 eğrisini çıkarılarak arka plan yanıtı çıkartın. NOT: Bu yüzey kırılma indeksi etkilemiş olabilir (analit ilgisiz) herhangi bir spesifik olmayan bileşenleri iptal etti bu adımı gerçekleştirmek için önemlidir. <ol><li> T çıkarılır eğrileri kaydetO farklı bir isim altında projenin sac. </li></ol></li><li> &quot;Çifte çıkarılır eğriler&quot; olarak bu eğrilerin bakın: İlk çıkarma hem enjeksiyonlar gerçekleştirilir 2-1 çıkarma ve ikinci diğerinden eğrinin çıkarma olduğunu. NOT: Bu tür çift referans SPR deneyler altın standarttır. </li><li> Daha önce açıklandığı gibi eksen kayması gerçekleştirerek çıkarılır eğrileri Yerleşimi. </li></ol></li><li> Kinetik sabitler ve model montaj belirlenmesi <ol><li> Bir kinetik deney yapılması <ol><li> Kinetik sabitlerin belirlenmesi için güvenilir bir veri için 6-7 analit konsantrasyonları bir dizi enjekte edilir. Dan analit konsantrasyonunu seçin 2-3 kat seyreltilerde, tahmin K D altında 10 kat yukarıda 10 kat. Daha sonra (yukarıya bakınız) çift referans çıkarma için kullanılan &quot;sıfır&quot; konsantrasyonu, ekleyin. Üçlü ve rastgele sırayla enjeksiyonları Davranış. </li><li> Hizalamave model uydurma denemeden önce Y-ekseni ve X-eksenine göre tüm eğrileri çıkarma. </li></ol></li><li> Model uydurma <ol><li> Uygun analiz programı seçin. NOT: Çoğu mevcut montaj programları uydurma ve kinetik sabitleri tayini için uygulanabilir çeşitli modeller sunuyoruz. </li><li> Analit ve montaj için ligand arasındaki etkileşimi 1: geri dönüşümlü bir 1 varsayarak basit modeli (Langmuir) uygulayın. Veri ikna daha karmaşık bir etkileşim varlığı için diğer deneysel yöntemler kullanılabilir sürece, her zaman basit, Langmuir modeli kullanın. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+surface+plasmon+resonance+biosensor+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis.</a> Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).</li>
<li>Rich, R. L., Myszka, D. G. H. igher-throughput <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((label-free%2C+real-time+molecular+interaction+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">label-free, real-time molecular interaction analysis.</a> Analytical Biochemistry. 361, 1-6 (2007).</li>
<li>Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+and+label-free+bio-sensing+of+molecular+interactions+by+surface+plasmon+resonance%3A+a+laboratory+medicine+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22The+Clinical+Biochemist+Reviews%22%5BJournal%5D)">Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: a laboratory medicine perspective.</a> The Clinical Biochemist Reviews. 33, 161(2012).</li>
<li>Kyo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+MafG+interaction+with+Maf+recognition+element+arrays+by+surface+plasmon+resonance+imaging+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Evaluation of MafG interaction with Maf recognition element arrays by surface plasmon resonance imaging technique.</a> Genes to Cells. 9, 153-164 (2004).</li>
<li>Katsamba, P. S., Park, S., Laird-Offringa, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+studies+of+RNA%E2%80%93protein+interactions+using+surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Kinetic studies of RNA–protein interactions using surface plasmon resonance.</a> Methods. 26, 95-104 (2002).</li>
<li>Vigonsky, E., Ovcharenko, E., Lewinson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+molybdate%2Ftungstate+ABC+transporters+that+interact+very+differently+with+their+substrate+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Two molybdate/tungstate ABC transporters that interact very differently with their substrate binding proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 5440-5445 (2013).</li>
<li>Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+mechanism+for+the+ABC+transporter+BtuCD-BtuF+revealed+by+the+dynamics+of+complex+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).</li>
<li>Kyo, M., Usui-Aoki, K., Koga, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+Detection+of+Proteins+in+Crude+Cell+Lysate+with+Antibody+Arrays+by+a+Surface+Plasmon+Resonance+Imaging+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Label-Free Detection of Proteins in Crude Cell Lysate with Antibody Arrays by a Surface Plasmon Resonance Imaging Technique.</a> Analytical Chemistry. 77, 7115-7121 (2005).</li>
<li>Mori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+protein+kinase+activities+of+cell+lysates+using+peptide+microarrays+based+on+surface+plasmon+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of protein kinase activities of cell lysates using peptide microarrays based on surface plasmon resonance imaging.</a> Analytical Biochemistry. 375, 223-231 (2008).</li>
<li>Mol, N., Fischer, M. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMol%2C+N+%22Surface+Plasmon+Resonance+Vol.+627+Methods+in+Molecular+Biology%22">Surface Plasmon Resonance Vol. 627 Methods in Molecular Biology</a>. Mol, N. J., Fischer, M. J. E. 1, Humana Press. 1-14 (2010).</li>
<li>Van Der Merwe, P. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVan+Der+Merwe%2C+PA+%22Surface+plasmon+resonance.+Protein%E2%80%93+ligand+interactions%3A+hydrodynamics+and+calorimetry%22">Surface plasmon resonance. Protein– ligand interactions: hydrodynamics and calorimetry</a>. , Oxford University Press. Oxford. 137-170 (2001).</li>
<li>Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+mechanism+for+the+ABC+transporter+BtuCD-BtuF+revealed+by+the+dynamics+of+complex+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).</li>
</ol>

