Membran Protein Gerçek zamanlı ölçümler: Reseptör Etkileşimleri Yüzey Plazmon Rezonans Kullanma (SPR)

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yüzey plazması ve rezonans kullanarak bir protein reseptörü etkileşimini göstermektir. Bu, nikel iyonlarının nitrotri asetik asit veya NT a matrisi üzerine enjeksiyonu ile elde edilir. Daha sonra, ligand olarak adlandırılan proteinlerden biri, boş bir enjeksiyonun ardından sensör çipi üzerine hareketsiz hale getirilir.

Analit olarak adlandırılan ikinci protein, hareketsizleştirilmiş ligandın üzerine enjekte edilir. İki protein arasındaki etkileşimi tespit etmek için sonuçlar, iki proteinin geçici olarak etkileşime girdiğini, analitin ligandla birleştiğini ve ayrıştığını göstermektedir. Etkileşimin afinitesi, iki proteinin ölçülen ayrışma ve ayrışma oranlarına dayanarak hesaplanabilir.

Bu tekniğin, aşağı çekme veya immünopresipitasyon gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, genellikle büyük biyolojik sonuçlara yol açan geçici veya düşük afiniteli etkileşimi tanımlayabilmesidir. Bu yöntem, biyokimyada, ilgilenilen proteinin başka bir proteine mi yoksa başka bir küçük moleküle mi bağlandığı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, etkileşimin doğası belirlenebilir ve afinite ölçülebilir. Numuneyi hazırlamak için, metin protokolünde açıklandığı gibi saflaştırılmış proteinden tüm agregaları çıkarın.

Çalışan tamponu hazırlayın ve sıfır noktası 22 mikron filtreler kullanarak tüm tamponları ve protein örneklerini filtreleyin. Çalışan tampon şişesini pompa girişine bağlamadan önce filtrelerin protein uyumlu olduğundan emin olun. Çalışan tamponun 10 mililitresini ayrı bir tüpte bir kenara koyun.

Ardından, arabellek uyumsuzluklarını önlemek için numuneleri çalışan arabelleğe karşı seyreltin. Genel bir kural olarak, stabil ligand demobilizasyonu için, yüksek ligand konsantrasyonlarının aksine düşük akışta daha uzun enjeksiyonlarla düşük ligand konsantrasyonları kullanın Yüksek akışta daha kısa enjeksiyonlarla Konsantre ligand stoğunu, mililitre başına yaklaşık 20 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona kadar çalışan tampona seyreltin. Son olarak, analiti çalışan tampon içine istenen konsantrasyona kadar seyreltin.

Afinitesi bilinmeyen bir sistem için, on kat seyreltmelerde 10 mikromolar ila 10 ano molar arasında bir dizi analit konsantrasyonunu test edin. Bu gösteride, bir oli histidin etiketi ile proteinleri yakalamak için uygun olan NTA bağlantılı bir çip yeniden kullanılır. Saklanan çipi tampondan çıkardıktan sonra, çift damıtılmış su ile iyice durulayın, nazikçe kurulayın ve orijinal kılıfına yerleştirin.

Çipi SPR cihazına yerleştirmek için sensör çip kapağını açın ve çipi kılıfına yerleştirin. Kapıyı kapatın ve yuva çipine basın. Çip hücresi sıcaklığını 25 santigrat dereceye ayarlayın.

Proteini deney boyunca sabit tutmak için numune bölmesini yedi santigrat dereceye ayarlayın. Metin protokolünde açıklandığı gibi yükleme ve sıyırma için çözeltileri hazırladıktan sonra, SPR cihazını çalışan arabellek ile astarlayın. Bir sonraki adım için akışı dakikada 50 mikrolitreye ayarlayın.

Burada açıklanan sonuçları elde etmek için akış yollarını tanımlayın ve çıkarma işlemine başvurun. Uygun numune rafını seçtikten sonra, bir numaralı akış hücresi ve iki numaralı akış hücresi ve bir numaralı akış hücresi için yolları, uygun numune rafını seçtikten sonra, deneye başlamadan önce sonuç dosyasını kaydedin, böylece veriler çalışma sırasında kaydedilecektir. Her deney döngülerden oluşur.

Her döngüde yapılan enjeksiyonların net bir kaydını tutun ve tamponun boş enjeksiyonunu ve analit enjeksiyonunu yükleyen ligandları farklı döngülere ayırın. Birinci döngü, talaş hazırlama ve nikel yüklemedir. Akışın ve yolların ayarlandığından emin olun ve ardından kalan molekülleri yıkamak için bir dakika boyunca 350 milimolar EDTA enjekte edin.

Ardından, akışı dakikada 10 mikrolitreye ayarlayın. Daha sonra iki dakika boyunca 0.5 milimolar nikel klorür enjekte edin. Şimdi çip reçinesi nikel iyonları ile kaplanmıştır.

İkinci döngü ligand immobilizasyonudur. Akışı dakikada 15 mikrolitreye ayarlayın ve akış yolunu akış hücresine ayarlayın. İkincisi, ligand moleküler ağırlığının 10 ila 20 katı olan yanıt birimine veya R ru değerlerine ulaşana kadar ligand A'yı enjekte edin.

