Name: Vibratome Kesit Fare Retina fotoreseptör Kültürler hazırlayın (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Öğrenin fare retinasından fotoreseptör tabakasını izole etmek için vibratome kesit yöntemini. Bu teknik, retinal hastalıkların tedavisi için hücre kültürü ve interaksiyon çalışmalarına olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Anti-SAG antikorları için Igal Gery ve David Hicks. Ram Fridlich el yazmasını okuduğu için.

NOT: yordam Üniversite Pierre ve Marie Curie (/ 2009/048 CE5) den etik komitesi Darwin tarafından onaylanmış Jelatin Çözüm, Aletler, Vibratome, Kültür Medya ve Kültür Plate 1. Hazırlık <ol><li> En az bir gün önce deney bir% 20 jelatin çözeltisi hazırlayın. <ol><li> Kapağın altında, CO2 bağımsız ortamı ihtiva eden 500 ml&#39;lik bir şişe (CO2 i) için gentamisin [10 mg / ml], 500 ul ilave edin. </li><li> Ayrı bir kabta 15 dakika boyunca sürekli karıştırma ile bir ısıtma bloğu üzerinde 95 ° C &#39;de ve ısı (aşama 1.1.1), CO2-I 20 ilave edin. Çözelti daha sonra kullanılmak üzere hazır olduğuna işaret ederek, sarı bir renk almasına neden dikkate alınmalıdır. </li><li> San renkli bir çözelti elde etmek, 45 dakika boyunca 95 ° C &#39;de daha fazla bir karıştırma ve ısıtma ile yukarıda hazırlanan çözelti (aşama 1.1.2) 4 jelatin g ve yavaş yavaş zayıf tartılır. Jelatin çözüm altına soğumasını bekleyinYaklaşık 5 dakika kaput. </li><li> Hava baloncuklarının oluşumunu olmayan bir 35 mm çaplı kültür tabakalarına jelatin solüsyonu 4 ml dökün. 30 dakika boyunca 21 ° C &#39;de çanak tutun. Plastik film ile yemekleri Kapak ve baş aşağı çevirin yemekleri. İsteğe bağlı olarak, kullanım öncesi, 2 ay için 4 ° C&#39;de yemekler saklayın. </li></ol></li><li> % 4 jelatin çözeltisi hazırlayın. <ol><li> Kapağın altında bir ısıtma bloğu üzerinde 42 ° C&#39;de CO2 -i steril plastik bir kap içinde orta ve ısı 25 ilave edin. Isıtma bloğu orta çıkarın ve yavaş yavaş sıcak orta ve heyecan için jelatin 1 g ekleyin. Hızla ısıtma bloğu (42 ° C) kabı dönmek ve sürecinde sıcak tutmak. </li></ol></li><li> Ayarlama makyaj vibratome cihazı: <ol><li> 4 ° C&#39;de saklandı% 20 jelatin çözeltisi içeren yemekler çıkarın. Bir neşter ile jelatin kesin. Jelatin dilim çevirin ve s bir damla kullanarak vibratome siyah destek disk üzerinde sopauper tutkal. </li><li> Ikiye bir jilet kırın ve vibratome tutan yuvaya yarısı yerleştirin. Vibratome aparat üzerine siyah destek diski takın. Sağ tarafına siyah topuzu açın. Vibratome başkanı tutarak yuvasını Fix. Jelatin blok kapsayacak vibratome tankında CO2 -i ortamın yeterli miktarda ekleyin. </li><li> Vibratome açın ve jelatin bloğun üç 100 mikron dilim kesti. Daha fazla kullanım için jelatin blok tutun. </li></ol></li><li> Kültür ortamında 40 ml hazırlayın: <ol><li> Başlık ile fetal dana serumu (FCS) ve% 10 Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) hazırlayın. 1 mg / mL poli-D-Lisin ile fosfat tampon tuzlu su (PBS), pH 7.4 hazırlanır. </li><li> 96 oyuklu bir plaka içerisinde, kaplamak için kuyu alt Poly-D-Lizin 2 ug / cm 2 ekleyin. CO2 kuluçka% 5 içinde 37 ° C &#39;de 45 dakika boyunca plaka inkübe edin. İnkübasyondan sonra, PBS kaldırmak ve 200 ul yerine/ Kullanmadan önce% 5 CO 2 inkübatör 37 ° C&#39;de tekrar iyi DMEM ve yer. </li></ol></li></ol> Tüm Retina 2. Diseksiyon <ol><li> Fareyi enükleasyonu: <ol><li> Avrupa direktifi 2010/63 uyarınca fare Kurban: servikal dislokasyon ile. Kavisli-makas ile baş kesin ve dezenfektan ile dezenfekte göz sonra 100 mm çaplı Petri kabı yerleştirin. </li><li> Çok dikkatli bir kavisli tutuş kullanarak kesit ile optik sinir müstakil sonra göz çıkarın. Daha sonra 21 ° C&#39;de steril CO2 -i ortam içeren 35 mm Petri kabındaki her iki gözü yerleştirin. </li></ol></li><li> Retina Çıkarma: <ol><li> Göz küresi içine makas tanıtmak edebilmek için 18 G iğne yardımıyla göz ekstremitenin düzeyinde bir delik açın. Deliğin içinde düz makas tanıtmak ve dikkatle siliyer cismin çıkarılması için göz dünyanın her çevre üzerinde iris altında sklera kesti. </li><li&gt; Kornea ve lens çıkarın ve sklera ile retina bitişik olan gözün arka odasına tutun. İki ince kulpları ile, retina zarar vermeden arka odasının içinde bulunan vitrözü çıkarın. Retinanın düzleşme izin için dört radyal kesimler (retina / sklera) gerçekleştirin. </li><li> Oküler dünya toparlanma ve bir &quot;turuncu&quot; olarak soyun. Sklera ve retina pigment