Tüm yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını beyan eder.

SPR moleküler etkileşimleri incelemek için son derece hassas bir yöntemdir ve geçici (henüz önemli) etkileşimlerin gerçek zamanlı izleme sağlar tek yaklaşım genellikle. Bir örnek başka bir yöntemle (açılan deneyleri, lipozomlar sedimantasyon tahlilleri 6) tarafından tespit edilememiştir burada sunulan geçici etkileşim vardır. Diğer yöntemler (nicel veya nitel olsun) ölçümleri denge sınırlıdır Dahası, SPR da ön denge kinetiği ölçmek tek tekniklerden biridir. Onun artan duyarlılık a...

Protein-protein etkileşimleri (ÜFE); oluşumu ve protein kompleksleri ayrışma, birçok biyolojik süreçler (örneğin, replikasyon, transkripsiyon, çeviri, sinyal, hücre-hücre iletişim) anahtar olaylardır. ÜFE Yarı kantitatif çalışmalar genellikle çekme-aşağı veya immün-yağış deneyleri kullanılarak yapılmaktadır. Bununla birlikte, bu (ve benzeri) teknikleri nedeniyle bu tür teknikler doğasında olan yıkama adımları için ölçülebilir afinite aralığında (düşük mikromolar ve daha yüksek afinite) sınırlıdır. Bu tür &quot;son nokta&quot; teknikleri genellikle büyük biyolojik sonuçları vardır geçici veya düşük afinite etkileşimleri tespit edemez. Buna ek olarak, bu yaklaşımların zamansal çözünürlüğü derece, reaksiyon oranlarının daha yavaş büyüklük genellikle sipariş sınırlıdır. SPR nedeniyle artan hassasiyet ve üst temporal çözünürlük 1,2 bu eksikliklerin üstesinden gelir. SPR gibi ve bir etiket içermeyen bir yöntemdir(kütle değişiklikleri tespit edilebilir olduğu sürece) moleküler etkileşim ölçülebilir. PPI ek olarak, geniş bir protein-ligand ve protein-ilaç (veya küçük molekülü) ve protein-DNA ve protein-RNA etkileşimi 3-5 karakterize etmek için kullanılmaktadır. Sonuçlar kaydedildi ve deneysel koşullar ve esnek deneysel tasarım hızlı değiştirilmesini sağlar gerçek zamanlı, çizilir. SPR temelli araçların arkasında fiziksel prensibi kütle 2 değiştirir üzerine sensör yüzeyinde kırılma endeksi bir değişiklik ölçen bir optik sistemin kullanılmasıdır. Etkileşim ortakları (bundan sonra ligand) biri polimer matris çip ve ikinci molekülün (bundan sonra analit) yüzey üzerinde aktı üzerine immobilize edilir. Analit, liganda çip yüzeyi üzerinde kitle değiştirir. Bu kütle değişim, doğrudan ve oransal yüzeyin kırılma indeksi değişikliklerle ilgilidir. Sonuçlar, gerçek zamanlı olarak çizilir vezamanın bir fonksiyonu olarak cevap birimleri (RU) olarak sunulmuştur. Böyle bir komplo, bir sensogram olarak adlandırılır (örneğin, Şekil 1). SPR etkileşimi tamamen zaman sürecini takip ettiğinden ön denge kinetik hız sabitleri afinitelere denge ek olarak elde edilir. Aşağıda ayrıntılı olarak, belirli bir sistemin ön denge davranışı çok bilgi tutar ve yalnız denge çok farklı bir bakış açısı sağlar. Sistem kalibre sonra, deneyler çok hızlı ve (tutarlar nanogram için mikrogram) protein