Örneğin, 50 kilodaltonluk bir ligandı 501.000 rus arasında yükleyin. Elde edilen RU değerinin kaydını tutun. Daha sonra akışı dakikada 15 mikrolitreye ayarlayın ve bir numaralı akış hücresine giden akış yolunu ayarlayın, kontrol ligandı B'yi ligand a ile aynı RU değerine kadar enjekte edin, çıkarma işlemini izleyin, sensör Graham enjeksiyon uzunluğunu kontrol etmeye yardımcı olmak için çevrimiçi.

Ardından, akışı dakikada 50 mikrolitreye ve akış yolunu bir numaralı akış hücresine ve akış hücresine ayarlayın. İkincisi, taban çizgisi stabilize olana kadar sistemi beş ila 20 dakika yıkamaya devam edin. Üçüncü döngü boş enjeksiyondur.

Bu enjeksiyon, boş çıkarma işlemine hizmet edecektir. Bu nedenle, analitin kendisi dışında analit ile enjekte edilecek tüm bileşenleri dahil edin. Enjeksiyon uzunluğu, dengeye ulaşmak için geçen süreye bağlı olarak değişebilir.

Akışı dakikada 15 mikrolitreye ayarlayın ve akış yolunu, akış hücresinden çıkarılan bir numaralı akış hücresine ve iki numaralı akış hücresine ve bir numaralı akış hücresine ayarlayın. İkincisi, sabit bir taban çizgisi elde etmek için ağırlık komutunu 30 saniye boyunca yerleştirin. Ardından çalışan tamponu 13 saniye boyunca enjekte edin.

Ayrışma aşamasını kaydetmek için 120 ila 600 saniye bekleyin. Bu adımın uzunluğu kd'ye göre değişir. Ayrışma ne kadar yavaş olursa, bu adımın o kadar uzun olması gerekir.

Dördüncü döngü analit enjeksiyonudur. Bu iki enjeksiyonun daha sonra çıkarılabilmesi için üçüncü döngüde kullanılan tam koşulları kopyalayıp yapıştırın. Raftaki yuvanın konumunu, kontrol solüsyonunu tutan konumdan analit solüsyonunu tutan yere değiştirin.

Beklenen denge ayrışma sabitinin biraz üzerinde bir konsantrasyon seçin. Önceden bilgi yoksa, iyi bir başlangıç noktası olarak bir mikromolar seçin. Tampon enjeksiyonunu ve analit enjeksiyonunu ikinci kez gerçekleştirdikten sonra, yedinci döngü talaşları açmayı gerçekleştirin.

Akışı dakikada 50 mikrolitreye ayarlayın, ardından bir dakika boyunca 350 mili molar EDTA enjekte edin. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın. Çipe zarar verebileceğinden üç dakikalık tek bir enjeksiyon kullanmayın.

Ardından, bir dakika boyunca% 0.25 sodyum dcal sülfat enjekte edin. Bu adımı iki kez tekrarlayın. Nikel yüklemesini takiben çipe zarar verebileceğinden, üç dakikalık tek bir enjeksiyon kullanmayın, ilgilenilen taşıyıcı 3.500 R rus'a kadar iki numaralı akış hücresine hareketsiz hale getirilir.

Daha sonra aynı akış ve enjeksiyon süresi kullanılarak, kontrol ligandı bir numaralı akış hücresine enjekte edilir ve başlangıçta sadece 3000 R'ye ulaşır ve benzer protein miktarlarının her iki akış hücresinde de hareketsiz hale getirildiğinden emin olur. Kontrol ligandı, 3.500 RDU'ya kadar yüklemeyi izlerken daha kısa enjeksiyonla daha da yüklenir. Merdiven şekli, burada gösterilen her enjeksiyonda bir numaralı akış hücresindeki kütledeki kademeli artışı temsil eder, akış hücresinden çıkarılan bir numaralı akış hücresidir.

İkincisi, eşit yükleme elde etmek için ligand enjeksiyonunun süresini değiştirmek önemlidir. Buna karşılık, analit enjeksiyonunun süresi, kantitatif veri elde etmek için kullanılan tüm konsantrasyonlar için sabit tutulmalıdır. Bir dizi analit konsantrasyonu enjekte edilir.

Burada, sabit bir enjeksiyon uzunluğuna sahip farklı analit konsantrasyonlarının enjeksiyonları gösterilmiştir. Farklı analit konsantrasyonları rastgele sırayla enjekte edilir ve çift boş sensör gramları, afinite ve hız sabitini elde etmek için analizden önce x ekseni hizalanır. Bir model uydurma uygulanır.

Mod BCA etkileşimi için hesaplanan denge ayrışma sabiti, orta derecede hızlı bir KA ve hızlı KD ile yaklaşık üç kez 10 üzeri eksi altı molar'dır ve bir kez ustalaştı. Bu teknik, bu videoyu izledikten sonra birkaç saat içinde yapılabilir. İlgilendiğiniz proteini kullanarak bir SPR deneyinin nasıl tasarlanacağı ve gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.