epiteli (RPE) retinayı ayırın. Hala optik sinirin düzeyi çok dikkatli ince kavisli-makas tutturulmuş retina ayırın. </li><li> İki ince saplar ile retinanın merkezine doğru çevreden kalan vitrözü ayırın. Tüm vitreus tamamen retina düzleşme izin kaldırılır emin olun. </li><li> Plastik bir pipet ekstremite kesin ve plastik bir pipet ile CO2 i ortam içeren 35 mm çapında Petri tabağına retina aktarın. </li></ol></li></ol> Düz Mounte 3. SızdırmazlıkJelatin Blok üzerine d Retina <ol><li> Düz monte retinanın sızdırmazlık izin vermek vibratome tankı (jelatin blok ücretsiz) gelen CO 2 -i orta 30 ml - 20 çıkarın. </li><li> Plastik pipet kullanarak bir cam slayt retina aktarın ve 2 -i orta jelatin dilim aşağı bakacak fotoreseptör ile jelatin dilim aktarmadan önce CO bir damla ekleyin. </li><li> Yavaşça diğer tarafta sıcak jelatin atılması aynı zamanda, retina ve jelatin bloğu arasındaki bloğun bir tarafı üzerinde ısıtılmış% 4 jelatin enjekte tarafından jelatin bloğuna retina takın. </li><li> Bir pastör pipet ile aspire 4% jelatin. Toplam sızdırmazlık sağlamak için 10 dakika boyunca bekleyin. Blok ve tamamen bıçak sokmak için CO 2 -i orta ekleyin. </li></ol> 4. Retina Kesit NOT: Bu adım, başka retinal hücreler olmaksızın fotoreseptör hücrelerin bir tabakasının elde edilmesi için kritik öneme sahiptir (Şekil 1,). <ol><li> Jelatin blokta üst başlayarak, retina ulaşmak için 100 mikron seri bölümleri kesmek. Iç tabakasının 120 mikron bölümleri - Sonra 100 kesti. Uygulamaya bağlı olarak, bu tabaka göz ardı edilebilir veya sıvı azot içinde saklanır. Vibratome hızı iç tabakası veya fotoreseptör katmanların kesit sırasında (1 veya 2) çok yavaş olduğundan emin olun. </li><li> Iç ve dış retina arasındaki ara yüze karşılık gelen retina ara madde 15 um bölümler yapın. Bir mikroskop altında bu bölümü gözlemleyin. kan damarlarının olmaması dış retina ulaşıldığını gösterir. </li><li> Jelatin, dış retina 200 um (fotoreseptör) Kesme ve CO2 -i ortam 3 ml ile dolu bir 35 mm çaplı çanak aktarın. Tüm retina tüm fotoreseptör tabakası bölümleri elde edilinceye kadar buz üzerinde tutun. </li></ol> 5. dissociating fotoreseptör hücreleri <ol><li> (Çanak alınlar) fotoreseptör katman (lar) ihtiva eden ve 10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de bir inkübatör içinde (onları) koyun. </li><li> Forseps yavaşça jelatinden fotoreseptör tabaka ayrılır ve Ringer solüsyonu, 3 ml ile dolu yeni bir tabağına aktarın. Her fotoreseptör tabakası hazırlanması için bu adımı (5.2) tekrarlayın. </li><li> 5 ml&#39;lik bir polipropilen steril tüp içinde ve% 5 CO2 inkübatör içinde 37 ° C&#39;de 30 dakika inkübe (60 uM β-mersaptoetanol, 5.5 mM L-sistein 1,1 mM EDTA) aktivatör solüsyon, 25 ul papain 2 adet inkübe . papain aktivasyonu 37 ° C elde edilir. Bu kuluçka sırasında, (çok küçük) 2 mm2 parçalar halinde fotoreseptör tabakası kesilmiş ve 5 ml&#39;lik bir tüp içine bu parçaları aktarın. </li><li> Yerçekimi sedimantasyon, ardından çözelti Ringer çözeltisi, 1.5 ml ile iki kez retina durulayın. Numune ile tüp kalan Ringer çözeltisini çıkarın. </li><li> Aktive papain ve karışımı içeren tüp Ringer solüsyonu 475 ul ekleyin. Retinayı içeren tüp Bu çözüm ekleyin. </li><li> CO2 kuluçka% 5 içinde, 37 ° C&#39;de 20 dakika boyunca retina ile tüp inkübe edin. DMEM,% 10 FCS, 1 ml ilave etmek suretiyle reaksiyonu durdurun. Ölüm hücrelerinden sindirilmiş DNA deoksiribonükleaz 25 U I (DNAz I) ekleyin. Dikkatli bir şekilde 1 mL pipet kullanılarak bir hücre süspansiyonu homojen hale getirilir. Oda sıcaklığında 6 dakika boyunca 50 xg&#39;de dönerler. </li><li> Serum izlerini silmek ve hücre-pelet (özel reagents_equipment tablosuna bakınız) takviyeleri ile DMEM ortamı ekleyin ve dikkatlice 1 ml pipet ile hücre süspansiyonu tekrar süspansiyon süpernatant atın. Oda sıcaklığında 6 dakika boyunca 50 xg&#39;de dönerler. Bu adımı (5.7) kez daha tekrarlayın. </li></ol> 6 Kültürleme fotoreseptör hücreleri <ol><li> PN8 bir fare fotoreseptör bu tekniği kullanarak yaklaşık 1-1500000 hücreleri içerir. 1 de fotoreseptör hücreleri Tohumx 10 5 hücre / kültür ortamı ve kültür% 5 CO2 inkübatör içinde 37 ° C&#39;de 5 gün boyunca hücrelerin bir kültür plakasına cm2. 5. günde, immünokimyanın ve antikor tedarikçileri tarafından sağlanan batı lekeleme çalışma aşağıdaki yöntemlerden devam edin. Not: Adım kültür durdurmak ve ön testler referans 21&#39;de açıklanmaktadır. </li></ol>

