Name: Yayılması Homalodisca coagulata virüs 01 Yoluyla Homalodisca vitripennis Hücre Kültürü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Keşfedin Homalodisca vitripennis hücre kültürlerinde HoCV-1 virüsünün replikasyonunu ve RNA ekstraksiyonu ile kantitatif analiz yöntemlerini. Bu protokol virüs-sıcak etkileşimlerini anlamak için güvenilir bir in vitro model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Texas Pierce's Hastalığı Araştırma ve Eğitim Programına ve USDA-APHIS'e bu projeye sağladıkları finansman desteği için teşekkür ederiz. Tyler'daki Texas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi'nden Hema Kothari'ye konfokal mikroskopi konusundaki yardımları için de teşekkür ederiz.

1. Hücre Kültürü Not: USDA Agricultural Research Service (ft. Pierce, FL ABD) Dr Wayne Hunter laboratuvar tarafından Homalodisca vitripennis hücre çizgileri, ilk ve fibroblast hücre mono tabakaları içeren karışık aşamadan oluşan bir laboratuar stok başlatmak için kullanılmıştır. <ol><li> 25 cm2, kültür şişelerinden ile 20-24 ° C&#39;lik bir sıcaklık aralığında muhafaza steril bir laboratuar ortamında, aşağıdaki işlemleri gerçekleştirmek. </li><li> Yetiştirmek ve H2G + yaprak piresi ortamı, bir tadil edilmiş WH2 bal ortam 10 (Tablo 1) ile 25 cm2 doku kültürü şişeleri içinde kültürleri korumak. </li><li> 53 nem oranı% ~ 24 ° C &#39;de kültür şişeleri inkübe edin. </li><li> , Herhangi bir anormal hücre büyümesi kontrol, örneğin kültür büyümesini izlemek, herhangi bir potansiyel kirletici için monitör ve kültürleriyle arasında büyüme ilerlemeyi kontrol etmek için toplam büyütme 100X (TM) bir ters mikroskop kullanınTure yüzey. </li><li> Kültür yüzeyini bozmadan 10 gün - her 7 tam orta değişikliği (şişesi ortalama ~ 4 ml kültür ortamı) gerçekleştirin. </li><li> Kültür yüzey hücreleri ayırmak etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ihtiva eden,% 0.25 tripsin kullanılarak hücre büyümesi (konfluent) kapsamındaki yaklaşık% 80 olduğu zaman kültür geçirin. Her kültür şişesine tripsin 3 ml ve kısa bir süre için enzime kültür (ler) maruz - ~ 2 Ekle - tam hücre ayrışmasını sağlamak için (5 10 dk). </li><li> Enzim aktivitesini durdurmak için santrifüj ve konik tüp bütün çözüm aktarmak için - kültür şişesine (lar) (3 mi ~ 2) taze ortamın eşit miktarda ekleyin. </li><li> 350 x g hızında 6 dakika boyunca 4 ° C&#39;de santrifüj ile pelet hücreleri. </li><li> Hücre topaklarını bozmadan Süpernatantı ve her bir tüpe ~ taze ortam 8 ml ekleyin. Yavaşça bir pipet kullanarak hücreleri homojenize. </li><li> 1 Split kültürler: 2 oranı için 25 cm 2 şişeler (~ hücre soluti 4 mlkap başına üzerinde) ve ayrılmak taze kültür geçirilen süspansiyon halindeki hücreler şişenin yüzeyine sağlam bir şekilde tutunmasını sağlayacak, 48 saat boyunca rahatsız. Not: 1 cm2 &#39;lik bir büyüme yüzeyi ile 48-çukurlu steril doku kültürü plakaları içindeki hücrelerin yetiştirilmesi mümkündür ve ~ 250 ul kültür ortamı hacimde bir azalma ile birlikte kültür şişelerinde aynı şekilde elde edilebilir. </li></ol> 2. Tüm virüs Ekstraksiyon <ol><li> Virüs pozitif H. tüm organları homojenize ~ 10 saniye aralıklarla girdap% 0.02 sodyum dietilditiyokarbamat trihidrat (DETCA) ile fosfat tamponu içinde vitripennis, pH-7.2, mevcut bir dokusunun daha büyük topaklar kalmayana kadar. 4 ° C de 4 saat ya da 4 ° C &#39;de 16 saat süre ile 22.000 x g boyunca 124.500 x g&#39;de santrifüj ile SuperSpeed ​​virüs ekstrakte edin. Üstünde bir çökelti ortaya çıkarsa, steril pamuklu çubuk 11 ile çıkarın. </li><li> Süpernatant atın. </li><li> Pelet toplayın ve% 0.4 Na-deoksikolik asit ve% 4 polietilen glikol heksadesil eter (Brij 52) ihtiva eden, 5 mi 10 mM fosfat tampon maddesi (yok DETCA), pH değeri, 7.2 ile çözülür. <ol><li> De pelet karıştırmak için, tüpün yanından pelet kaldırmak ve gerekirse çözelti içinde kadar ezmek. </li><li> Topak gerekirse çözelti haline ve 2 tüpler 11 birleştirmek yardımcı olmak için ~ 5 mi artışlarla daha 10 mM fosfat tamponu ilave edin. </li></ol></li><li> 15 dakika için 11 300 x g&#39;de çözümü santrifüj. </li><li> Süpernatantı ve bir 0.45 um filtre içinden çözeltisinin, ve büyük bir toplama tüpü 11 Süzüntüyü toplamak. </li><li> Bir moleküler ağırlığa sahip bir diyaliz zarı transfer süzülen madde 10 mM&#39;lik 11 gerekirse herhangi bir DETCA ihtiva eden fosfat tamponu (pH 7), küçük miktarları kullanılarak, 3.5 kD (MWCO) kesilir. </li><li> 4 ° C&#39;de GKD 2 O dolu olan büyük bir beher içinde diyaliz membranı yerleştirin. GKD 2 O her saat f değiştirinveya 5-6 saat sonra, zar 11, beyaz bir çökelti oluşana kadar. </li><li> Zarı içinde saflaştırılmış virüsü toplamak ve GKD 2 O 90 ul solüsyon 10 ul ekleyerek 10-kat seyreltme serisi için% 100 virüs çözeltinin çok 100.000: Daha sonra 1 bir seyreltme ulaşana kadar GKD 2 O başka bir 90 ul seyreltme 10 ul ekleyin. </li><li> -80 ° C&#39;de saklayın virüs çözümü. </li></ol> 3. Viral kopyalama <ol><li> Hücre büyümesi (hücreler ortalama bir oranda artmaktadır, yaklaşık olarak 72 saat post-geçiş)% 80 birleşmeye kadar 48 oyuklu kültür plakaları içinde tohum hücreleri ve tüm satırları büyür. </li><li> Hücre büyümesi konfluansa ulaştığında, seri halinde seyreltilmiş virüs, hücrelerin her satır inoküle, yani, 1:10 seyreltme, bir satır, bir 1 bir sıra: en üst sırasının dışında 100 seyreltme, vb. Bir kontrol olarak üst satırı kullanın ve ses kontrolü olarak her kuyuya GKD 2 O 10 ul ekleyin. <ol><li> Önce virüs kültürlerde herhangi bir kuyu İlk aşıdan her satırın ilk kuyu, deneysel hücre sayımları ile karşılaştırma için bir başlangıç ​​bazal hücre konsantrasyonunu kurmak ayırmak ve saymak için. </li></ol></li><li> Kültür plakaları, pH değişikliği gösteren bir ortam içinde herhangi bir renk değişikliği ve hücre morfolojisinde herhangi bir değişiklik için virüs aşılanmasından sonra her 24 saat izleyin. </li><li> 100X TM bir ters mikroskop kullanılarak her bir zaman noktasında test plakası, görüntü bir sütun. </li><li> Her bir 24 saatlik zaman noktasında görüntülenmiştir kolondan tüm Ortamı çıkarın ve -80 ° C de, viral RNA çıkartması ve miktar tayini ya da uzun bir dönem için -20 ° C &#39;de kısa süreli saklayın. </li><li> Hücre Pelle yeniden suspande edilmesi için enzim aktivitesi ve taze ortam ~ 250 ul durdurma% 0.25 tripsin EDTA ve taze ortam arasında sadece yaklaşık 250 ul kullanılarak 1.9 - 1.6 aşamalarında daha önce tarif edildiği gibi orta çıkardıktan sonra kuyulardan hücreleri ayırmakt. </li><li> Bir hafta boyunca her 24 saatlik bir süre boyunca hücre ayrılma sonra hücre sayıları gerçekleştirmek için hücreleri ihtiva eden her tüpe% 0.4 tripan mavi boyası, 10 ul ekle. Leke hücre sayımları yapmadan önce 10 dakika dinlendirin. <ol><li> Leke hem de cansız hücreler alımı başlar leke maruz bırakılarak ya da yaşayan hücrelerin, 1 saat içinde hücre sayar. </li></ol></li><li> Yavaş yavaş bir mikropipet kullanılarak standart bir hemasitometre her iki tarafına da lekeli hücre çözeltisinin 10 ul ekle. Veren çözelti, hava kabarcıklarını önlemek için kılcal hareketi ile yukarı alınır. </li><li> Hemasitometre her iki tarafına uygulanabilir (non-lekeli) hücrelerin sayısını (hemositometrede 16 kareler 4 sayımları eşdeğer) sayılır. Çıkarıldı kolonun her bir oyuk için