Name: Içinde Yara Yanıtları Cilt yaralayarak Yöntemleri ve Testler ° C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Öğrenin C. elegans epidermisinde yara yanıtlarını görselleştirme yöntemlerini. Mikroenjeksiyon iğnesi ve lazer ile yaralama teknikleri, kalsiyum sinyallemesi ve aktin halka oluşumunu incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

C. elegans için iğne yaralama yöntemleri ilk olarak Nathalie Pujol ve Jonathan Ewbank tarafından geliştirilmiştir; el yazması hakkındaki yorumları için Nathalie Pujol'a teşekkür ederiz. Laboratuvarımızda C. elegans epidermal yara onarımı ile ilgili çalışmalar, NIH'den ADC'ye (R01 GM054657) bir hibe ile desteklenmektedir.

Aşağıdaki protokoller C. ayrıntılı prosedürü tarif elegans cilt yaralama ve yara yanıtları tahlil için. 1. İğne Yaralama 3,4 <ol><li> Standart NGM (nematod büyüme ortamı) E. ile plakalar üzerinde sağlıklı unstarved solucanlar büyütün bir 20 ° C kuluçka makinesi içinde tutulmuştur gıda E. coli OP50 bakteridir. Not: NGM agar plakaları ve C rutin ekimi için yöntemler elegans www.wormbook.org 6 bulunabilir. </li><li> 20 ° CO / N de yaralama ve kültür önce taze numaralı seribaşı plaka 1 gün 25 L4 aşamada solucanlar seçin. </li><li> Yaralama önce, bir iğne çektirmenin kullanarak kılcal iğneleri çekin. yaralama kullanılan iğneler C mikroenjeksiyon için kullanılan oranlarla aynı olduğu; elegans. </li><li> Tüm solucanlar genç yetişkin aşamasında olduğundan emin olun. Yaklaşık 30 dakika boyunca buz üzerinde solucanların plaka koyun. Soğutma hayvanlar iğne yaralama kolaylaştırılması, halsiz neden olur. <br /&gt; NOT: buz çıkarıldıktan 5 dakika içinde, solucanlar normal hareket başlayacaktır. Bu hareket solucanlar yara mümkün ama zor. Tecrübesi ile, 5 dk 25 solucanlar yara için yeterli zamanı. Hayvanlar kurtarmak için uzun sürer rağmen (aşağıya bakınız lazer yaralama kullanılan) gibi levamizol gibi ilaçlarla hareketsiz. </li><li> Diseksiyon stereomikroskopta için buz agar plakasını sökün. Bir solucan seçim kullanarak, agar plaka merkezi haline 25 solucanlar taşıyın. </li><li> Daha kolay iğne tutmak için 100 ul pipet içine iğne yerleştirin. Gonad kaçınarak, iğne ile solucanın vücudun ön veya arka kısmını delinme. Genel olarak, arka farenks ve anterior gonad arasında, ya da arka gonad ve rektum arasındaki yara çalışmayın. Yeniden kullanım iğneler birçok kez, kırılıncaya kadar. NOT: hayvana ~ 5-10 mikron delici, yaralar manikür ve cilt delinme kısa, nazik azabı olduğundan emin olun. İğne anim girmelidirderiye ark yaklaşık dik bir açı. yaralar, iç organlarda hasara açık, ya da vücudun hemen rüptürü neden olmamalıdır. Sitoplazma yaralanmasından sonra bir kaç saniye için dışarı sızmaya küçük bir miktar gözlemleyin; hücresel içeriği uzun bir zaman içinde sızarsa, ancak hayvanlar hayatta olmaz. Optimum görüntüleme için, yanal epidermal syncytium (hyp7) veya lateral dikiş yara. NOT: Bu işlem, bir cam iğne kullanılmasını içerir. </li><li> Solucanlar 20 ° C&#39;de daha sonra oda sıcaklığında kültüre geri izin verin. Aşağıda tarif edilen deneylerde, bir dizi iğne yaralanma başarısını değerlendirin. Vahşi tip hayvanların% 95&#39;den daha fazla iğne genç yetişkin safhasında yaralama sonrası 24 saat hayatta. larva veya yaşlı yetişkinlerde yaralama etkisi henüz yaygın olarak analiz edilmemiştir. </li></ol> 2. Lazer Yaralama 3 Daha kesin yaralama gerçekleştirmek için femtosaniye lazer ışınlama (800 nm) kullanın. <ol><li> Agar p hazırlayınerimiş% 2 agar 7 ile bir cam slayt reklamlar. Pedleri C. canlı görüntüleme için kullanılan agar pedleri benzer olun elegans. </li><li> Solucan kıracağıyla agaroz ped üzerine 10 genç erişkin solucanlar aktarın ve 12 mM Levamisole solüsyonu 2 ul damla ekleyin. Hayvanlar ve bir kapak kayma ile sıvı örtün. Solucanlar felç için 1-2 dakika bekleyin. </li><li> Dönen bir disk konfokal mikroskop üzerine cam slayt yerleştirin. Solucanlar bulmak ve 100X amacı ile yanal ön veya arka sinsityal epidermis (NA 1,4-1,46) odaklanmak sahne taşıyın. </li><li> 140 mW femtosaniye lazerin gücünü ayarlayın (objektif önce ölçülür). 