<ol><li>The Organization of the Retina and Visual System. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Webvision%22">Webvision</a>. Kolb, H., Nelson, R., Fernandez, E., Jones, B. , (2014).</li>
<li>Perez De Sevilla Muller, L., Shelley, J., Weiler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Displaced+amacrine+cells+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Displaced amacrine cells of the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 505 (2), 177-189 (2007).</li>
<li>Mohand-Said, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+transplants+increase+host+cone+survival+in+the+retinal+degeneration+%28rd%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Res%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor transplants increase host cone survival in the retinal degeneration (rd) mouse.</a> Ophthalmic Res. 29 (5), 290-297 (1997).</li>
<li>Daiger, S., Sullivan, L., Bowne, S. RetNet, the Retinal Information Network. , The University of Texas Health Science Center. Houston, TX. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://sph.uth.edu/retnet">https://sph.uth.edu/retnet</a> (2014).</li>
<li>Mohand-Said, S., Hicks, D., Dreyfus, H., Sahel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+transplantation+of+rods+delays+cone+loss+in+a+retinitis+pigmentosa+model%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Selective transplantation of rods delays cone loss in a retinitis pigmentosa model.</a> Arch Ophthalmol. 118 (6), 807-811 (2000).</li>
<li>MacLaren, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+repair+by+transplantation+of+photoreceptor+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors.</a> Nature. 444 (7116), 203-207 (2006).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+photoreceptor+and+total+neural+retina+preserves+cone+function+in+P23H+rhodopsin+transgenic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Transplantation of photoreceptor and total neural retina preserves cone function in P23H rhodopsin transgenic rat.</a> PLoS One. 5 (10), (2010).</li>
<li>Mohand-Said, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+retina+releases+a+diffusible+factor+stimulating+cone+survival+in+the+retinal+degeneration+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Normal retina releases a diffusible factor stimulating cone survival in the retinal degeneration mouse.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 95 (14), 8357-8362 (1998).</li>
<li>Fintz, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+characterization+of+retina-derived+cone+neuroprotection+in+two+culture+models+of+photoreceptor+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Partial characterization of retina-derived cone neuroprotection in two culture models of photoreceptor degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (2), 818-825 (2003).</li>
<li>Cronin, T., Leveillard, T., Sahel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+degenerations%3A+from+cell+signaling+to+cell+therapy%3B+pre-clinical+and+clinical+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Retinal degenerations: from cell signaling to cell therapy; pre-clinical and clinical issues.</a> Curr Gene Ther. 7 (2), 121-129 (2007).</li>
<li>Wright, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+searchlight+through+the+fog%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A searchlight through the fog.</a> Nat Genet. 17 (2), 132-134 (1997).</li>
<li>Leveillard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+rod-derived+cone+viability+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of rod-derived cone viability factor.</a> Nat Genet. 36 (7), 755-759 (2004).</li>
<li>Lillig, C. H., Holmgren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioredoxin+and+related+molecules--from+biology+to+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Thioredoxin and related molecules--from biology to health and disease.</a> Antioxid Redox Signal. 9 (1), 25-47 (2007).</li>
<li>Fridlich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thioredoxin-like+protein+rod-derived+cone+viability+factor+%28RdCVFL%29+interacts+with+TAU+and+inhibits+its+phosphorylation+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The thioredoxin-like protein rod-derived cone viability factor (RdCVFL) interacts with TAU and inhibits its phosphorylation in the retina.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (6), 1206-1218 (2009).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cone+rescue+by+RdCVF+protein+in+a+dominant+model+of+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Functional cone rescue by RdCVF protein in a dominant model of retinitis pigmentosa.</a> Mol Ther. 17 (5), 787-795 (2009).</li>
<li>Bennett, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+delivery+of+rod-derived+cone+viability+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Strategies for delivery of rod-derived cone viability factor.</a> Retina. 25 (8 Suppl), S47(2005).</li>
<li>Komaromy, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+photoreceptor+deconstruction+by+CNTF+enhances+rAAV-mediated+cone+functional+rescue+in+late+stage+CNGB3-achromatopsia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Transient photoreceptor deconstruction by CNTF enhances rAAV-mediated cone functional rescue in late stage CNGB3-achromatopsia.</a> Mol Ther. 21 (6), 1131-1141 (2013).</li>
<li>Birch, D. G., Weleber, R. G., Duncan, J. L., Jaffe, G. J., Tao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomized+trial+of+ciliary+neurotrophic+factor+delivered+by+encapsulated+cell+intraocular+implants+for+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Randomized trial of ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for retinitis pigmentosa.</a> Am J Ophthalmol. 156 (2), 283-292 (2013).</li>
<li>Cronin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+disruption+of+the+rod-derived+cone+viability+gene+leads+to+photoreceptor+dysfunction+and+susceptibility+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">The disruption of the rod-derived cone viability gene leads to photoreceptor dysfunction and susceptibility to oxidative stress.</a> Cell Death Differ. 17 (7), 1199-1210 (2010).</li>
<li>Leveillard, T., Sahel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod-derived+cone+viability+factor+for+treating+blinding+diseases%3A+from+clinic+to+redox+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling.</a> Sci Transl Med. 2 (26), 26ps16(2010).</li>
<li>Fontaine, V., Hicks, D., Dreyfus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+ganglioside+composition+of+photoreceptors+during+postnatal+maturation+of+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Changes in ganglioside composition of photoreceptors during postnatal maturation of the rat retina.</a> Glycobiology. 8 (2), 183-190 (1998).</li>
<li>Fontaine, V., Kinkl, N., Sahel, J., Dreyfus, H., Hicks, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+purified+rat+photoreceptors+in+vitro+is+stimulated+directly+by+fibroblast+growth+factor-2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Survival of purified rat photoreceptors in vitro is stimulated directly by fibroblast growth factor-2.</a> J Neurosci. 18 (23), 9662-9672 (1998).</li>
<li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeobox+gene+CHX10%2FVSX2+regulates+RdCVF+promoter+activity+in+the+inner+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The homeobox gene CHX10/VSX2 regulates RdCVF promoter activity in the inner retina.</a> Hum Mol Genet. 19 (2), 250-261 (2010).</li>
<li>Sandu, C., Hicks, D., Felder-Schmittbuhl, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+photoreceptor+circadian+oscillator+strongly+relies+on+lighting+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rat photoreceptor circadian oscillator strongly relies on lighting conditions.</a> Eur J Neurosci. 34 (3), 507-516 (2011).</li>
<li>Dorrell, M. I., Aguilar, E., Weber, C., Friedlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+expression+analysis+of+the+developing+postnatal+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Global gene expression analysis of the developing postnatal mouse retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (3), 1009-1019 (2004).</li>
<li>Brooks, M. J., Rajasimha, H. K., Roger, J. E., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+facilitates+quantitative+analysis+of+wild-type+and+Nrl%28-%2F-%29+retinal+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing facilitates quantitative analysis of wild-type and Nrl(-/-) retinal transcriptomes.</a> Mol Vis. 17, 3034-3054 (2011).</li>
<li>Delyfer, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+of+human+retinal+surgical+specimens+using+jouRNAI%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis of human retinal surgical specimens using jouRNAI.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li>
<li>Ying, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CAT+reporter+construct+containing+277bp+GNAT2+promoter+and+214bp+IRBP+enhancer+is+specifically+expressed+by+cone+photoreceptor+cells+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A CAT reporter construct containing 277bp GNAT2 promoter and 214bp IRBP enhancer is specifically expressed by cone photoreceptor cells in transgenic mice.</a> Curr Eye Res. 17 (8), 777-782 (1998).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Retina biyoloji bir model organdır. Retinanın incelenmesi biyoloji 6 büyük keşiflere yol açtı. İlk tümör baskılayıcı gen RB1 kökeni yer almaktadır. Bu sevenless Oğlu ile etkileşim yoluyla reseptör tirozin kinaz ve MAP kinazlar arasındaki moleküler bağlantıyı ortaya koymaktadır. Bu Pax6, organ morfogenezisi ilk ana kontrol genin bulunmasından yer aldı. Bu, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (YBMD) ile Kompleman faktör H (CFH&#39;lik) genetik dernek merkezinde genom dernek ekranında (GWAS) tarafından tanımlanan ilk hastalık yatkınlık geni olduğunu. Son olarak, Leber konjenital amaurosis için ilk başarılı gen tedavisi neden, herhangi bir insan ilk düzeltici gen terapisi deneme hastalığı kalıtsal. bu organ yapısı çoğu omurgalı türünde muhafaza edilir. In vivo manipülasyon için onun erişilebilirlik yüzde bu parçası üzerinde fonksiyonel genomik soruşturmalar erken teşvik etmiştirSinir sistemini ral. Biz vibratome kesit ile retinanın iç tabakasından fotoreseptör tabakasını ayırmak nasıl burada göstermek. Bu adım, saf fotoreseptör kültürleri elde etmek çok önemlidir. Bizim diseksiyon protokolü RPE hücreleri tarafından kontaminasyon çok olası hale getirir. Büyük zorluklardan biri bölümüne doğru iç ve dış retina gerekli olan retinanın düzleşme olduğunu. retinanın kesit kemirgenler gibi küçük çaplı retina iyi ve bu çap güncel mevcut malzeme ile teknik bir kısıtlamadır. Retina bir örnek üzerinde uygulama için, biyolojik olarak anlamlı bir deney başlamadan önce önerilir. Bu mRNA ve protein, her iki ekspresyon çalışma yapmak üzere malzeme kullanılarak, kültürlenmiş fotoreseptör hücrelerinin elde edilen temsili sonuçlar yöntemini açıklamaktadır. İfade çalışmaları da sezeryan üzerinde alternatif olarak yapılabilirns lazer yakalama mikro-kesim ile elde edilen, ama kültürleri en vibratome kesitlerinin kullanılarak gerçekleştirilir. Biz tam bir farklı strateji ile mikrodiseksiyon lazer tekniği kullanılmış olabilir. Ama, kültür için mikrodiseksiyon aparatı ile fotoreseptör tabakası toplamak, bu fiksatif önlemek için gerekli olacak ve bu anlamlı mevcut metodoloji karmaşık hale olacaktır. Biz retinitis pigmentosa modellerinde fotoreseptör dejenerasyonu sırasında vibratome bölümlerde gen ve protein ifade kinetik incelemeyi amaçlayan bir protokol geliştiriyoruz. Biz protokol ayrıntılı açıklaması retina biyoloji alanındaki araştırmacılara yararlı olabilir, ve en başta proteomik ve metabolomic çalışmalar için inanıyoruz.