hücre sayar. </li><li> Her kolondan hücre sayıları ortalama ve toplam hücre sayısı numarasını edinmek için aşağıdaki formülü kullanın: x seyreltme faktörü (hücre / 4 ortalama sayısı) = hücrelerin x 10 sayısını <sup&gt; 4 mi. Bu, kültürdeki hücre yoğunluğu ya da yaşayan hücrelerin sayısıdır. </li></ol> Hücre Kültürü 4. Virüs Ekstraksiyon <ol><li> Tedavi H. Kaldır Enzim aktivitesini durdurmak için% 0.25 tripsin EDTA ve taze ortam arasında sadece yaklaşık 250 ul kullanılarak 1.8 - Kültür şişelerinden alınan hücreler, vitripennis aşamalarında daha önce tarif edildiği gibi 1.6. </li><li> Süpernatant atın. </li><li> 2.8 - 2.3 &#39;te, daha önce adımda tanımlanan protokol ile kültür hücrelerinden ekstrakte virüs. </li></ol> 5. RNA Ekstraksiyon <ol><li> Üreticinin protokolüne göre, sıvı örnekleri için tasarlanmış bir guanidinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyonu kullanılarak, her bir haftalık deneme sırasında toplanan virüs ortamı örnekleri RNA çıkarmak. </li><li> -80 ° C&#39;de saklayın numuneleri ekstre edilmiştir. </li></ol> 6. RT-PCR <ol><li> Kullanarak geleneksel PCR çalıştırarak RT-PCR için viral standartlar oluşturulmasıprimer çifti HoCV RT-PCR primeri 1 (ileri 5&#39;-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 &#39;-ACGACGGATCTGCGTGCCAA 5&#39;-3, ters&#39;) virüsü ile tüm vücut H. izole vitripennis. </li><li> Konu PCR ürünü,% 0.1 etidyum bromid içeren bir% 2 agaroz jeli içinde, 120 V, 60 dakika boyunca jel elektroforezi için. </li><li> Jelden bantları pulu ve imalatçının protokolüne göre, bir jel ekstre etme kiti kullanılarak saflaştırılması. </li><li> Havuz tüm kesilmiş ve jel ile saflaştırılmıştır ve ürün ayrıca temel etanol presipitasyonu ile saflaştırılması. Genel örnek konsantrasyonunu arttırmak Tris EDTA (TE) içinde yaklaşık 30 ul çökeltme ürünü elute edin. </li><li> Nükleik asit saptama için 260/230 dalga boyu ayarlarını kullanarak spektrofotometre ile toplanmış örneklerin cDNA seviyesini ölçmek. </li><li> 57 ng arasında değişen saflaştırılmış örnekteki bir on-kat daha seri seyreltme serileri sonuçları / 57 ug / ul (10 -18) ul. Benzer seri seyreltme i Me tarif edilen gerçekleştirmen konsantrasyon gereksinimleri farkı için yapılan ayarlamalar 2.8. </li><li> Düşük yoğunluklu transkriptlerin güvenilir bir ölçümü QRT-PCR kiti kullanılarak QRT-PCR gerçekleştirilerek seyreltme serisinin tespiti sınırlarını belirler. NOT: 5 x 10 -3 kopya daha Viral konsantrasyonları daha düşük tespit değildir. </li><li> Adım 5.1 &#39;de daha önce tarif edildiği gibi deneysel numunelerin RNA ekstrakte ve spektrofotometrisi kullanılarak miktarı belirlenir. </li><li> Nükleaz ücretsiz su kullanarak ul / 5 ng tüm ayıklanır örnekleri normalleştirmek. </li><li> Aşağıdaki gibi 25 ul reaksiyonu, düşük kopya sayısını algılamak için yeteneğine sahip tek aşamalı bir QRT-PCR kiti kullanılarak olarak, iki kopya halinde, tüm numunelerde QRT-PCR uygulaması: 50 ° C&#39;de 10 dakika boyunca tutun; 5 dakika boyunca 95 ° C&#39;de tutma; 10 saniye, 30 saniye için 60 ° C 95 ° C 30 döngü; Her adımda 5 saniye 99 ° C - 50 eritebilir. <ol><li> Her bir reaksiyon karışımı, 1 x ustalar 12.5 ul içerir, böylece ana karışımı yapmakR karışımı, ileri primerin 1.0 ul (0.3 uM), ters primer, 1.0 ul (0.3 uM), ters transkriptaz ve standardizasyon değerlerine göre şablon değişken miktarlarda 0.25 ul. </li><li> RNazsız su ile 25 ul toplam reaksiyon hacmi. </li><li> Her bir PCR&#39;nin beş standart konsantrasyonlar, aşağıdaki kopya numaralarıyla birlikte çalışmasını da kapsaması: 5 x 10 -10, 5 cm x 10 -8, 5 x 5 x 10 -4 -6 10, ve 5 x 10 -2 kopyalar. Her çalışma başında erken alımı sırasında gürültüyü azaltmak için, sadece 10x -2.5 bir floresan altına her çalıştırmak için eşik ayarlayın. </li></ol></li></ol> 7. Konfokal Mikroskopi <ol><li> Her iyi çapı 18 mm boyutlarındaki on iki iyi plaka içeren cam lamelleri içinde Homalodisca vitripennis hücreleri büyümek. </li><li> Bir tek-tabakalı elde edildiği zaman, dört günlük bir süre boyunca levha üzerinde her 24 saatte bir sütun inoküle. Her c emin olunolumn iyi bir denetimi içeren, düşük viral seyreltme (1:10) iyi ve yüksek viral seyreltme (1: 100,000) iyi. Adım 2.8 elde virüs çözümleri kullanın. </li><li> Beşinci gününde tüm ortamları çıkarın ve iki kez 1x PBS (pH 7.4) ile hücreleri yıkayın. </li><li> 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de soğuk% 4 paraformaldehit ile hücreleri saptamak. </li><li> 1x Fosfat 500 ul hücrelere serum fizyolojik (PBS) ilave edilmeden önce ilave edin ve düşük hızda bir sallama düzeneği üzerinde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca yıkayın. Hücreleri üç kez yıkayın. </li><li> Bunları permeabilize hücrelerin% 0.1 Triton X-100 500 ul ilave edin. Oda sıcaklığında 10 dakika bekletin. </li><li> Hücreler tekrar yıkama, daha önce tarif edildiği aşama 7.5. </li><li> Oda sıcaklığında hücrelere engellemek için,% 5 sığır serumu albümini (BSA) çözeltisi 500 ul ilave edin. 2 saat boyunca oturup sonra çıkaralım. </li><li> 1x PBS% 5 BSA içeren 250 ve F-aktin leke iyi her seyreltme 250 ul ekleyin: stok Rodamin kırmızı-konjuge Phalloidin (BİP) 1 seyreltin. </li><li> Alüminyum f Kapak plakasıYağ ağartmadan boya önlenmesi ve 4 ° de CO / N inkübe hücreleri. </li><li> 12 saat inkübasyondan sonra, RCP çıkarın ve hücrelerin çekirdekleri leke,% 5 BSA içeren PBS içinde 1x seyreltilmiş 6-diamidino-2-fenilindol 4 250 ul &#39;(DAPI) (250 ug / ml) ile değiştirin . </li><li> 1 saat boyunca oda sıcaklığında DAPI içeren hücreleri inkübe edin. </li><li> Aşamasında önceden tarif edildiği gibi 7,5 1x PBS hücreleri üç kez yıkayın. </li><li> Yavaşça kuyulardan lamelleri çıkarın ve bir anti-solmaya reaktif ile bir montaj medyayı kullanarak slaytlar mikroskop monte. </li><li> Konfokal mikroskop altında inceledi kadar slaytlar kutulara lightproof kurumasını bekleyin. Boyalar hızla solmaya gibi gör kısa sürede hazırlanan slaytlar. </li><li> 63X (yağ) Plan-apochromate lens içeren bir mikroskop ile donatılmış bir konfokal sistemi kullanılarak görüntü lekeli hücreler. <ol><li> 543 ± 10 nm uyarma ve Rhoadmine kırmızı-conjucated Phalloidin için 575 ± 10 nm emisyona lazer dalga boylarını ayarlamaDAPI&#39;nin için, ve 369 ± 10 nm uyarma ve 450 ± 30 nm emisyon. </li><li> Tüm görüntüler elde etmek için dedektör için aynı kazanç ve off-set ayarlarını kullanın. </li><li> Görüntü işleme için uygun bir yazılım kullanarak bir görüntü yönetme yazılımı içine sıralama ve ithalat istenen görüntüleri Süreci görüntüler. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Takiya, D. M., McKamey, S. H., Cavichioli, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validity+of+Homalodisca+and+of+H.+vitripennis+as+the+Name+for+Glassy-winged+Sharpshooter+%28Hemiptera%3A+Cicadellidae%3A+Cicadellinae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Entomol.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Validity of Homalodisca and of H. vitripennis as the Name for Glassy-winged Sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae).</a> Ann. Entomol. Soc. Am. 99 (4), 648-655 (2006).</li>