80 MHz tekrarlama oranı femtosaniye lazer kullanın. NOT: (20 msn ile ayrılmış) 200 msn, her iki bakliyat elimizde yaralama için yeterlidir. </li><li> Epidermal hücre apikal yüzeyinde odaklanın ve epidermisi yara. Sitoplazma (kabarcıklarla) yerel bozulması, veya yerel ağartma o gözlemleyinkullanılan herhangi bir floresan markör, f. NOT: femtosaniye lazer kullanarak, uygun lazer güvenlik prosedürleri uygulayın. Böyle iki foton mikroskoplar gibi femtosaniye lazerler kullanarak Hattı veya nokta taramaları lazer yaralama için yeterli güç vermelidir. NOT: diğer lazerler kullanarak doğrudan deneyimi yok iken, ilke yaralama içinde (C hücre ablasyon elegans kullanıldığı gibi) geleneksel UV lazerler kullanarak mümkün olmalıdır. İsteğe bağlı olarak, epidermis (N. Pujol, kişisel iletişim) yara disk konfokal eğirme (sıkı bağlamak) modülünü Photobleaching sonra Floresan Kurtarma kullanın. </li></ol> Yaralama Epidermal Ca 2+ Cevaplarının 3. Görselleştirme <ol><li> Transgenik C kullanın Yetişkin, epidermal spesifik promotör sütun-19 (Şekil 1A kontrolü altında epidermis (örneğin GCaMP serisi gibi) Ca + 2 sensörleri ifade elegans suşu, transgenler listelenen <strong&gt; Tablo 1). Transgen ekspresyon düzeyi için bir iç kontrol olarak örneğin tdTomato bir kırmızı flöresanlı proteinin eksprese eden bir transgen kullanın. NOT: Epidermal tdTomato floresan nispeten sabit olduğu gibi transgen ifadesi için bir iç kontrol olarak tdTomato kullanmış ve GCaMP görüntüleme ile karışmaz. </li><li> Epidermis tetikleyici Ca 2 + yükseklik yaralama iğne ve lazer Hem. İğne yaralama kolayca dönen bir disk konfokal gerçekleştirilemez Ancak, lazer yaralama Ca 2 + tepki (Şekil 1) kantitatif analiz için tercih edilir. </li><li> Bir 100X amacı ile dönen disk konfokal (NA 1,4-1,46) ve uygun filtre setleri kullanılarak çok boyutlu edinim modu (zaman aralığı 114 msn uyarma lazer maruz 2 sn) zaman atlamalı görüntü elde (GFP filtreler GCaMP3 için çalışacak). NOT: Ca 2+ resp incelemek için yaklaşık 2 saat zaman atlamalı görüntüleri her 30 sn Edinmeuzun bir zaman boyunca yaralama için onse. </li><li> Görüntü analiz yazılımı kullanarak arka planda epidermal hücre sitoplazmada ve beş merkezli beş olan ilgi (ROI) on eşdeğer bölgelerinde, ortalama GCaMP floresan ölçmek. </li><li> Sonra yaralanma öncesi arka planda 5 İB&#39;nin ortalama çıkarılarak epidermis 5 ROI floresan ortalama bazal floresan (F 0) edinin. Başlangıca [(F t -F 0) / F 0] göre değişim oranı olarak floresan mesafe kadar taşınmış değişikliği ifade eder. </li></ol> Yaralama sonra F-aktin Dynamics 4. Görselleştirme <ol><li> NOT: İğne yaralama yanıt olarak, yavaş yavaş yara etrafında kapatır yara yerinde bir aktin halka gözlemlemek. Bu protokol bölüm deneyleri aktin halka çapı ölçerek kapatılması yara. </li><li> Böyle kaynaşmış Drosophila moesin aktin bağlayıcı etki alanı olarak bir F-aktin işaretleyici ifade transgenik solucanlar oluşturunGFP, örneğin (transgen juIs352) sütun-19 (Şekil 2A) ve epidermal özel bir promoterin kontrolü altında ifade edilmiştir. NOT: Biz LifeAct veya