İnsan Tüm Kan gerçek zamanlı sitotoksisite deneyleri

Bu prosedürün amacı, insan tam kanındaki hedef kanser hücrelerinin sitotoksisitesini tek hücre çözünürlüğü ile ölçmektir İlk olarak, hedef kanser hücrelerinin tek bir hücre dizisi oluşturulur. İnsan tam kanı hücre dizisine eklenir ve antikor gibi ilaçlar uygulanır. Hücreler daha sonra propidium, iyodür gibi bir hücre canlılığı boyası ile inkübe edilir ve kırmızıya boyanmış ölü hedef kanser hücrelerinin sayısını ölçmek için yüksek verimli görüntüleme kullanılır ve sonuçta ilaç sitotoksisitesi etkinliği sağlanır.

Bu teknolojinin LDH ve krom tahlili gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, görüntüleme yeteneği ile insan tam kanında kanser hücresi öldürme işleminin yapılabilmesidir. Bu yöntem, hayvan çalışmasından önce in vitro olarak antikor sitotoksisitesini değerlendirebilir Hücre eki 96 elde ederek başlayın. Kuyu plakası kitleri veya tek hücre hızı sekiz kuyulu oda kayar, burada 96 kuyulu plaka kullanılacaktır.

Kitten DNA reaktifi içeren tüpe 1.2 mikrolitre aktivatör uygulayın, şişeyi kapatın, ters çevirin ve çözeltiyi karıştırmak için hafifçe sallayın. Çözeltinin 20 dakika oda sıcaklığında reaksiyona girmesine izin verin. Bu arada, hedef hücreleri hazırlayın.

Bu gösteride, Raji lenfoma hücreleri hedef hücreler olarak görev yapacaktır. Bunları bir CO2 inkübatöründe 37 santigrat derece olan takviyeli RPMI 1640 kültür ortamında saklayın. Hedef rahi hücrelerini deney için hazırlamak için, beş ila 10 milyonunu üç dakika boyunca 468 kez 15 mililitrelik bir konik tüp santrifüjüne aktarın G. Dönüşü takiben, supinatın yüzeyinde oluşan kabarcıkları aspire etmek için bir pipet kullanın.

Sonra tüm supinate'i çıkarın ve atın. Ardından, tüpe 10 mililitre PBS ekleyin. Hücre kümesini parçalamak için çözeltiyi yukarı ve aşağı takip ederek hücreleri yeniden süspanse edin, santrifüjlemeden sonra hücreleri üç dakika boyunca 468 kez G santrifüjleyin, sırtüstü ajanın yüzeyinde oluşan kabarcıkları aspire edin ve aktivatör ve kitteki DNA çözeltileri 20 dakika inkübe edildikten sonra tüm sırtüstü ajanı daha önce olduğu gibi çıkarın ve atın.

Karışık çözeltiyi 15 mililitrelik tüpteki hedef hücre arkadaşına uygulayın. Hücre peletini parçalamak için çözeltiyi pipetleyin. Daha sonra, 500 Nanomolar nihai konsantrasyonda yeşil floresan sitozolik boyalar ekleyin.

Karışık çözelti ve boya ile hedef hücreleri bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, hücreleri beş mililitre PBS'de iki kez yıkayın, rondelalar arasında santrifüjleyin ve yeniden süspanse edin. RPMI 1640'ın uygun hacmindeki hücreler.

Hücre konsantrasyonunu mililitre başına altı hücreye 10 kere beş kata çıkarmak için büyüme ortamı. Daha sonra, her bir oyuğa 200 mikrolitre hücre çözeltisi uygulayın ve 10 ila 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. İnkübasyonun ardından, hücreler lekelere sevgilidir, kuyu plakasını hafifçe sallayın ve bir kabarıklık arayın.

Ardından, bağlanmamış hücreleri yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe yıkayın. Daha sonra orijinal ortamı çıkarın ve tam kan sitotoksisite testini gerçekleştirmek için yeni ortam ekleyin. Her bir oyuktaki ortamı çıkarın ve ardından her oyuğa 180 mikrolitre insan tam kanı ekleyin.