<li>Hunter, W. B., Katsar, C. S., Chaparro, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+capsid+protein+of+Homalodisca+coagulata+Virus-1%2C+a+new+leafhopper-infecting+virus+from+the+glassy-winged+sharpshooter%2C+Homalodisca+coagulata%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of capsid protein of Homalodisca coagulata Virus-1, a new leafhopper-infecting virus from the glassy-winged sharpshooter, Homalodisca coagulata.</a> J. Insect Sci. 6 (28), 1-10 (2006).</li>
<li>Hunnicutt, L. E., Hunter, W. B., Cave, R. D., Powell, C. A., Mozoruk, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+and+molecular+characterization+of+Homalodisca+coagulata+virus-1%2C+a+novel+virus+discovered+in+the+glassy-winged+sharpshooter+%28Hemiptera%3A+Cicadellidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Genome sequence and molecular characterization of Homalodisca coagulata virus-1, a novel virus discovered in the glassy-winged sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae).</a> Virology. 350 (1), 67-78 (2006).</li>
<li>Hunnicutt, L. E., Mozoruk, J., Hunter, W. B., Crosslin, J. M., Cave, R. D., Powell, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+natural+host+range+of+Homalodisca+coagulata+virus-1+%28HoCV-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Prevalence and natural host range of Homalodisca coagulata virus-1 (HoCV-1).</a> Virology. 153, 61-67 (2008).</li>
<li>Jones, W. A., Setamou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+Biometry+of+Sharpshooter+Homalodisca+coagulata+%28Homoptera%29+Cicadellidae%29+Reared+on+Cowpea%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Entomol.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Biology and Biometry of Sharpshooter Homalodisca coagulata (Homoptera) Cicadellidae) Reared on Cowpea.</a> Ann. Entomol. Soc. Am. 98 (3), 322-328 (2005).</li>
<li>Turner, W. F., Pollard, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+histories+and+behavior+of+five+insect+vectors+of+phony+peach+disease%5BTitle%5D)+AND+%22US+Dep.+Agric.+Tech.+Bull%22%5BJournal%5D)">Life histories and behavior of five insect vectors of phony peach disease.</a> US Dep. Agric. Tech. Bull. 1188, 1-32 (1959).</li>
<li>Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+primary+nutrients+by+the+polyphagous+xylophage%2C+Homalodisca+coagulata%2C+reared+on+single+host+species%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Utilization of primary nutrients by the polyphagous xylophage, Homalodisca coagulata, reared on single host species.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 32, 65-83 (1996).</li>
<li>Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+total+dietary+nitrogen+and+nitrogen+form+on+the+development+of+xylophagous+leafhoppers%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of total dietary nitrogen and nitrogen form on the development of xylophagous leafhoppers.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 42, 37-50 (1999).</li>
<li>Kamita, S. G., Do, Z. N., Samra, A. I., Halger, J. R., Hammock, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Cell+Lines+Developed+from+the+Glassy-winged+Sharpshooter%2C+Homalodisca+coagulata+%28Hemiptera%3A+Cicadellidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro+Cell+Dev.-An%22%5BJournal%5D)">Characterization of Cell Lines Developed from the Glassy-winged Sharpshooter, Homalodisca coagulata (Hemiptera: Cicadellidae).</a> In vitro Cell Dev.-An. 41, 149-153 (2005).</li>
<li>Hunter, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium+for+development+of+bee+cell+cultures+%28Apis+mellifera%3A+Hymenoptera%3A+Apidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro+Cell+Dev.-An%22%5BJournal%5D)">Medium for development of bee cell cultures (Apis mellifera: Hymenoptera: Apidae).</a> In vitro Cell Dev.-An. 46 (2), 83-86 (2010).</li>
<li>Identification and whole extraction of Homalodisca coagulata-virus01. (HoCV-01) from Texas glassy-winged sharpshooter populations. Bextine, B., Hunter, W., Marshall, P., Hail, D. CA Pierce’s Disease Symposium, Sacramento, CA, , 9-12 (2009).</li>
<li>Rhoades, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Economics+of+baculovirus+%E2%80%93+insect+cell+production%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Economics of baculovirus – insect cell production.</a> Cytotechnology. 20, 291-297 (1996).</li>
<li>Briske-Anderson, M. J., Finley, J. W., Newman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+culture+time+and+passage+number+on+the+morphological+and+physiological+development+of+Caco-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Soc.+Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">The influence of culture time and passage number on the morphological and physiological development of Caco-2 cells.</a> P. Soc. Exp. Biol. Med. 214 (3), 248-257 (1997).</li>
<li>Chin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+Rescues+the+Adverse+Effects+of+Telomere+Loss+and+Cooperates+with+Telomere+Dysfunction+to+Accelerate+Carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deficiency Rescues the Adverse Effects of Telomere Loss and Cooperates with Telomere Dysfunction to Accelerate Carcinogenesis.</a> Cell. 97 (4), 527-538 (1999).</li>
<li>Counter, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+shortening+associated+with+chromosome+instability+is+arrested+in+immortal+cells+which+express+telomerase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity.</a> Embo. J. 11, 1921-1929 (1992).</li>
<li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Exp. Cell. Res. 25, 585-621 (1961).</li>
<li>Goetz, I. E., Moklebust, R., Warren, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+some+antibiotics+on+the+growth+of+human+diploid+skin+fibroblasts+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Effects of some antibiotics on the growth of human diploid skin fibroblasts in cell culture.</a> In Vitro. 15 (2), 114-119 (1979).</li>
<li>Coriell, L. L. Methods of prevention of bacterial, fungal, and other contaminations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoriell%2C+LL+%22Contamination+in+Tissue+Culture%22">Contamination in Tissue Culture</a>. Fogh, J. . , Academic Press. 29-49 (1973).</li>
<li>Hambor, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreactor+Design+and+Bioprocess+Controls+for+Industrialized+Cell+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprocess+Tech.+Bull%22%5BJournal%5D)">Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing.</a> Bioprocess Tech. Bull. 10 (6), 22-33 (2012).</li>
<li>Abbot, A., Cyranoski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology%E2%80%99s+new+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biology’s new dimension.</a> Nature. 424, 870-872 (2003).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Istilacı tarımsal türlerin akını ilişkin artan endişeler gelişmekte olan zararlılara ve patojenlere karşı savunmak için yeni metodolojiler için artan bir talep yol var. Hastalık önleme ve yönetim odağı patojen vektörler yönetimini içerir ve bu çalışmanın birincil hedefi oldu. Ekonomi pratik uygulama büyük alanlar üzerinde ancak düşük bir maliyetle 12 de büyük miktarlarda olması gerekiyor, çünkü tarımda karantinası yönetmek için biyolojik zararlı öldürücünün bu tür üretmek için karar hayati bir rol oynamaktadı...