F-tractin (yayınlanmamış sonuçlar) gibi etki alanı belirteçler bağlayıcı diğer aktin kullanılarak benzer sonuçlar elde ettik. </li><li> P col-19- GFP-moesin transgenik solucanlar üzerinde yaralama iğne yapın. İğne yaralama sonra, ~ 5 dakika ile yara site çevresinde GFP-moesin bir halka gözlemlemek. aktin halka çapı küçülür ve en sonunda vahşi tip hayvanlara (Şekil 2A) yaralama 2-3 saat sonra kapatır. </li><li> Bir cam slayt üzerinde% 2 agar dolgusunu hazırlayın ve 2 ul 12 mM Levamisole çözeltisi içinde ped üzerine 10 solucanlar aktarmak. Geleneksel konfokal mikroskopi kullanılarak yaralama sonra görüntü GFP-moesin halkaları 1 saat. NOT: konfokal mikroskopi 1 saat yaralama sonra aktin halkaları z-yığınları (13 x 0,5 mm) elde etmek. </li><li> Yaralama sonra aktin halka çapını ölçün. Epidermal G ölçmek içinFP-moesin, ilk z-yığınının maksimum yoğunluk projeksiyonu yapmak ve daha sonra 4 hat taramaları çizmek GFP-moesin halkası üzerinde (birbirine 45 °). Halka çapı dört hat taramaları (Şekil 2B) arasında tepeden tepeye mesafe, ortalama pik olarak tanımlanır. Zaten kapalı olan halkalar için, çapı 0 mikron olarak tanımlanır. NOT: Bu vahşi tip yara kapama sürecinde yaklaşık yarım yoludur F-aktin halkalar rahatlıkla yaralama 1 saat direkte ölçülür. F-aktin halkalar aynı zamanda bir yara kapatma zaman içindeki gelişimini elde etmek için çok sayıda zaman noktasında ölçülebilir. Yara kapanması Zaman atlamalı filmleri Levamizol-immobilize solucanlar kullanarak ve disk konfokal mikroskopi iplik elde edilebilir. </li></ol> Epidermal Antimikrobiyal Peptitler 5. Deney İndüksiyon NOT: Yaralama da C. doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarını tetikler elegans cilt. Antimikrobiyal peptidler (amper) kodlayan genlerin transkripsiyonu ind olduğunuEpidermiste uced. NLP-29 (nöropeptid benzeri protein) AMP güçlü 4 yaralama ile indüklenir. Epidermis yaralama sonra AMP ifade nasıl kontrol bireysel AMP transkript seviyelerini tespit etmek için transgenik gazetecilere ya da real-time PCR kullanmak, tahlil için. <ol><li> 4 yaralama doğuştan gelen bağışıklık yanıtı için transgenik muhabiri tahlil. </li><li> Bir iç kontrol olarak P nlp-29- GFP ve P col-12- DsRed içeren transgenik muhabiri frIs7, ifade yetişkin hayvanlar üzerinde (protokol 1 gibi) iğne yaralama gerçekleştirin. GFP uzun geçiş filtresi olarak koyu kırmızı veya turuncu yarasız yetişkin hayvanlar gözlemleyin. NOT: yaralanması vahşi tip solucanlar P nlp-29 GFP ifadesini neden olacaktır ama GFP uzun bir pas aydınlatma altında turuncu, sarı, yeşil veya görünen solucan sonuçlanan, P col-12 -dsRed etkilemez. Böyle PMK-1 veya p38 MAPK yolundaki genlerin fonksiyonlarının kaybı sy-1 engeller NLP-29 GFP4 yaralama sonra indüksiyon. P NLP-29- GFP larva aşamalarında yüksek seviyelerde ifade edilir </li><li> Genç yetişkin hayvanlarda AMP indüksiyon tahlilleri gerçekleştirin. Yarasız kontrol hayvanları GFP düşük seviyelerde olduğundan emin olun. Not: p NLP-29- GFP tanımı da ozmotik stres 8 ile sağlanır ve diğer çevresel strese duyarlı olabilir. </li><li> Yaralama sonra 6 saat, GFP uzun geçiş filtresi ile kapsamını diseksiyon bir floresan kullanılarak P nlp-29 GFP indüksiyon (Şekil 3) 9 sahip solucanlar numaralarını puan. NOT: 1 saat sonrası yaralama P nlp-29- GFP gözle görülür bağlı olduğu anda, daha sonra 6 saat sonrası yaralama hakkında zirveye ulaşan ve 24 saat sonrası yaralama kadar yükselmiş kalan. Görsel puanlama 4,9 ile ifade niceliğini. Alternatif olarak, bir floresan aktive solucan sıralayıcı 4 kullanarak ifade seviyelerini ölçmek. Solucan