Vibratome Kesit Fare Retina fotoreseptör Kültürler hazırlayın

Bu prosedürün genel amacı, fare fotoreseptör katmanını izole etmektir. Kültürleme için ilk adım, tam bir düz retina elde etmek ve onu bir jelatin blok üzerine mühürlemektir. Daha sonra, fotoreseptör tabakasını izole etmek için retina tabakaları başarıyla kesilir.

Son adım, kültürde saflaştırılmış fotoreseptör hücrelerini tohumlamaktır. Sonuç olarak, fotoreseptör tabakasının saflığı mikroskopi ve immünofloresan ile doğrulanır, ardından çubuktan türetilmiş koni canlılık faktörü testi yapılır. Bu tekniğin lazer mikro diseksiyon gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, fotoreseptör tabakasını güvenle izole etmesidir.

Bu teknolojinin etkileri, kalıtsal retina dejenerasyonunun tedavisine kadar uzanır. Fotoreseptör biyolojisini incelemek çok uygun olduğundan, başlangıçta çubuk ve soğuk fotoreseptörler arasındaki hücresel etkileşimi incelemek için bu yöntemi geliştirmiştik. Katman fotoreseptörünün erken bir marın gözüne nakli, türetilmiş tüm uyumluluk faktörlerinin tanımlanmasına yol açmıştır.

Bu yöntemlerin görsel olarak gösterilmesi kritiktir, çünkü düz dağ retinasının fırsatının gerçekleştirilmesi zordur, çünkü zordur. Retinayı izole etmeden önce vibratoyu hazırlayın. Dört santigrat derecede depodan çıkarılan% 20 jelatin çözeltisi bulaşıkları ile başlayın.

Jelatini bir neşterle kesin, ardından jelatin dilimini çevirin ve bir damla süper yapıştırıcı kullanarak vibratörün siyah destek diskine yapıştırın. Ardından, bir tıraş bıçağını ikiye bölün ve bir yarısını vibratöre yerleştirin. Ardından siyah destek diskini vibratör aparatına yerleştirin ve siyah düğmeyi sağa çevirin.

Şimdi, tutma kabını vibrato'nun kafasına sabitleyin ve jelatin bloğu CO2'den bağımsız bir ortamla kaplayın. Kurulumu test etmek için vibratoyu açın. Dilimleme pürüzsüz olana ve düz dilimler elde edilene kadar 100 mikronluk üç dilim kesin.

Gözleri bir fareden ve diğer preparatlardan topladıktan sonra retinayı izole edin. İlk olarak, göz uzuv seviyesinde bir delik açmak için 18 gauge bir iğne kullanın. Daha sonra siliyer gövdeyi çıkarmak için, delikten ve göz küresine düz makas sokun ve sklerayı irisin altından ve ardından oküler kürenin çevresi boyunca dikkatlice kesin.

Daha sonra, retina skleraya bitişik olacak şekilde gözün arka tarafını tutun ve kornea ile lensi çıkarın. İki ince kavrama ile, retinaya zarar vermeden retinaya bağlı olan vitreusu çıkarın, böylece retina düz bir şekilde yatırılabilir. İçinde dört radyal kesim yapın.

Şimdi oküler küreyi ters çevirin ve portakal gibi soyun. Sonra, ince düz makasla çok dikkatli bir şekilde. Retinayı sklera ve retina pigmentli epitelden ayırın.

İnce çeneler kullanılarak optik sinir hizasında yapışık kalmalı, kalan vitreusu periferden başlayarak retinanın merkezine doğru ilerleyerek çıkarmalıdır. Tüm vitreus tamamen çıkarıldığında, retina düzleşecektir. Şimdi retinayı 35 milimetre çapında bir Petri kabına aktarın.

Düz retinayı jelatin blokta mühürleme işlemi hassastır ve temelde dokuyu kesitlere ayırmanın en zorlu yönüdür. İlk olarak, vibram tankından 20 ila 30 mililitre ortam çıkarın. İkinci olarak, retinayı plastik geniş delikli bir pipet kullanarak bir cam slayta aktarın ve slayta bir damla CO2 bağımsız ortam uygulayın.

Üçüncü olarak, retinayı bir fotoreseptör aşağı bakacak şekilde bir jelatin dilimine aktarın. Dördüncüsü, retinayı jelatin bloğa takın. Retina ile jelatin blok arasındaki bloğun bir tarafına nazikçe ılık% 4 jelatin enjekte edin ve jelatini diğer tarafa atın.

Son olarak, jelatini bir cam pipetle aspire edin ve retina bloğa kapatılana kadar yedi ila 10 dakika bekleyin. Şimdi CO2'den bağımsız ortamı tanka geri ekleyin ve jelatin bloğun üstünden başlayarak bölümlere ayırmak için bloğu ve bıçağı daldırın. Bıçak retinaya ulaşana kadar 100 mikronluk seri kesitler kesin.