Retina omurgalılar arasında korunmuş mimarisi vardır, merkezi sinir sisteminin bir parçasıdır. nöral retina nöronlar gelen ışığın, gözün arkasındaki retina pigment epiteli (RPE) ile yakın temas içinde fotoreseptör tabakası için en uzak olan, tabakalar halinde düzenlenmiştir. Çubuk ve koni photorecptors foton yakalama opsin duyarlı moleküller güveniyor ışığa duyarlı hücreler vardır. Bu moleküller, RPE 1 yönünde işaret fotoreseptör dış kesiminde bulunan, hücresel bir yapıya disk membranları üzerine sarılmaktadır. Genellikle çok erken fotoreseptör dejenerasyonlar durumlarında etkilenir bu yapı,% 10, her gün oranında yenilenir. yani söz konusu iç tabaka fotoreseptör, çift kutuplu, amakrin ve yatay hücrelerde olarak ganglion hücrelerinde alınan sinyal hesaplamak diğer nöronların çoğunu içerir. Onların akson ile bu sonOptik sinir olan bir kiriş oluşturur. Bu katman hücreleri, iç pleksiform tabakası 2 dışında bulunduğunda biyologlar vadeli yerinden amacrine hücrelerini kullandık o kadar korunmuş olduğunu. Nöronların Katmanlar radyal Müller glial hücreler bir armatürün içinde dağıtılır. Bipolar hücreler ganglion hücrelerinin fotoreseptörleri bağlantı. Bunlar, dış pleksiform katman ve iç pleksiform katman arasında yer alır. ganglion hücrelerinin iki kutuplu hücreler ile bağlantılı olarak iç pleksiform tabakasını oluşturur. amacrin hücreler iki kutuplu hücreler ve gangliyon hücreleri arasındaki iç pleksiform tabakasındaki bulunan ilişki hücre olarak adlandırılmaktadır. dış pleksiform tabakasını yatay hücreleri içerir. Merkezi sinir sisteminin nöronal tabakaların Bu yararlı düzenleme bir vibratome kullanarak düz monte retina dilme iç hücre tabakasından fotoreseptör tabakasının ayrılmasına izin verir. Başlangıçta, bu teknik, aktarma için fotoreseptörleri izole etmek için kullanılmıştırrd1 farede insan retinitis pigmentosa (RP) 3&#39;ün bir model göz splantation. rd1 fare çubuk-spesifik fosfodiesteraz p alt-birimi için kodlayan Pde6b geninde bir resesif mutasyonu taşır. İnsanlarda 4 RP bu gen sonucu Resesif mutasyonlar. Çubuk fotoreseptör dejenere sonra, hasta gece görüş kaybeder, ve, mutasyona uğramış gen ifade ikinci adım olarak dejenere yok şaşırtıcı koni fotoreseptör. Kozalak renkli görme ve görme keskinliği için gerekli olduğundan, hastalar giderek kör olur ve hastalık için etkili bir tedavi henüz gelişmemiştir. Vahşi tip fare, konakçı fare koni dejenerasyonu fotoreseptör tabaka aşılanmasıyla, 3,5 geciktirilir. çubuklar ve iki kutuplu hücreler arasındaki sinaptik bağlantı sadece r belirli bir aşamasında elde edilebilir, çünkü rod-koni dejeneratif modelinde kayıp çubuklar nakli ile ikame edilmiş olabilirNRL ifade 6 başlangıcı ile işaretlenmiş etinal gelişme. Fotoreseptörlerin tabakası RPE ve fotoreseptör kalan, koni sadece% 3 tekabül dış retina arasında, çubuk-az rd1 retinanın alt-retinal cerrahi alanda tarafından tanıtıldı. İki hafta ameliyat sonrası, normal bir fotoreseptör tabakası ile nakledilen hayvandan koni% 40, ya da sahte-işletilen hayvan iç retina hücrelerinin normal bir tabaka ile nakledilen hayvan kıyasla hayatta. koni hayatta kalma topografisi, yayılmış, aşılanmış dokunun pozisyonunda bulunan mutasyona uğramış retinanın, tüm yüzey üzerinde bir koruyucu etki yayılabilir molekül 7 bağlı olduğunu gösterir. Sonra, koruyucu etkisi çubuklar 8,9 ile proteinin sekresyonunu alır hale geldiğini doğrulamak için, bir ko-kültür sistemi olarak koşullandırılmış kültür ortamları kullanmışlardır. Biz bu proteinin expre olacağını varsayımındaolmayan bir hücre özerk bir şekilde 10 çubuklar koruyucu sinyal kaybı ile ikincil koni dejenerasyon tetikleyecek hastalığın ilk aşamasında kendi ölüm çubuklar tarafından ve sürekli ve özellikle popülasyonunda ifade. Çünkü primatlarda koni aracılı merkezi görme önemi bu varsayılan protein RP için son derece alakalı tedavi aracı olacaktır. RP konileri korunması teorik 11 kör olmak, dünya çapında 1,5 milyon hastanın toplam önleyecektir. Bir retina cDNA kütüphanesinden 12 Çubuk türetilmiş Koni Canlılık Faktörü (RdCVF) kodlayan bir cDNA&#39;nın belirlenmesi için yüksek içerik tarama yaklaşımı ve bir koni zenginleştirilmiş kültür modeli kullandık. RdCVF, ilginç bir şekilde, redoks homeostazı 13 yer alan, söz konusu tioredoksin proteinleri için kodlayan genin homolog olan NXNL1 geninin splayslanmış ürünüdür. genin ikinci eklenmiş bir ürün RdCVFL hedefine oksidatif d karşı Tau proteini koruyan bir enzimdir14 Amage. RdCVF İdaresi koni ikincil dejenerasyonu ve bir resesif onların görme fonksiyonunun kaybı ve RP 12,15 baskın modelini önler. Bu, yenilikçi tedavi stratejisinin 16 iki önemli yönlerini gösterir. İlk olarak, bir gen, bağımsız bir şekilde, RP vakaların çoğunda uygulanabilir. İkincisi, rekabet faktörü aksine CNTF, RdCVF sağkalım görme fonksiyonunun 17 bakım ile ilişkilidir. Fonksiyonel etkisinin olmaması RP hastalara 18 CNTF&#39;nin yönetiminin klinik yarar yokluğu nedeni açıklayabilir. RdCVF in vitro koni kurtarma RdCVF bağışıklık sistemindeki 12 inhibe beri çubuk ve koni arasındaki önemli yaşam sinyalinin bir büyük olasılıkla. Buna ek olarak, çubuk-türevli koni canlılığı geninin bozulması, oksidatif stres 19 disfonksiyon ve duyarlılık fotoseptör yol açar. kullanımıfotoreseptör tabakası RdCVF belirlenmesi kökeni ve nörodejeneratif hastalıklar 20 katılan yeni redoks sinyali olduğunu. Bu yazıda izole etmek ve fotoreseptör tabakadan kültür hücreleri RdCVF bölgesinin aktivitesinin karakterize edilmesi için kullanılan bir protokol açıklar. fotoreseptör 5-7 gün 21 kültür içinde muhafaza edilebilir. Bu teknik aynı zamanda fotoreseptör spesifik genlerin ekspresyonunu incelemek için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Cytidine 5&prime;-difosfokolin*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0256</td><td>4.7 &mikro; M Sitidin 5&asal;-difosfokolin</td></tr><tr><td>Cytidine 5&prime;-difosfoetanolamin*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0456</td><td>2.7 &mikro; M Sitidin 5 & prime; -difosfoetanolamin</td></tr><tr><td>Linol & iuml; c asit / sığır serum albümini (BSA) *</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>L8384</td><td>100 ve mikro; g / ml linol ve iuml; c asit / sığır serum albümini (BSA)</td></tr> <tr><td>Triiyodo-L-tironin *</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td>0.03 ve mikro; M Triiyodo-L-tironin</td></tr><tr><td>96 kuyulu plakalar</td><td>Greiner bio-one</td><td>655-095</td><td></td></tr><tr><td>Binoküler mikroskop</td><td>Leica</td><td>MZ-75</td><td></td></tr><tr><td>CO2 bağımsız (CO2-i)</td> <td>Life Technologies</td><td>18045054</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DMEM Yaşam Teknolojileri</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>Forseps n&deg; 5 Dumont</td><td>Bionic</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Domuz derisi tipi A'dan jelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip&nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>U74v2</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin çözeltisi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15710049</td><td></td></tr><tr><td>Hidrokortizon*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td>0.55 & mikro; M hidrokortizon</td></tr><tr><td>İnsülin* (I)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1884 (ITS)</td><td>0.86 &mikro; M insülin (I)</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington-biyokimya</td><td>WOLS03124</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6407</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7556&nbsp;</td><td>2.0 ve mikro; M progesteron</td></tr><tr><td>Prostaglandin *</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P5172</td><td>0.28 ve mikro; M prostaglandin</td></tr><tr><td>Putrescine*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780</td><td>182 & mikro; M putresin</td></tr><tr><td>Neşter Albion</td><td>EMS</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Makas</td><td>Moria</td><td>15396-00</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td>1 mM sodyum piruvat</td></tr><tr><td>Sodyum selenit* (S)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1884 (ITS)</td><td>0.29 &mikro; M Na2SeO3&nbsp; &nbsp; (S)</td></tr><tr><td>Taurin*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8691</td><td>3 mM taurin</td></tr><tr><td>Transferrin*(T)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1884 (ITS)</td><td>0.07 &mikro; M transferrin (T)</td></tr><tr><td>Vibratom aparatı</td><td>Leica</td><td>VT1000-S</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">* Takviyeler</td></tr></tbody></table>