Camsı kanatlı keskin nişancı (Homalodisca vitripennis Germar 1821), Kuzey Amerika&#39;da 1, Xylella fastidiosa (X fastidiosa) baskın bir vektör olarak asma (PD) Pierce hastalığının nedensel ajanı tespit edilmiştir. Böcek nüfus yönetim hızla Kaliforniya ve güney Amerika Birleşik Devletleri genelinde bağcılık sektöründe bu yıkıcı sorunla mücadele için araştırma odağı haline gelmiştir. Familyasına ait olan bir pozitif sens, tek iplikçikli bir RNA virüsü Dicistroviridae, Homalodisca coagulata virüs 01 (HoCV-01), vahşi H. saptanmıştır vitripennis popülasyonları ve böcek için böceğin direncini düşürürken, bu toplumlarda 2-4 ölümleri arttırdığı gösterilmiştir. Yöntemlerin geliştirilmesi etkili arka H. enfekte etmek Bir laboratuar ortamında yetişkinliğe vitripennis çünkü zor olmuştur <em&gt; H. vitripennis ana bitkilerin 5-8 çeşitli gerektiren farklı sahne özgü beslenme ihtiyaçları var. Belirli tesisleri arka canlı H. gerekmektedir Amerika Birleşik Devletleri vitripennis; Bu nedenle hücre kültürü daha ekonomik ve etkili bir alternatif, hem de HoCV-01 tespiti ve çoğaltılması 2,9 giderek önem taşımaktadır. H. hücre kültürlerinin kurulması için temel yöntem ise vitripennis, virüsler 2 gibi, bu yöntemler, yine biyolojik kontrol maddelerinin ticari üretimi için normal olarak kullanılmamış olan, tarif edilmektedir. Aşağıdaki prosedürler genel amacı, biyolojik kontrol maddesi olarak kullanım için müsait HoCV-01 gibi yüksek bir konsantrasyonunun üretmektir. Viral replikasyon neden başarılı H. yetiştirilmesi ve optimize bir canlı hücre gerektirir vitripennis kültürler virüs karlı seviyelerini üretme ilerleme için hayati önem taşımaktadır.