Daha sonra, mililitre anti CD 20 antikoru başına beş miligram ile başlayarak. Elli, yirmi, on, beş, iki, bir ve mililitre başına 0,5 mikrogram yapmak için 1,5 mililitrelik tüplerde seri seyreltme yapın. Daha sonra her numuneye her konsantrasyondan 20 mikrolitre ekleyin.

Üç nüsha halinde. Her birine 500 nanomolar nihai konsantrasyon olarak propidyum iyodür ekleyin. Daha sonra plakayı 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile 16 saat inkübe edin.

Ertesi gün, ateks büyütme kullanan otomatik bir görüntüleme sistemi ile hücreleri görüntüler. Sonuçları ölçmek için otomatik görüntüleme sisteminin hücre sayma programını kullanın. Burada. Hücre muhabir yazılımının kullanımı gösterilmiştir.

Bu yazılım, hücre sayımı için basit adım adım işlemler sağlar. İlk olarak, yazılımın ana sayfasından sonuçları incele'yi seçin. Ardından örnek dosyayı seçin.

Dosya açıkken, uygun ortalama yoğunluk kapısını 50'den büyük ve Teksas kırmızı ortalama yoğunluğunu 20'den büyük olarak seçin. Ardından, araç çubuğunda plakaya genel bakış seçin, plaka düzeni ve PI ile boyanan hücrelerin yüzdesi ekranda gösterilecektir. Tabloları dışa aktarmayı seçin.

Sistem bu Excel dosyasını nereye kaydedeceğini soracak, konumu belirtecek ve dosyayı kaydedecektir. Son olarak, verileri Microsoft Excel'e aktarın. Ardından, tam kan sitotoksisite testini, anti CD 20 antikorlarını ve lenfoma hücre hatlarını göstermek için hedef kanser hücresi öldürme yüzdesine göre burada gösterilen formülü kullanın.

Hücre yüzeyinde CD 20 gibi yüksek kopya sayısına sahip olan Raji ve CD 20 gibi düşük kopya sayısına sahip mc car model sistem olarak seçilmiştir. Hedeflenen Raji lenfoma hücrelerinin hem canlı hem de ölü tespiti bu videoda anlatıldığı gibi gerçekleştirildi. Mililitre başına 2.5 mikrogram anti CD 20 antikoru kullanıldığında, sitotoksisite seviyesi, kırmızı ve yeşil ile gösterilen ölü hücrelerin yeşil ile gösterilen sunulan hücrelere oranı ile gösterildiği gibi yüksekti, sadece anti CD 20 antikorunun konsantrasyonu azaldıkça sitotoksisite seviyesi azaldı.

Mililitre başına 0.05 mikrogram anti CD 20 antikoru kullanıldığında, sitotoksisite seviyesi düşüktü. Her bir antikor konsantrasyonu için antikor konsantrasyonu başına yüz veri noktasının tümü analiz edildi. Raji lenfoma hücrelerinin ölüm yüzdesi, mc car kontrol hücrelerinden anlamlı olarak daha yüksekti.

Raji'ye karşı tam kan sitotoksisite testi sonucu için mililitre başına 0.12 mikrogramlık etkili bir konsantrasyon veya EC 50 değeri elde edildi. Bu değer, insan tam kanı bağlamında CD 20 pozitif lenfoma hücrelerinin %50'sini öldürmek için en az 0.12 mikrogram, bir anti CD 20 antikoruna ihtiyaç olduğunu gösterir. Bu, hayvan çalışmalarında ve insan klinik deneylerinde kullanım için gereken ilaç etkinliğini ve dozajını sağlar.

Bu prosedürü takiben, ilaca dirençli kanser hücreleri tanımlanabilir ve daha ileri analizler için izole edilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, insan tam kanındaki hedef kanser hücrelerinin sitotoksisitesini nasıl ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.