vibratome kesit fare retina fotoreseptör kültürler hazırlayın

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

Retina ışığın yönünü dikkate retina en uzak kısmında retina pigmente epitel ile, fotoreseptör gelen katmanlar nöronlar ile temas halinde her iki çubuklar ve koniler mimarisi düzenledi santral sinir sisteminin bir parçasıdır ve En yakın mesafe ganglion hücreleri. Bu mimari vibratome kesit tarafından fotoreseptör tabakasının ayrılmasına izin verir. 8 gün yaşlı bir fare disseke nöral retina düz gömülü aşağı bakacak% 20 jelatin fotoreseptör tabakasının bir dilimin üstüne% 4 jelatin. Bir Vibratome ve iki ucu keskin jilet kullanarak, 100 mikron kalınlığında iç retina kesilir. Bu bölüm, gangliyon hücreleri ve özellikle iki kutuplu hücreler üzerindeki iç katman içermektedir. Fotoreseptörleri içeren dış retina 200 mikron kurtarıldı önce 15 mikron bir aracı bölümü atılır. jelatin, 37 ° C&#39;de ısıtma ile ayrılmaktadır. Dış tabakanın adet doğmuş iyileşmesini olan37 ° C&#39;de 20 dakika boyunca aktive edilmiş papain 2 birimleri ile Ringer çözeltisi 500 ul monte edilir. Reaksiyon Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) içinde 500 ul% 10 fetal dana serumu (FCS) eklenerek durdurulur, DNAz I daha sonra 25 adet serum çıkarmak için oda sıcaklığında santrfuj birkaç kez yıkanır ilave edilir ve hücreler içinde tekrar süspansiyon haline getirilmiştir 500 DMEM ul / cm2, 1 x 10 5 hücre tohumlanır. in vitro olarak 5 gün büyütülür ve bunların canlılığı ölü / canlı deney kullanılarak atılır. Kültür saflığı ilk deney sırasında mikroskop altında incelenmesi ile belirlenir. saflık sonra tohumlama ve histolojik slayt üzerinde hücreleri tespit ve bir tavşan poliklonal anti-SAG, bir fotoreseptör işaretleyici ve fare monoklonal anti-RHO, bir çubuk fotoreseptör spesifik marker kullanarak analiz tarafından onaylanmıştır. Seçenek olarak ise, fotoreseptör (% 97 çubuklar) geni veya protein ifadesi analizi için ve nakli için de kullanılabilir.