sıralayıcı için, en az 50 hayvan yaralı gerekir. </li><li> Nereye Real-time PCR deneyiBireysel AMP genlerin transkript seviyelerini ntitating. Birkaç genler için deney transkript düzeyleri: nlp-29, nlp-30, cnc-1, ve cnc-5. </li><li> Yabani tip ya da mutant solucanlar üzerinde yaralama iğne yapın (protokolü 1) </li><li> İstenilen zamanlarda 50 yaralı solucanlar ve 50 yarasız solucanları (örneğin 3, 6, 24 saat) sonrası yaralama toplayın. </li><li> RNA, imalatçının talimatları izlenerek bir ticari kit kullanılarak ekstrakte edin. </li><li> Ticari ters transkriptaz kiti kullanılarak toplam 20 ul cDNA almak için ters transkripsiyon gerçekleştirin. </li><li> RT-PCR için, yeşil flüoresan ile Supermix ve 0.2 uM primerleri ile kombinasyon halinde her bir örnek 0.2 ul cDNA (1/40) kullanılır. RNA kalitesini karşılaştırmak için referans olarak ama,-1 veya SNB-1 RT-PCR kullanın; iç kontrol (ama-1 veya SNB-1) ile normalize tarafından AMP göreceli ifade seviyesini karşılaştırmak, veya norm (yaralı solucanlar / yarasız solucanlar AMP indüksiyon) kat indüksiyon sonrası yaralama karşılaştırmakİç kontrole alizing. NOT: cnc-1 ve cnc-5 olan transkripsiyon 10 yaralama aktive aile antimikrobiyal peptidler caenacin vardır. Tipik olarak, iğne yaralama ekspresyonunu indükler (~ CNC-1 için 500 kat), 4 saat 10 bir zaman boyunca. Yayınlanan çalışmalarında kullanılan primerler Tablo 2&#39;de listelenmiştir. </li></ol> 6. Deney Survival sonra Yaralama <ol><li> Not: Ca2 + bağımlıdır yara onarım yolağı ve doğal bağışıklık tepki yolunu: yaralanması epidermis içinde en azından iki bağımsız sinyal yolaklarını aktive eder. Her iki yollar steril yaralama tam yaşam için gereklidir. Bir mutant veya RNAi tedavi yara iyileşmesini etkileyen olup olmadığını sınamak için, 24-48 saat sonrası yaralama de hayatta ölçün. İsteğe bağlı olarak, uzun ömürlü 4,9 tarihinde yaralama etkisini belirlemek için geleneksel ömrü deneyleri kullanın. </li><li> (Genç yetişkin (L4 + 24 saat) solucanlar üzerinde 50 solucanlar yaralama iğne yapın, tekrar seveYukarıdaki protokol 1 Aşağıdaki ral kez). Kontrol olarak yarasız solucanlar eşdeğer sayıda koruyun. </li><li> Survival (Yeni ağar plaka her 24 saatte transfer yaralı solucanlar) her 24 saat kontrol edin. Böyle GTL-2 veya tir-1, normalize yarasız kontrol hayvanlara olarak yara tamir kusurlu mutantlar yaralama sonra% 50 sağkalım ~ 24 saat gözlemleyin. Ölüm solucan çekme ile dokunmak lokomotor yanıt eksikliği olarak tanımlanır. </li></ol>

<ol><li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li>
<li>Sonnemann, K. J., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair%3A+toward+understanding+and+integration+of+single-cell+and+multicellular+wound+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 237-263 (2011).</li>
<li>Xu, S., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+G%CE%B1q-Ca2%2B+signaling+pathway+promotes+actin-mediated+epidermal+wound+closure+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A Gαq-Ca2+ signaling pathway promotes actin-mediated epidermal wound closure in C. elegans.</a> Curr Biol. 21, 1960-1967 (2011).</li>
<li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Curr Biol. 18, 481-489 (2008).</li>
<li>Chisholm, A. D., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+epidermis+as+a+model+skin.+II%3A+differentiation+and+physiological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. II: differentiation and physiological roles.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 879-902 (2012).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook+%3A+the+online+review+of+C.+elegans+biology%22">WormBook : the online review of C. elegans biology</a>. , 1-11 Forthcoming.</li>