malzemesinin sadece küçük miktarlarda gerektirir. Verilen bir sistemin kinetik bilgi toplanması gün içinde elde edilebilir. SPR yüksek hassasiyet başka bir teknik kullanılarak 6 mümkün değildir ölçümleri tanıyor. Ancak, bu yüksek hassasiyet yanlış pozitif veriler için önemli bir kaynak olabilir çünkü bir &#39;iki ucu keskin bir kılıç &quot;dir. Yansıtıcı endeksi etkileyen herhangi bir faktör kaydedildi ve sensogram üzerine çizilir. Örneğin, ap Adıpropriate kontrolleri yanlış pozitif ortadan kaldırmak için kullanılması gerekir, ve tamamlayıcı yaklaşımlar destek son derece tavsiye edilir. Şekil 1, bir NTA-kaplı sensör çipi kullanan bir SPR deney ilerlemesini göstermektedir. Panel A sensogram NTA matris üzerinden nikel iyonlarının (çıkartılmamış veri) enjeksiyonu gösterir ve paneller BD negatif kontrol hücresinden elde edilen sinyal çıkarıldıktan sonra verileri görüntüler. Kırmızı ve mavi oklar sırasıyla, enjeksiyon başlangıç ​​ve bitiş göstermektedir. Enjeksiyon sona kadar çip üzerine ligand İmmobilizasyonu yavaş yavaş kitle değiştirir. ligandın enjeksiyon sona ermesinden sonra gözlenen istikrarlı plato yüzeyi (Şekil 1B, çevrim 2) ligand istikrarlı bir ilişki yansıtır. Istikrarlı bir temel elde edildikten sonra bir tampon ligand ve .Bu enjeksiyon bir &#39;boş kontrolü &quot;olarak hizmet vermektedir referans hücresi (döngüsü 3 Şekil 1B) üzerine enjekte edilir, ve olacaktırAnaliz sırasında çıkarılır. Enjeksiyon üzerine, küçük değişiklikler çip sayesinde kitle akışını yansıtan, kaydedilir. Daha sonra, ayrı bir döngü (Şekil 1B, program 4) içinde, analit, enjekte edilir; RU kademeli artış bağına Analitin dernek temsil eder. dengeye ulaşana kadar, bağlanma yerleri yavaş yavaş işgal hale gelir. En kısa sürede enjeksiyon biter gibi, RUs bir düşüş Kompleksin ayrışma yansıtır. Ön denge ve denge hız sabitleri elde edilebilir tür öz sensogramlar itibaren. (Daha sonra bakın) 1 ligand ve analit arasındaki geçici etkileşim tasvir Şekil. Etkileşim daha stabil olduğunda, RU düzeyinde düşüş daha düşük bir k d yansıtan, yavaştır. Bu yazıda, aynı kökten gelen substrat proteini 6,7 bağlayıcı bir membran taşıyıcısı (deterjan çözülebilir) ve fonksiyonel ortağı arasındaki etkileşimi karakterize amaçlayan bir SPR deney tarif. seçilen model sistem, bir ATP bağlama kaseti (ABC), taşıyıcı, Archeaglobus fulgidus arasında ModBC-A&#39;dır. Bu sistem oranları &#39;on / off&#39;, onun yüksek tekrarlanabilir sonuçlar için gürültü oranı yüksek sinyal seçilir ve klasik oldu. Ayrıca, homologları ABC taşıyıcıları olarak önemli negatif kontroller hizmet etmek vardır. taşıyıcı, ModBC (ligant A) deterjan saflaştırılmış ve çip üzerinde hareketsiz kılınmış kullanılarak membran elde edilir. Onun çözünebilir etkileşim ortağı, Moda, analit olduğunu. Negatif kontrol ligand olarak, farklı bir ABC transportör RbsBC (&quot;bağ B&quot;) kullanılır.