<table><tbody><tr><td>Corning hücre kültürü şişeleri</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430168</td><td>Yüzey alanı 25 cm2, eğimli boyun, kapak (tapa contası)</td></tr><tr><td>Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71</td><td>Olympus</td><td></td><td>Ters mikroskop ve kamera</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA çözeltisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049</td><td>%0,25, steril filtreli, BioReagent, hücre kültürüne uygun, 2,5 g domuz tripsin ve 0,2 g EDTA & boğa; Hanks & prime litre başına 4Na; Fenol kırmızısı ile Dengeli Tuz</td></tr><tr><td>Çözeltisi Greiner CELLSTAR çok kuyulu kültür plakaları</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8937</td><td>48 kuyu (TC kapakla işlenmiş)</td></tr><tr><td>DETCA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>228680</td><td>Sodyum dietilditiokarbamat trihidrat</td></tr><tr><td>Corning şişe üstü vakum filtre sistemi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS431206</td><td>Selüloz asetat membran, gözenek boyutu 0.45 &mu; m, membran alanı 54,5 cm2, filtre kapasitesi 500 ml</td></tr><tr><td>Brij 52</td><td>Sigma Aldrich</td><td>388831</td><td>Polietilen glikol hekzadesil eter</td></tr><tr><td>Fosfat tampon çözeltisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5244</td><td>Steril su ile 10 mM'ye seyreltilmiş 100 mM olarak alındı</td></tr><tr><td>TRIzol LS</td><td>Life Technologies</td><td>10296-028</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5304</td><td>İçin elektroforez</td></tr><tr><td>Etidyum bromür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7637</td><td>BioReagent, moleküler biyoloji için, toz</td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect qRT-PCR kiti</td><td>Qiagen</td><td>204243</td><td></td></tr><tr><td>%4 paraformaldehit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Reaktif sınıfı, kristal</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368</td><td>Fosfat tamponlu salin</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine kırmızı konjuge falloidin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>R415</td><td>Rhodamine phalloidin, kırmızı-turuncu floresan boya, tetrametilrodamin DAPI Sigma Aldrich D9542 ile konjuge edilmiş yüksek afiniteli bir F-aktin probudur</td></tr>.<tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ProLong Altın Antifade Reaktifi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>LSM510 Meta Konfokal Sistem</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM Zen 2007 Yazılımı</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grace' s Böcek ortamı (takviyeli, 1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8142</td><td>H2G+ yaprak zararlısı orta bileşeni</td></tr><tr><td>L-histidin monohidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8125</td><td>H2G+ yaprak zararlısı orta bileşen</td></tr><tr><td>Orta 199 (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4530</td><td>H2G+ yaprak zararlısı orta bileşen</td></tr><tr><td>Orta 1066 (1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0422</td><td>H2G+ yaprak zararlısı orta bileşen</td></tr><tr><td>Hank' s Dengeli Tuzlar (1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51322C</td><td>H2G+ yaprak zararlısı orta bileşenli</td></tr><tr><td>L-Glutamin (100x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G3126</td><td>H2G+ yaprak zararlısı orta bileşenli</td></tr><tr><td>MEM, amino asit karışımı (50x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56419C</td><td>H2G+ yaprak zararlısı orta bileşen</td></tr><tr><td>1 M MgCl çözeltisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>H2G+ yaprak zararlısı orta bileşenli</td></tr><tr><td>Pen-Strep (w/ glutamin)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G6784</td><td>H2G + yaprak zararlısı orta bileşen</td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N6261</td><td>H2G + yaprak</td></tr> zararlısı orta bileşen <tr><td>Gentamisin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46305</td><td>H2G + yaprak zararlısı orta bileşen</td></tr><tr><td>Dekstroz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>H2G + yaprak zararlısı orta bileşen</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td>H2G+ yaprak zararlısı orta bileşen</td></tr></tbody></table>