Daha sonra çok yavaş bir hız kullanarak, bir veya iki tane retinanın iç tabakasının 100 ila 120 mikronluk bölümlerini kesti. Uygulamaya bağlı olarak, bu katman, iç ve dış katman arasındaki arayüzde hızı yavaş tutarak atılabilir veya sıvı nitrojen içinde saklanabilir. 15 mikronluk kesitler alın.

Bu bölümleri kan damarlarının varlığı için mikroskop altında inceleyin. Hiçbiri olmadığında, dış tabakadan dış retinaya ulaşılmıştır. 200 mikronluk kesitleri yavaşça kesin.

Bu dilimleri, buz üzerinde tutulan üç mililitre soğuk, CO2'den bağımsız ortam ile 35 milimetrelik bir tabağa aktarın. Bu çanağa bölümlere ayrılacak tüm retinalardan tüm fotoreseptör tabakası bölümlerini toplamaya devam edin. Dilimlenmiş fotoreseptörleri 10 dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatöre aktarmakla başlayın.

Daha sonra forseps kullanarak, her bir fotoreseptör katmanını jelatinden nazikçe ayırın ve bunları oda sıcaklığında üç mililitre zil çözeltisi ile doldurulmuş yeni bir tabağa aktarın. Tüm fotoreseptörler jelatinden izole edildikten sonra, iki ünite papain'i steril beş mililitrelik bir polipropilen tüpte 25 mikrolitre aktivatör çözeltisi ile birleştirin ve 30 dakika inkübe edin. Bu inkübasyon sırasında papain'i aktive etmek için, fotoreseptör katman dilimlerini iki milimetre kare parçaya bölün ve çok daha küçük olmayacak şekilde kesin.

Bu parçaları 1,5 mililitre zil çözeltisi ile beş mililitrelik bir tüpe aktarın. Ardından zilleri aspire edin ve ikinci bir yıkama için değiştirin. Tüm dilimlerin yerçekimi, çökeltme ile çökelmesini bekleyin ve ardından kalan tüm zil çözeltisini tüpten çıkarın.

Daha sonra, aktive edilmiş papain içeren tüpe 475 mikrolitre zil çözeltisi ekleyin ve karıştırın. Bu karışımı dilimleri içeren tüpe aktarın ve 20 dakika inkübe edin. 20 dakika sonra, DMEM'e bir mililitre% 10 FCS ekleyerek papain sindirimini durdurun.

Daha sonra, ölen fotoreseptör hücrelerinden DNA'yı sindirmek için 25 ünite D N.One ekleyin, fotoreseptör hücrelerini damak tadına almak için süspansiyonu pipetleme ile dikkatlice homojenize edin. Tüpü oda sıcaklığında altı dakika boyunca 115 Gs'de döndürün, süpernatanı atın ve bir mililitrelik bir pipet kullanarak takviye edilmiş DMEM'deki hücreleri yeniden süspanse edin. Bunu tekrarlayın, sıkın ve tekrar süspansiyon. Bir kere.

Şimdi hasat edilen gözden bir ila 1,5 milyon hücre tohumlanmaya hazır olmalıdır. Onları santimetre kare başına 100.000 hücrede tohumlayın ve aşağı akış uygulamalarından önce beş gün boyunca kültürleyin Açıklanan yöntemleri kullanarak, fotoreseptör hücrelerinin kültürleri, doğum sonrası sekizinci günde vahşi tip farelerden yapıldı. FCS olmadan, hücreler sabitlendi ve anti row veya daha erken bir markör anti sarkma için boyandı.

SAG, ROE ekspresyonundan önce geldiğinden, daha az hücre anti row için pozitifti. Fotoreseptörler ayrıca mRNA, RO sarkması ve GA iki transdükleyici koni ekspresyonunu incelemek için 35 günlük farelerden hazırlandı. Bu genler, tüm beyne kıyasla fotoreseptörlerde en belirgin şekilde ifade edilir.

G NAT iki, özellikle koniler ile ifade edilir. Fotoreseptörlerdeki RO ve g. NAT iki'nin protein ekspresyonu, fotoreseptör tabaka hücreleri ile iç retinal tabaka hücreleri karşılaştırılarak incelendi.

Bu, vahşi tip ve RD mutant fareleri ile yapıldı. Mutant fareler, 35. günde her iki proteinin de ekspresyonunu göstermedi. Bu videoyu izledikten sonra, uygun bir saflaştırılmış fotoreseptör tabakasının nasıl elde edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Bu teknik, bu prosedürü takiben uygun şekilde yapılırsa, dört ila sekiz retina için yaklaşık beş ila altı saat içinde yapılabilir. Ayrıca, fotoreseptörlerin dejenerasyonu sırasında protein ekspresyonu gibi ek soruları cevaplamak için batı kanı gibi yöntemler de uygulanabilir. Bu teknik, retina biyolojisi alanındaki araştırmacıların ilgili hayvan modellerinin transkriptini, proteomunu ve metabolizmasını incelemesinin yolunu açtı.