Yanı sıra, transplantasyon, fotoreseptör tabakalar da fotoreseptör kültürleri 12,22 yapmak için tohum hücreleri tarafından hücre sinyalini incelemek için kullanılmıştır. Ek olarak, gen ekspresyonu ve sirkadyen ritim 23,24 incelemek için kullanılır. Bu% 5 Şekil 1E CO2 (bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de 5 gün boyunca hücrelerin FCS yokluğunda fotoreseptör kültürleri hazırlamak için doğum sonrası 8. günde, vahşi tip fare hücre fotoreseptör tabakadır ve korumuştur ). Hücreler daha sonra% 4 paraformadehid kullanılarak bekletilir ve daha sonra her iki fare monoklonal anti-RHO antikor tedarikçi tarafından sunulan yöntemler kullanılarak imünositokimyasal analizler için devam edildi (1: 250, Millipore Mab5316) veya tavşan poliklonal anti-SAG (1: 200, cömert Igal Gery ve David Hicks) hediye. Bu kullanılan anti-RHO ve anti-SAG (her ne kadar, anti-SAG etiket koniler ve çubuklar) anti-SAG, anti-RHO daha önceki bir marker olması nedeniyle. cel oranıAnti-RHO antikoru pozitif mı, anti-SAG antikorları (Şekil 2) için pozitif daha düşüktür. Bu SAG, çubuk arrestin da retinanın doğum sonrası olgunlaşma sırasında, SAG ifadesi olduğunu önceler gerçeği ile alternatif izole katmanda fotoreseptör% 3 yapmak, ya da koni tarafından ifade gerçeği ile açıklanabilir RHO'da 25,26 arasında. fotoreseptör RNA CsCI ultrasantrifüj 27 kullanılarak hazırlandı ve fare DNA yonga dizisi hibridize edildi 35 gün arası hayvanların doğal tipte, retina ve beyin fotoreseptör göre, spesifik gen ekspresyonunu izlemek için kullanıldı. Beyin (Şekil 3A) ile karşılaştırıldığında rodopsin için haberci (Rho), S-arrestin (SAG) ve koni transdusin (Gnat2) retinada spesifik olarak ifade edilmiştir. sentezleme kapsar tüm retinada fotoreseptör daha tabakası (PR) göze çarpmaktadırİç retina tabakası bu genler fotoreseptör tarafından gerçekten ifade gösteren. Gnat2 için Rho SAG ile karşılaştırıldığında görece sentezleme İzole fotoreseptör tabaka içinde ihtiva edilen koni tarafından ifade edildiğini göstermektedir. Bütün retina göre fotoreseptör tabakada recoverin ifadesi (Rcvrn) (Şekil 3B) artar. fotoreseptör tabakası, aynı zamanda RHO ve GNAT2 antikor tedarikçi tarafından sağlanan yöntemleri takip ederek Western blotting ile ekspresyonunu izlemek ve iç retina tabakasının (Şekil 4) tespit etmek için kullanıldı. Bütün retinada ve doğum sonrası 35 günlük rd1 fare retina sırasıyla RHO ve GNAT2 28, çubuk ve koni belirteçleri olmaması dikkat edin. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/51954/51954fig1highres.jpg"> Fisaat'in 1. fare retinanın vibratome kesit şematik görünümü. Vibratome bıçak ile iç retina (A) jelatin dilim aşağı bakacak fotoreseptör düz monte retina montajı. (B) Bölüm. Dış retina (C) Bölüm jelatin ekledi. (D) Kontrol fotoreseptör tabakasının izolasyonundan sonra retina fragmanı kenarında fotoreseptör varlığı. Yeşil floresan için kullanılan ölçek çubuğu beyaz ışık mikroskobu kullanılmaktadır. fotoreseptör resmin kenarında yer almaktadır. (E) Yetiştirme fotoreseptör hücreleri (post-beş gün). (F) Panel E. Yükseköğretim büyütme <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/51954/51954fig2highres.jpg" width="550"> Fare fotoreseptör kültüründe RHO ve SAG Şekil 2. Diferansiyel ifadesi. Çekirdek (A) boyanması (mavi), (B) SAG boyama (yeşil), (C) RHO boyama (kırmızı). (D) görüntü birleşti. SAG boyama önceki RHO boyama daha ifade olduğundan, yalnızca iki hücre çift SAG ve RHO (bkz *) etiketli. Ölçek çubuğu:. 23 mikron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51954/51954fig2highres.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/51954/51954fig3highres.jpg"> Beyin ve bütün retina otuz beş gün arası vahşi tip hayvanların fotoreseptör üç gen ekspresyonunun 3. Karşılaştırma Şekil. (A), rodopsin (Rho), S-arrestin (SAG) ve koni transdusin (Gnat2). (B) Kalbindin (eden: calb1) ve Recoverin (Rcvrn). Veri göreceli ifade olarak gösterilir. göreceli ifade bir ekspresyon değerdirKBaSS (http://kbass.institut-vision.org/KBaSS/) bilgi veritabanında mevcut yazılım Sağlam Çok dizi Ortalama (RMA) ile normaliszation sonra mikroarray verileri elde. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/51954/51954fig4highres.jpg" width="400"> Iç retina ve doğum sonrası gün 35. ACTB, beta de rd1 fare retinada onların ifade doğum sonrası gün 35 Yokluğunda bir yabani tip retina dış retina RHO ve GNAT2 Şekil 4. İfade aktin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51954/51954fig4highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

8 gün yaşlı bir fare Sinir retina% 4 jelatin bloğunun üstünde olduğunu. Vibratome ile fotoreseptör tabakası (200 um), izole edildikten sonra, fotoreseptör kültür mekanik ve enzimatik ayrışma sonrasında tohumlanır. fotoreseptör moleküler ve biyokimyasal analizler ya da transplantasyon için kullanılabilir.