yayılması<em&gt; homalodisca coagulata virüs 01</em&gt; yoluyla<em&gt; homalodisca vitripennis</em&gt; hücre kültürü

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Camsı kanatlı keskin nişancı (Homalodisca vitripennis) güneybatı Amerika Birleşik Devletleri boyunca bulunan bir çok vagile ve polifag böcek türüdür. Bu böcekler Xylella fastidiosa (X. fastidiosa) baskın vektörleri, asmanın Pierce hastalığı (PH) nedensel ajan bir ksilem sınırlı bakteri vardır. Pierce&#39;ın hastalığı ekonomik zarar olduğunu; Bu şekilde, H vitripennis patojen yönetimi stratejileri için bir hedef haline gelmiştir. Homalodisca coagulata virüs-01 (HoCV-01) olarak tanımlanan bir dicistrovirus H. mortalite artışı ile ilişkili olduğu vitripennis popülasyonları. Bir konakçı hücre HoCV-01 replikasyonu için gerekli olduğundan, hücre kültürü lojistik ve biyolojik böcek öldürücü soyu üretimi için ekonomik açıdan önemli olan çoğaltma hedef için tek tip bir ortam sağlar. Bu çalışmada, H. büyük ölçekli üretimi için bir sistemde Doku kültürü ile vitripennis hücreleri geliştirildi, sViral replikasyon mekanizması roviding. HoCV-01 tüm vücut böceklerden çıkarılabilir ve kültür H&#39;yi inoküle etmek için kullanıldı çeşitli seviyelerde vitripennis hücreleri. Kültür ortamı 168 saat, RNA ekstre edilmiş ve QRT-PCR ile analiz için her 24 saatte uzaklaştırılmıştır. Hücreler, tripan mavisi ile boyandı ve ışık mikroskopisi kullanılarak hücre hayatta kalma ölçmek için sayıldı. Tüm virüs parçacıkların toplam hücre kültürü çöküşü oluşmadan önce olduğu tespit edilen bir zaman noktasında olduğu enfeksiyondan sonra 96 ​​saat, kadar ekstre edilmiştir. Hücreler aynı zamanda floresan boyama tabi ve F-aktin bağlanma ve çekirdekler bütünlüğü viral aktivitesini araştırmak için konfokal mikroskopi kullanılarak incelendi. Bu çalışmanın sonuç olduğunu H. vitripennis hücreleri kültive edilip, bir biyolojik zararlı öldürücünün üretimine olanak sağlamak üzere müsait bir seviyede HoCV-01 kitle üretimi için kullanılan olma yeteneğine sahiptirler.

Hücre bağlanma ve büyüme primer kültürlerinde ve sürekli geçişlerinden, hem küçük hem de büyük bir kültür şişelerinde geçidinin 48 saat içinde görülmüştür. Fibroblast büyüme ve gelişme de bu süre içinde gözlenmiştir. Yeni seribaşı şişeler 48 saat önce rahatsız edildiğinde, orada, hücre eki görülür bir düşüş oldu, bazen yavaş büyüyen kültürlerde ve tüm hiçbir ek veya büyüme lider. Hücreler geçen bir hafta içinde, yaklaşık% 80 birleşmeye ve 10-14 gün (Şekil 1) bir tek tabaka oluşturulmuştur. Bu çalışmanın...

Burada in vitro Homalodisca vitripennis hücreleri ve HoCV-1 yaymak için bir protokol mevcut. Orta HoCV-1 pozitif kültürlerden çıkarıldı ve RNA 168 saat süre ile, her 24 saat ekstre edilmiştir. Hücre yaşayabilirliği tripan mavi ile nicelendirildi. Tüm virüs parçacıkları sonrası enfeksiyon ekstre edildi. Çıkarılan RNA QRT-PCR ile belirlenmiştir.

Yayılması<em&gt; Homalodisca coagulata virüs 01</em&gt; Yoluyla<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Hücre Kültürü