<table><tbody><tr><td>Biacore T200</td><td>GE Sağlık</td><td>28-9750-01</td><td></td></tr><tr><td>Sensör Çipi NTA&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>14100532</td><td></td></tr><tr><td>BIAevaluation</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biacore T200 Yazılımı&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikel klorür</td><td>Sigma</td><td>N6136</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum tungstat dihidrat</td><td>Sigma</td><td>T2629</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür ve nbsp;</td><td>Biyo-Laboratuvar LTD.</td><td></td><td></td>19030591</tr><tr><td>Trizma bazı</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Etildiamin-tetraasetik asit disodyum tuzu dihidrat (EDTA)</td> <td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodesil-&beta;-D-Maltopiranosid (DDM)</td> <td>Affymetrix</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat çözeltisi&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>05030</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes KIMTECH</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>GADOT</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Naylon (NY) Membran Filtre</td><td>Sartorius</td><td>25007--47------N</td><td></td></tr><tr><td>ModBC ABC taşıyıcı</td><td>Lewinson laboratuvarı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RbsBC ABC taşıyıcı</td><td>Lewinson laboratuvarı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ModA Substrat Bağlayıcı Protein</td><td>Lewinson lab</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

membran protein gerçek zamanlı ölçümler: reseptör etkileşimleri yüzey plazmon rezonans kullanma (spr)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein etkileşimleri, hepsi olmasa da çoğu fizyolojik süreç için çok önemlidir ve bu tür etkileşimlerin doğasını anlamak biyolojik araştırmalarda merkezi bir adımdır. Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR), biyo-moleküler etkileşimlerin gerçek zamanlı olarak etiketsiz incelenmesi için hassas bir algılama tekniğidir. Tipik bir SPR deneyinde, bir bileşen (genellikle 'ligand' olarak adlandırılan bir protein) bir sensör çipi yüzeyine immobilize edilirken, diğeri ('analit') çözelti içinde serbesttir ve yüzeye enjekte edilir. Analitin liganddan birleşmesi ve ayrışması, ön denge ve denge verilerinin türetildiği sensogram adı verilen bir grafik üzerinde gerçek zamanlı olarak ölçülür ve çizilir. Etiketsiz olması, düşük miktarda malzeme tüketmesi ve denge öncesi kinetik veriler sağlaması, SPR'yi protein etkileşimlerinin dinamiklerini incelerken sıklıkla tercih edilen yöntem haline getirir. Bununla birlikte, yöntemin yüksek hassasiyeti nedeniyle, elde edilen verilerin dikkatli bir şekilde analiz edilmesi ve diğer biyokimyasal yöntemlerle desteklenmesi gerektiği unutulmamalıdır. 
SPR, az miktarda saflaştırılmış malzeme tükettiği ve lipitler ve deterjanlarla uyumlu olduğu için membran proteinlerini incelemek için özellikle uygundur. Bu protokol, bir zar proteini (bir ABC taşıyıcısı) ve çözünür bir protein (taşıyıcının aynı kökenli substrat bağlayıcı proteini) arasındaki etkileşimin kinetik özelliklerini karakterize eden bir SPR deneyini tanımlar.