Vibratome Kesit Fare Retina fotoreseptör Kültürler hazırlayın

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Bu prosedürün genel amacı, fare fotoreseptör katmanını izole etmektir. Kültürleme için ilk adım, tam bir düz retina elde etmek ve onu bir jelatin blok üzerine mühürlemektir. Daha sonra, fotoreseptör tabakasını izole etmek için retina tabakaları başarıyla kesilir.Son adım, kültürde saflaştırılmış fotoreseptör hücrelerini tohumlamaktır. Sonuç olarak, fotoreseptör tabakasının saflığı mikroskopi ve immünofloresan ile doğrulanır, ardından çubuktan türetilmiş koni canlılık faktörü testi yapılır. Bu tekniğin lazer mikro diseksiyon gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, fotoreseptör tabakasını güvenle izole etmesidir.Bu teknolojinin etkileri, kalıtsal retina dejenerasyonunun tedavisine kadar uzanır. Fotoreseptör biyolojisini incelemek çok uygun olduğundan, başlangıçta çubuk ve soğuk fotoreseptörler arasındaki hücresel etkileşimi incelemek için bu yöntemi geliştirmiştik. Katman fotoreseptörünün erken bir marın gözüne nakli, türetilmiş tüm uyumluluk faktörlerinin tanımlanmasına yol açmıştır.Bu yöntemlerin görsel olarak gösterilmesi kritiktir, çünkü düz dağ retinasının fırsatının gerçekleştirilmesi zordur, çünkü zordur. Retinayı izole etmeden önce vibratoyu hazırlayın. Dört santigrat derecede depodan çıkarılan% 20 jelatin çözeltisi bulaşıkları ile başlayın.Jelatini bir neşterle kesin, ardından jelatin dilimini çevirin ve bir damla süper yapıştırıcı kullanarak vibratörün siyah destek diskine yapıştırın. Ardından, bir tıraş bıçağını ikiye bölün ve bir yarısını vibratöre yerleştirin. Ardından siyah destek diskini vibratör aparatına yerleştirin ve siyah düğmeyi sağa çevirin.Şimdi, tutma kabını vibrato'nun kafasına sabitleyin ve jelatin bloğu CO2'den bağımsız bir ortamla kaplayın. Kurulumu test etmek için vibratoyu açın. Dilimleme pürüzsüz olana ve düz dilimler elde edilene kadar 100 mikronluk üç dilim kesin.Gözleri bir fareden ve diğer preparatlardan topladıktan sonra retinayı izole edin. İlk olarak, göz uzuv seviyesinde bir delik açmak için 18 gauge bir iğne kullanın. Daha sonra siliyer gövdeyi çıkarmak için, delikten ve göz küresine düz makas sokun ve sklerayı irisin altından ve ardından oküler kürenin çevresi boyunca dikkatlice kesin.Daha sonra, retina skleraya bitişik olacak şekilde gözün arka tarafını tutun ve kornea ile lensi çıkarın. İki ince kavrama ile, retinaya zarar vermeden retinaya bağlı olan vitreusu çıkarın, böylece retina düz bir şekilde yatırılabilir. İçinde dört radyal kesim yapın.Şimdi oküler küreyi ters çevirin ve portakal gibi soyun. Sonra, ince düz makasla çok dikkatli bir şekilde. Retinayı sklera ve retina pigmentli epitelden ayırın.İnce çeneler kullanılarak optik sinir hizasında yapışık kalmalı, kalan vitreusu periferden başlayarak retinanın merkezine doğru ilerleyerek çıkarmalıdır. Tüm vitreus tamamen çıkarıldığında, retina düzleşecektir. Şimdi retinayı 35 milimetre çapında bir Petri kabına aktarın.Düz retinayı jelatin blokta mühürleme işlemi hassastır ve temelde dokuyu kesitlere ayırmanın en zorlu yönüdür. İlk olarak, vibram tankından 20 ila 30 mililitre ortam çıkarın. İkinci olarak, retinayı plastik geniş delikli bir pipet kullanarak bir cam slayta aktarın ve slayta bir damla CO2 bağımsız ortam uygulayın.Üçüncü olarak, retinayı bir fotoreseptör aşağı bakacak şekilde bir jelatin dilimine aktarın. Dördüncüsü, retinayı jelatin bloğa takın. Retina ile jelatin blok arasındaki bloğun bir tarafına nazikçe ılık% 4 jelatin enjekte edin ve jelatini diğer tarafa atın.Son olarak, jelatini bir cam pipetle aspire edin ve retina bloğa kapatılana kadar yedi ila 10 dakika bekleyin. Şimdi CO2'den bağımsız ortamı tanka geri ekleyin ve jelatin bloğun üstünden başlayarak bölümlere ayırmak için bloğu ve bıçağı daldırın. Bıçak retinaya ulaşana kadar 100 mikronluk seri kesitler kesin.Daha sonra çok yavaş bir hız kullanarak, bir veya iki tane retinanın iç tabakasının 100 ila 120 mikronluk bölümlerini kesti. Uygulamaya bağlı olarak, bu katman, iç ve dış katman arasındaki arayüzde hızı yavaş tutarak atılabilir veya sıvı nitrojen içinde saklanabilir. 15 mikronluk kesitler alın.Bu bölümleri kan damarlarının varlığı için mikroskop altında inceleyin. Hiçbiri olmadığında, dış tabakadan dış retinaya ulaşılmıştır. 200 mikronluk kesitleri yavaşça kesin.Bu dilimleri, buz üzerinde tutulan üç mililitre soğuk, CO2'den bağımsız ortam ile 35 milimetrelik bir tabağa aktarın. Bu çanağa bölümlere ayrılacak tüm retinalardan tüm fotoreseptör tabakası bölümlerini toplamaya devam edin. Dilimlenmiş fotoreseptörleri 10 dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatöre aktarmakla başlayın.Daha sonra forseps kullanarak, her bir fotoreseptör katmanını jelatinden nazikçe ayırın ve bunları oda sıcaklığında üç mililitre zil çözeltisi ile doldurulmuş yeni bir tabağa aktarın. Tüm fotoreseptörler jelatinden izole edildikten sonra, iki ünite papain'i steril beş mililitrelik bir polipropilen tüpte 25 mikrolitre aktivatör çözeltisi ile birleştirin ve 30 dakika inkübe edin. Bu inkübasyon sırasında papain'i aktive etmek için, fotoreseptör katman dilimlerini iki milimetre kare parçaya bölün ve çok daha küçük olmayacak şekilde kesin.Bu parçaları 1,5 mililitre zil çözeltisi ile beş mililitrelik bir tüpe aktarın. Ardından zilleri aspire edin ve ikinci bir yıkama için değiştirin. Tüm dilimlerin yerçekimi, çökeltme ile çökelmesini bekleyin ve ardından kalan tüm zil çözeltisini tüpten çıkarın.Daha sonra, aktive edilmiş papain içeren tüpe 475 mikrolitre zil çözeltisi ekleyin ve karıştırın. Bu karışımı dilimleri içeren tüpe aktarın ve 20 dakika inkübe edin. 20 dakika sonra, DMEM'e bir mililitre% 10 FCS ekleyerek papain sindirimini durdurun.Daha sonra, ölen fotoreseptör hücrelerinden DNA'yı sindirmek için 25 ünite D N.One ekleyin, fotoreseptör hücrelerini damak tadına almak için süspansiyonu pipetleme ile dikkatlice homojenize edin. Tüpü oda sıcaklığında altı dakika boyunca 115 Gs'de döndürün, süpernatanı atın ve bir mililitrelik bir pipet kullanarak takviye edilmiş DMEM'deki hücreleri yeniden süspanse edin. Bunu tekrarlayın, sıkın ve tekrar süspansiyon. Bir kere.Şimdi hasat edilen gözden bir ila 1,5 milyon hücre tohumlanmaya hazır olmalıdır. Onları santimetre kare başına 100.000 hücrede tohumlayın ve aşağı akış uygulamalarından önce beş gün boyunca kültürleyin Açıklanan yöntemleri kullanarak, fotoreseptör hücrelerinin kültürleri, doğum sonrası sekizinci günde vahşi tip farelerden yapıldı. FCS olmadan, hücreler sabitlendi ve anti row veya daha erken bir markör anti sarkma için boyandı.SAG, ROE ekspresyonundan önce geldiğinden, daha az hücre anti row için pozitifti. Fotoreseptörler ayrıca mRNA, RO sarkması ve GA iki transdükleyici koni ekspresyonunu incelemek için 35 günlük farelerden hazırlandı. Bu genler, tüm beyne kıyasla fotoreseptörlerde en belirgin şekilde ifade edilir.G NAT iki, özellikle koniler ile ifade edilir. Fotoreseptörlerdeki RO ve g. NAT iki'nin protein ekspresyonu, fotoreseptör tabaka hücreleri ile iç retinal tabaka hücreleri karşılaştırılarak incelendi.Bu, vahşi tip ve RD mutant fareleri ile yapıldı. Mutant fareler, 35. günde her iki proteinin de ekspresyonunu göstermedi. Bu videoyu izledikten sonra, uygun bir saflaştırılmış fotoreseptör tabakasının nasıl elde edileceğini iyi anlamış olmalısınız.Bu teknik, bu prosedürü takiben uygun şekilde yapılırsa, dört ila sekiz retina için yaklaşık beş ila altı saat içinde yapılabilir. Ayrıca, fotoreseptörlerin dejenerasyonu sırasında protein ekspresyonu gibi ek soruları cevaplamak için batı kanı gibi yöntemler de uygulanabilir. Bu teknik, retina biyolojisi alanındaki araştırmacıların ilgili hayvan modellerinin transkriptini, proteomunu ve metabolizmasını incelemesinin yolunu açtı.