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, Homalodisca coagulata virus one veya HOCV-one'ın Homalodisca vitripennis hücre kültürleri kullanılarak çoğaltılıp çoğaltılamayacağını ve ardından daha sonraki aşamalarda kullanılmak üzere ekstrakte edilip edilemeyeceğini belirlemektir. Bu, replikasyon için saflaştırılmış HOCV-one'ın aktarıldığı H. vitripennis hücrelerinin başarıyla kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, virüs içeren besiyeri ve hücreler kültürden uzaklaştırılır ve ardından virüs ve RNA ekstraksiyonuna tabi tutulur.Ardından, enfekte kültürlerden ekstrakte edilen RNA, hücrelerde viral RNA bulunup bulunmadığını belirlemek amacıyla PCR'ye tabi tutulur. Sonuçlar; enfeksiyon öncesi ve sonrası canlı hücre sayımlarına ve qRT-PCR analizine dayanarak, HOCV one'ın in vivo replike olabildiğini göstermektedir.Bu tekniğin, enfekte canlı böceklerin yetiştirilmesi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, daha ekonomik olması ve minimum tesis ve ekipmanla kolayca yönetilebilmesidir. Bu yöntemin kullanımı, biyolojik kontrol alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, bir böcek virüsü veya belirli bir böcek türüne özgü bir virüs, bir zararlıyı geniş ölçekte kontrol etmek için kullanılabilir mi?Bu yöntem, söz konusu böceğin yönetimi hakkında bilgi sağlayabilmenin yanı sıra, HOCV ile aynı aileden bir virüs kullanılarak kırmızı ithal ateş karıncalarının yönetimi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu prosedüre başlamadan önce, modifiye edilmiş bir WH-iki bal arısı besiyeri olan H2G artı yaprak biti besiyeri kullanarak 25 santimetrekarelik doku kültürü flasklarında kültürler oluşturun ve bunları sürdürün. Virüs pozitif H. vitripennis'in tüm vücutlarını, %0,02 DETCA içeren fosfat tamponu içinde, büyük doku kümeleri kalmayana kadar yaklaşık on saniyelik aralıklarla vorteksleyerek homojenize edin. Virüsü, 4 °C'de 16 saat boyunca 22.000 g'de süper hızlı santrifüj aracılığıyla ekstre edin.Süpernatan uzaklaştırıldıktan sonra peleti toplayın ve 0,4% sodyum deoksikolik asit ve %4 polietilen glikol heksa-desal eter içeren 5 mL 10 mM fosfat tamponu ile çözün. Peleti iyice karıştırmak için tüpün kenarından ayırın ve gerekirse ezin. 300 g'de 15 dakika boyunca santrifüj işlemini gerçekleştirin. Süpernatanı uzaklaştırın, ardından çözeltiyi 0,45 µm'lik bir filtreden geçirin ve süzüntüyü geniş bir toplama tüpüne aktarın.Filtratı, gerekirse DETCA içermeyen küçük miktarlarda 10 millimolar fosfat tamponu kullanarak, 3.5 kilodalton moleküler ağırlık kesim değerine sahip bir diyaliz membranına aktarın. Diyaliz membranını, dört degrees Celsius sıcaklıkta çift distile su ile doldurulmuş büyük bir behere yerleştirin. Membran içinde beyaz bir çökelek oluşana kadar beş ila altı saat boyunca suyu her saat başı değiştirin. Bu aşamada, 48 kuyucuklu kültür plaklarına hücre ekimi yapın.Hücre büyümesi %80 konfluens düzeyine ulaştığında, her bir hücre sırasını seri dilüsyona tabi tutulmuş virüs ile inoküle edin. Ardından, hacim kontrolü olarak her kuyucuğa 10 µL çift distile su ekleyin. Deneysel hücre sayımlarıyla karşılaştırmak üzere başlangıç temel hücre konsantrasyonunu belirlemek için, kültürlerdeki herhangi bir kuyucuğun ilk virüs inokülasyonundan önce her sıranın ilk kuyucuğundaki hücreleri disosiye edin. Ardından hücreleri sayın.Ardından, her 24 saatlik zaman noktasında görüntülenen kolondaki tüm besiyerini uzaklaştırın ve RNA ekstraksiyonu ile viral kantifikasyon için -20 °C'de saklayın. Daha önce açıklanan protokolü takip ederek kültür hücrelerinden virüs ekstraksiyonunu gerçekleştirdikten sonra, üretici protokolüne uygun olarak sıvı örnekler için tasarlanmış guanidinyum tiyosiyanat fenol kloroform ekstraksiyonu kullanarak her bir haftalık virüs denemesi sırasında toplanan besiyeri örneklerinden RNA ekstrakte edin. RT PCR için, tüm vücut H. vitripennis virüs izolatı ile HOCV RT PCR primer-bir primer çiftini kullanarak geleneksel PCR çalıştırarak viral standartlar oluşturun.Bunu takiben, saflaştırılmış numunenin mikrolitre başına 57 nanogramdan mikrolitre başına 57 attograma kadar değişen on katlı seri dilüsyon serisini gerçekleştirin. Dilüsyon serisinin saptama sınırlarını, düşük bolluktaki transkriptlerin güvenilir kantifikasyonunu sağlayan bir qRT-PCR kiti kullanarak qRT-PCR ile belirleyin.Daha önce açıklandığı gibi deneysel örneklerden RNA ekstre ettikten sonra, spektrofotometri kullanarak miktar belirlemesi yapın. Ardından, düşük kopya sayılarını saptama yeteneğine sahip tek aşamalı bir qRT-PCR kiti kullanarak tüm örneklere 25 microliter reaksiyonlar halinde düplike qRT-PCR uygulayın. Her bir reaksiyon karışımı 12.5 microliters one x master mix, 1.0 microliters 0.3 micromolar ileri primer, 1.0 microliters 0.3 micromolar geri primer, 0.25 microliters ters transkriptaz ve standardizasyon değerlerine dayalı değişken miktarlarda kalıp içerecek şekilde master mix hazırlayın. Ardından, toplam reaksiyon hacmini RNaz içermeyen su ile 25 microliters seviyesine tamamlayın. Her PCR çalışmasına 5 × 10⁻¹⁰, 10, 5 × 10⁻⁸, 5 × 10⁻⁶, 5 × 10⁻⁴ ve 5 × 10⁻² kopya olmak üzere beş standart konsantrasyon ekleyin. Her çalışmanın başlangıcındaki erken veri toplama sırasında gürültüyü azaltmak için, her çalışma için eşik değerini 10 × 10⁻².⁵ floresan değerinin hemen altına ayarlayın.Homalodisca vitripennis hücreleri cam lamel içeren 12 kuyucuklu bir plakada büyütüldükten sonra, ekstrakte edilen virüs ile tek tabaka oluştuğunda, dört gün boyunca her 24 saatte bir sütunu inoküle edin. İşlem tamamlandığında, hücreleri dört santigrat derecede 30 dakika boyunca soğuk %4 paraformaldehit ile fikse edin. Ardından hücrelere 500 microliters 1X PBS ekleyin ve düşük hızda bir sarsıcının üzerinde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca yıkayın. Hücreleri üç kez yıkadıktan sonra, hücreleri permeabilize etmek için 500 microliters %0,1 TritonX-100 ekleyip 10 dakika bekleyin.Hücreler 1X PBS ile yıkandıktan sonra, hücreleri oda sıcaklığında bloke etmek için 500 microliters %5 sığır serum albümin çözeltisi ekleyin. İki saat sonra çözeltiyi hücrelerden uzaklaştırın. Ardından, f-aktin boyaması yapmak için her kuyucuğa 250 microliters seyreltilmiş stok rhodamine-red konjuge Phalloidin çözeltisi ekleyin. Boyanın solmasını önlemek için plakayı alüminyum folyo ile kapatın ve hücreleri dört degrees Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından rhodamine çözeltisini uzaklaştırın ve hücre çekirdeklerini boyamak için bunun yerine %5 BSA içeren 1X PBS içinde seyreltilmiş 250 microliters DAPI ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında bir saat inkübe ettikten sonra, daha önce açıklandığı gibi 1X PBS ile üç kez yıkayın.Son olarak, lamelleri kuyucuklardan nazikçe çıkarın ve Antifade reajenti içeren bir montaj medyumu kullanarak mikroskop lamlarına monte edin.Hücre tutunması ve fibroblast gelişimi, küçük ve büyük kültür flasklarında pasaj sonrası 48 saat içinde gözlemlendi. Yeni ekim yapılmış flasklar sarsıldığında, hücre tutunmasında bir azalma meydana gelmiş; bu durum kültürlerin daha yavaş büyümesine ve bazen hiç tutunma veya büyüme olmamasına yol açmıştır.Hücreler bir hafta içinde yaklaşık %80 konfluens seviyesine ulaştı ve 10 ila 14 gün içinde bir monolayer oluşturdu. Enfekte kültürler, hücre şekli bütünlüğünün azaldığına dair belirtiler gösterdi ve enfeksiyondan 48 saat sonra hücre yüzeylerinde büyük boşluklar olduğu görüldü. Seyreltilmemiş HOCV-one ile enfekte edildikten yaklaşık 72 ila 96 saat sonra hücreler büzüldü ve kültür yüzeyinden ayrıldı. Zaman içinde farklı viral yükler arasındaki canlı hücre bolluğu farklarını betimlemek için ortalama canlı hücre sayıları grafiğe döküldü. Daha yüksek viral uygulama grupları, 48 ila 72 saat arasında canlı hücrelerde meydana gelen büyük düşüşle birlikte, kültür sağlığında çok daha belirgin bir gerileme göstermektedir. Daha düşük viral gruplar ise yaklaşık 144 saate kadar yavaşça gerilemiştir. Yüksek viral uygulamalarla inoküle edilen hücrelerin sağkalım olasılığı, Kaplan Meyer eğrileri ile test edildiğinde daha düşük çıkmış ve bu durum ortalama canlı hücre sayısı analizleriyle korelasyon göstermiştir. Anlamlı olmasa da veriler, virüse maruz kalan hücrelerin zaman içinde daha düşük sağkalım oranları sergileme olasılığının %88 daha fazla olduğunu göstermektedir. HOCV-one'a maruz kalan hücrelerdeki çekirdek sayısının azalması ve f-aktinin şekilsiz görünümü, kültür üzerinde majör bir etki olduğunu göstermektedir.10 kat daha yüksek viral yüke maruz kalan sağlıklı hücreler daha fazla stres göstermiştir. Bu prosedürü uygularken, bazı adımlar zaman ve sıcaklığa duyarlı olduğundan, protokoldeki her adımın zamanında tamamlanmasının önemli olduğunu unutmamak gerekir. Bu prosedürün ardından, örneğin, bir hücre kültürüne farklı miktarlarda virüs inoküle edildikten sonra o hücre kültüründe ne kadar virüs bulunduğu gibi temel soruları yanıtlamak için ELISA gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, bir RNA virüsünü replike etmek için böcek hücresi hattının nasıl kullanılacağı, bu virüsün nasıl ekstrakte edileceği ve ardından qRT-PCR kullanılarak nasıl miktarının belirleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