Burada tarif edilen bir sistemde, Ninta çip His ile etiketlenmiş zar taşıyıcı 6,7 hareketsiz hale getirmek için kullanılır. Bir homo-dimer olmak, her taşıyıcı iki kat onun Ninta çip bağlanması iyileştirilmesi, etiketlenir. Nikel yükleme, ligand A (faiz taşıyıcı) ardından RU 3,500 ~ kadar, Fc = 2 üzerine immobilize edilir (protokol döngüsü 2, Şekil 2A siyah etiket). Ardından, aynı akışı ve enjeksiyon süresi, ligand B (kontrol ligandı) kullanarak başlangıçta sadece kadar ~ 3.000 RU ulaşan, Fc =...

Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR) gerçek zamanlı biyomoleküler etkileşimlerini tespit etmek için bir etiket içermeyen bir yöntemdir. Burada, bir membran proteini için bir protokol: tekniğin artılarını ve eksilerini tartışırken reseptör etkileşimi deney, tarif edilmektedir.

Membran Protein Gerçek zamanlı ölçümler: Reseptör Etkileşimleri Yüzey Plazmon Rezonans Kullanma (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yüzey plazması ve rezonans kullanarak bir protein reseptörü etkileşimini göstermektir. Bu, nikel iyonlarının nitrotri asetik asit veya NT a matrisi üzerine enjeksiyonu ile elde edilir. Daha sonra, ligand olarak adlandırılan proteinlerden biri, boş bir enjeksiyonun ardından sensör çipi üzerine hareketsiz hale getirilir.Analit olarak adlandırılan ikinci protein, hareketsizleştirilmiş ligandın üzerine enjekte edilir. İki protein arasındaki etkileşimi tespit etmek için sonuçlar, iki proteinin geçici olarak etkileşime girdiğini, analitin ligandla birleştiğini ve ayrıştığını göstermektedir. Etkileşimin afinitesi, iki proteinin ölçülen ayrışma ve ayrışma oranlarına dayanarak hesaplanabilir.Bu tekniğin, aşağı çekme veya immünopresipitasyon gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, genellikle büyük biyolojik sonuçlara yol açan geçici veya düşük afiniteli etkileşimi tanımlayabilmesidir. Bu yöntem, biyokimyada, ilgilenilen proteinin başka bir proteine mi yoksa başka bir küçük moleküle mi bağlandığı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, etkileşimin doğası belirlenebilir ve afinite ölçülebilir. Numuneyi hazırlamak için, metin protokolünde açıkland

real-time-measurements-membrane-proteinreceptor-interactions-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu konjuge polimer polydiacetylene (PDA), florofor biyomoleküllerin algılama için PDA lipozomlar yüzeyine bağlı arasında FRET göstermektedir. PDA lipozomlar da problar olarak kullanılmak üzere biyomoleküllerin için, yüzeyleri üzerinde reseptör molekülleri içermektedir. Ligand-reseptör etkileşimlerinin algılama mekanizmasının temelidir florofor ve PDA arasında FRET verim değişikliklere yol açmaktadır.

Floresans Rezonans Enerji Transferi Ligand-reseptör etkileşimleri gerçek zamanlı izleme

Bu video, bir sensör çipi kullanarak iki molekül arasındaki etkileşimi incelemek için yüzey plazmon rezonansı veya SPR tekniğini açıklar. Rezonans açısındaki değişiklik ve yansıyan ışığın yoğunluğu, iki molekülün birleşmesi ve ayrışmasının bir fonksiyonu olarak algılanır ve bu, iki molekül arasındaki etkileşimler hakkında bilgi sağlar.

Bir sensör çipi kullanarak biyomoleküler etkileşimleri incelemek için yüzey plazmon rezonansı

Bu video, tek bir hücreden protein salgılarını tespit etmek için lokalize yüzey plazmon rezonans görüntülemeyi gösterir. Mikroakışkan bir kurulum ve peptit bağlı bir plazmonik nanoyapı çipi kullanarak, rezonans açısında yansıyan ışık yoğunluğundaki değişiklikler, tek bir hücreden salgılanan proteinlerle etkileşimleri ortaya çıkarır.