vibratome-sectioning-mouse-retina-to-prepare-photoreceptor-cultures

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Burada yedi gün yetişkin porcine retinanın Organotipik kültürü için bir maliyet-etkin bir yöntem açıklanmaktadır. Kısaca, steril bir filtre kağıdı nöral retina ısmarlama stand tarafından gündeme getirilen bir ekleme RPE ve yer fotoreseptör yüzü yukarı kaldırmak için kullanılır oldu.

Tam kalınlıkta Yetişkin Domuz Retina Organotipik Kültür

Bu protokol ile fare retina eksplant elektroporasyon yaşayan cis-düzenleyici unsurlar (yani artırıcı / rehberleri) aktivitesini ölçmek için basit ve ucuz bir şekilde açıklamaktadır. DNA hazırlığı, retina diseksiyonu, elektroporasyon, retina eksplant kültür ve fiksasyonu sonrası analizi ve ölçülmesi açıklanmıştır.

Aktivitesi miktarının Cis</emEksplant Elektroporasyon Fare Retina> Düzenleme Elemanları

Bu video, düz montajlı bir fare retinasından elektrofizyolojik kayıt için tam hücre yama kelepçesi tekniğini göstermektedir. Retina içindeki yıldız patlaması amakrin hücrelerine (SAC'ler) yaklaşmak için elektrotlu ince bir cam pipet kullanılır. Bir conta oluşturduktan sonra, zarı yırtmak ve tüm hücre yama-kelepçe konfigürasyonunu oluşturmak için emme uygulanır. Son olarak, iyonların SAC sinaptik reseptörlerinden akışı konfigürasyon kullanılarak ölçülür.

Düz Montajlı Bir Fare Retinasından Elektrofizyolojik Kayıt için Tam Hücre Yama Kelepçesi Oluşturma

Burada açıklanan protokol, tam montajlı bir retinal preparatın yapısal değerlendirmesi içindir. Bu, doku diseksiyonunun tanımlarını, hidrofilize politetrafloroetilen (PTFE) membran ekine montajı, floresan işaretleyicilerle bolus yüklemesini ve hücresel ve sinaptik bileşenlerin immünohistokimyasal analizi için karbodiimid ve paraformaldehit ile fiksasyonun karşılaştırılmasını içerir.

Görüntüleme ve İmmünhistokimyanın için Retina Wholemount Hazırlık için optimize edilmiş Protokolü

Fare gözünden retina dilimlerinin nasıl hazırlanacağını ve retina nöronlarında ışık tepkilerinin nasıl kaydedileceğini göstereceğiz. Tüm prosedür karanlığa uyarlanmış koşullarda gerçekleştirilir.

Kayıt Patch Kelepçe Teknikleri Kullanarak Koyu adapte Fare Retina Dilim Hazırlıkları Nöronlar içinde postsinaptik Yanıtları Işık-uyarılmış

Biz fare retinanın ex-vivo dilim hazırlık kullanarak koni fotoreseptörlerin akson terminallerinde Ca 2 + dinamiklerini izlemek için bir protokol açıklar. Bu protokol önemli bir memeli model sisteminde koni Ca 2 + sinyalizasyon kapsamlı çalışmalar, fare verir.

Görüntüleme Ca<sup&gt; 2+</supFare Retina Koni fotoreseptör Akson Terminalleri içinde&gt; Dinamikleri

Biz retina yüzeyine paralel kesit düzlemi ile erişkin memeli retina yatay dilim hazırlık geliştirdi. nonradially odaklı retinal nöronların dendritik alanları patch-kelepçe ve görüntüleme teknikleri ile sinyal işleme çalışma izin kesilmiş değil.

Elektrofizyolojik Çalışmalar Yetişkin Fare Retina Yatay Dilimleri hazırlanması

Bu protokol, protein analizi için murin çubuk fotoreseptörlerinin hücre altı bölmelerini izole etmek için iki teknik sunar. İlk yöntem, çubuk dış segmentlerini ayırmak için canlı retina ve selüloz filtre kağıdı kullanırken, ikincisi çubuk iç ve dış segment katmanlarını soymak için liyofilize retina ve yapışkan bant kullanır.

Protein Analizi için Fare Retinasındaki Fotoreseptör Hücre Bölmelerinin İzolasyonu İçin İki Peeling Yöntemi

Bu çalışma, fotoreseptör hücre gövdelerinin çıkarılmasının daha hızlı antikor difüzyonu ve immünohistokimya, in situ hibridizasyon ve elektrofizyoloji deneyleri için iç retinal nöronlara gelişmiş yama pipet erişimi sağladığı alternatif bir düz montajlı retina preparatı sunmaktadır.

Omurgalı Retinasında İç Nükleer Tabaka Nöronlarını İncelemek için Geliştirilmiş Bir Düz Montaj Preparatı Olarak Bölünmüş Retina

Fare retinal kriyoseksiyonlarının hazırlanması ve fotoreseptörler üzerinde immün boyama yapılması için bir protokol tanımlanmıştır. Bu makale, araştırmacıların iyi korunmuş morfoloji ve yüksek kaliteli immün boyama sonuçları ile fare retinal donmuş kesitlerini tutarlı bir şekilde üretmelerini sağlar.

Fare Retinasının Kriyoseksiyonu ve İmmün Boyanması

Retina, laminer yapısı boyunca karmaşık uzamsal organizasyon sergiler. Modern mekansal transkriptomik ve dizileme teknikleri, 20 μm kalınlığında doku kesitleri &lt; gerektirir ve bu da retinal araştırma uygulanabilirliklerini sınırlar. Bu taze dondurulmuş kriyoseksiyon yöntemi, düzlemsel uzamsal ilişkileri korurken fare retinasının ince yüz kesitlerini üretir ve laminalar arasında kapsamlı moleküler haritalama sağlar.

En yüz Yüksek Boyutlu Mekansal Moleküler Analiz için Fare Retinasının Kriyoseksiyonu

Öğrenin fare retinasından fotoreseptör tabakasını izole etmek için vibratome kesit yöntemini. Bu teknik, retinal hastalıkların tedavisi için hücre kültürü ve interaksiyon çalışmalarına olanak tanır.

Vibratome Kesit Fare Retina fotoreseptör Kültürler hazırlayın

Daha fazla video keşfet