propagation-homalodisca-coagulata-virus-01-via-homalodisca

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video floxed Rac1 allel taşıyan birincil fare embriyonik fibroblastlar bulaştırmak için Cre recombinase gen taşıyan bir adenovirüs kullanın.

Kültür İlköğretim Fare Embriyonik Fibroblastlar Sinyal Molekülleri Adenovirüs aracılı Genetik Kaldırma

Biz süreci için bir metodu tanımlar ve ekran alanında toplanan Vero hücre kültürü yöntemi ile virüs bir çeşitliliğe sivrisinekler. Bu tekniği kullanılarak, Connecticut toplanan sivrisinek 4 taksonomik ailelerden gelen 9 farklı virüsler tespit ettik.

Vero Hücre Kültür Testi ile Alan toplanan Sivrisinekler Enfeksiyon Virüs Algılama

Source: Jamieson, T. R., et al. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the procedure for infecting mammalian cells with green fluorescent protein (GFP)-encoding pseudovirus, monitoring viral replication and spread by fluorescence microscopy, and collecting virus-containing supernatant for downstream applications.

Production and Collection of Pseudovirus Particles Using Mammalian Cell Culture

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the propagation and harvesting of oncolytic herpes simplex virus in mammalian cell cultures, highlighting viral entry, replication, and the recovery of virus-loaded cells. It further shows methods for preserving infected cells for downstream processing.

Propagation and Harvesting of Oncolytic Herpes Simplex Virus in Mammalian Cells

Source: Huang, D., et al. Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the step-by-step procedure for the in vitro isolation of mosquito-associated viruses from mosquito homogenates using fibroblast-like mammalian cells.

Isolation of Mosquito-Associated Virus from Mosquito Homogenate

Vaccinia virüsü (W), yaygın olarak biyomedikal araştırmalar ve insan sağlığının iyileştirilmesi kullanılmıştır. Bu makalede, bir CRISPR-Cas9 sistemini kullanarak VV genom düzenlemek için basit, yüksek verimli bir yöntem açıklanır.

Basit ve Etkin Yaklaşım Mutant Vaccinia Virüs Vektörler Construct

Hindi (galiba yüksek değerli hedef) Herpesvirus yaygın bir vektör platform olarak kuş hastalıkların bir dizi karşı rekombinant aşı üretimi için kullanılır. Bu makalede bir entegre NHEJ-CRISPR/Cas9 ve Cre-Lox sistemi kullanılarak rekombinant galiba yüksek değerli hedef yönlendirdik aşı üretimi için basit ve hızlı bir yaklaşım açıklar.

Rekombinant kuş Herpesvirus vektörleri ile CRISPR/Cas9 üreten gen düzenleme

Bu iletişim kuralı, viral enfeksiyon vivo içinde virüs ana bilgisayar etkileşimi analiz için nano-enjeksiyon yöntemi ve temel teknikleri kullanarak Drosophila melanogaster içinde kurmak açıklar.

Viral enfeksiyon ve analiz Drosophila Melanogaster ana bilgisayar virüs etkileşimin kurulması

Bu protokol, iki influenza A suşlarından zarf glikoproteinleri ile yüksek titreyen enfeksiyöz viral psödotipli parçacıklar (pp) üretmek için deneysel bir süreci ve bunların enfekteliğini nasıl belirleyeceklerini açıklamaktadır. Bu protokol, farklı zarf glikoproteinleri ile zarflı virüslerin herhangi bir tür pps geliştirmek için son derece uyarlanabilir.

Yüksek Patojenik H5N1 ve Kuş H7N9 Virüslerinden Zarf Glikoproteinleri Ile Yüksek Titer Enfeksiyöz İnfluenza Pseudotyped Partiküllerin Üretimi

Burada açıklanan hepatit E virüsü (HEV) yüksek viral titresi üretmek için nasıl etkili bir yöntemdir verimli hepatoma hücreleri enfekte etmektir. Sunulan yöntemle, hem zarfsız, hem de zarflı viral parçacıklar hasat edilebilir ve çeşitli hücre hatları aşılamak için kullanılabilir.

Yüksek Titer Hepatit E Virüs Stokları Üretmek için Bir Hücre Kültürü Modeli

Dizileme teknolojilerinin yaygın kullanımı nedeniyle sivrisineklerde çok sayıda yeni virüs benzeri sekans bulunmuştur. Omurgalı ve sivrisinek hücre hatlarını kullanarak virüsleri izole etmek ve büyütmek için etkili bir prosedür sunuyoruz; bu, sivrisinek kaynaklı ve sivrisineğe özgü virüsler de dahil olmak üzere sivrisinekle ilişkili virüsler üzerine gelecekteki çalışmaların temelini oluşturabilir.

Sahada Toplanan Sivrisineklerden Sivrisinek İlişkili Virüs İzolasyonu

Keşfedin Homalodisca vitripennis hücre kültürlerinde HoCV-1 virüsünün replikasyonunu ve RNA ekstraksiyonu ile kantitatif analiz yöntemlerini. Bu protokol virüs-sıcak etkileşimlerini anlamak için güvenilir bir in vitro model sunar.

Yayılması

Daha fazla video keşfet