Tek Bir Hücreden Protein Salgılarını Tespit Etmek için Lokalize Yüzey Plazmon Rezonans Görüntüleme

Bu protokol, canlı hücrelerin yüzeyindeki tek reseptörleri görselleştirmek ve izlemek ve böylece reseptör yanal hareketliliğini, reseptör komplekslerinin boyutunu analiz etmek ve ayrıca geçici reseptör-reseptör etkileşimlerini görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan mikroskobunun nasıl kullanılacağını açıklar. Bu protokol diğer zar proteinlerine genişletilebilir.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Tek bir T lenfositinde kuvvet regülasyonlu tek reseptör-ligand bağlanma kinetiğini ve kalsiyum sinyalinin gerçek zamanlı görüntülemesini aynı anda ölçmek için bir teknik açıklıyoruz.

Floresan biyomembran Kuvvet Probe: Tek Hücre üzerinde Reseptör-ligand Kinetiklerinin Eşzamanlı kantitasyonu ve Bağlama kaynaklı Hücre içi Sinyal

Arası hücresel iletişim içinde ve hücre dışında çeşitli fizyolojik aktiviteleri kontrol edilmesi için çok önemlidir. Bu kağıt tek hücre salgılarının uzay-zamansal yapısını ölçmek için bir protokol tanımlamaktadır. Bunu başarmak için, bir multidisipliner bir yaklaşım canlı hücre görüntüleme ile algılama etiket içermeyen nanoplasmonic entegre olan kullanılır.

Tek Hücre Salgıları uzay-zamansal Görüntüleme için bir etiket içermeyen Tekniği

RNA polimeraz ile transkripsiyon faktörlerinin (TFs) etkileşimleri genellikle PULLDOWN asder kullanılarak incelenmiştir. GrgA 'nın klamidiyal RNA polimeraz ile etkileşimini karakterize etmek için bir Biolayer Interferometri (BLı) teknolojisi uygulıyoruz. PULLDOWN analizlerine kıyasla, BLı gerçek zamanlı dernek ve dissociation algılar, daha yüksek hassasiyet sunar ve oldukça nicelidir.

Transkripsiyon protein-protein etkileşimlerini Incelemek için Biolayer Interferometri (BLı) uygulaması

Bu makale, hücre dışı vezikül alt kümelerinin karakterizasyonu için artan verime sahip yeni nesil multiparametrik analitik platformlar önermektedir. Yöntem, bir mikroarray biyoçipinde sıkışmış veziküler hedefleri nitelemek için Raman spektroskopisi ile birleştiğinde, atomik kuvvet mikroskobu ile metrolojik ve morfomekanik analizlerle çoklanmış biyosensing yöntemlerinin bir kombinasyonuna dayanmaktadır.

Hücre Dışı Vezikül Alt Kümelerinin Analizi için Çok Katlı Yüzey Plazmon Rezonans Görüntüleme Çipi Üzerinde Multimodal Analitik Platform

Bu çalışma, doğal olmayan amino asit (UAA) dahil etme yoluyla bölgeye özgü etiketleme kullanarak G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) üzerinde tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi (smFRET) deneyleri gerçekleştirmek için ayrıntılı bir prosedür sunmaktadır. Protokol, smFRET numune hazırlama, deneyler ve veri analizi için adım adım bir kılavuz sağlar.

Tek Moleküllü FRET Kullanarak Membran Reseptörlerinin Konformasyonel Dinamiğinin Görselleştirilmesi

Bu yazıda, nasıl bir otomatik tarama konfokal mikroskop kullanılarak bir yüzeye immobilize bireysel DNA molekülleri izleri FRET elde açıklar.

Yüzey immobilize Biyomoleküller Tek Molekül Floresans Ölçümler için Otomatik Sistem

Öğrenin membran protein reseptör etkileşimlerini gerçek zamanlı ölçmek için yüzey plazmon rezonans (SPR) kullanmayı. Bu etiketsiz yöntem, bağlanma afinitesi ve kinetik verileri sağlar.

Membran Protein Gerçek zamanlı ölçümler: Reseptör Etkileşimleri Yüzey Plazmon Rezonans Kullanma (SPR)

Daha fazla video keşfet