<li>Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+killing+of+cells+in+Caenorhabditis+elegans.+Methods+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in cell biology.</a> 48, 225-250 Forthcoming.</li>
<li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-fungal+innate+immunity+in+C.+elegans+is+enhanced+by+evolutionary+diversification+of+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides.</a> PLoS Pathog. 4, (2008).</li>
<li>Tong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+regulation+of+Caenorhabditis+elegans+epidermal+damage+responses+by+death-associated+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Negative regulation of Caenorhabditis elegans epidermal damage responses by death-associated protein kinase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 1457-1461 (2009).</li>
<li>Zugasti, O., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmune+regulation+of+antimicrobial+peptide+expression+by+a+noncanonical+TGF-beta+signaling+pathway+in+Caenorhabditis+elegans+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neuroimmune regulation of antimicrobial peptide expression by a noncanonical TGF-beta signaling pathway in Caenorhabditis elegans epidermis.</a> Nat Immunol. 10, 249-256 (2009).</li>
<li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+chip-based+C.+elegans+microinjection+system+for+investigating+cell-cell+communication+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensor.%2C+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Microfluidic chip-based C. elegans microinjection system for investigating cell-cell communication in vivo.</a> Biosensor., & Bioelectronics. 50, 28-34 (2013).</li>
<li>Jansson, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+Conidia+of+Drechmeria+coniospora+to+Caenorhabditis+elegans+Wild+Type+and+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nematol%22%5BJournal%5D)">Adhesion of Conidia of Drechmeria coniospora to Caenorhabditis elegans Wild Type and Mutants.</a> J Nematol. 26, 430-435 (1994).</li>
<li>Hodgkin, J., Kuwabara, P. E., Corneliussen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+bacterial+pathogen%2C+Microbacterium+nematophilum%2C+induces+morphological+change+in+the+nematode+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel bacterial pathogen, Microbacterium nematophilum, induces morphological change in the nematode C. elegans.</a> Curr Biol. 10, 1615-1618 (2000).</li>
<li>Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgenic+C.+elegans+by+biolistic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of transgenic C. elegans by biolistic transformation.</a> J Vis Exp. (42), (2010).</li>
<li>Hashmi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+nematodes+using+arrays+of+micromechanical+piercing+structures%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures.</a> BioTechniques. 19, 766-770 (1995).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışmasının farkında değildir.

iğne ve lazer yaraladığı Burada sunulan yöntemler hasarı onarmak için epidermal epitel yeteneğini değerlendirmek için tamamlayıcı yaklaşımlar sağlamak. Iğne yaralama epidermis, manikür, ve büyük olasılıkla iç bodrum zarlarını bozan ise Lazer yaralama, epidermise sınırlı olabilir nispeten lokalize ve (lazer konfigürasyonuna bağlı olarak) &#39;dir. İğne yaralama daha doğru patojenlerin veya doğal ortamda mekanik hasar sebebiyle ortaya çıkan yaraların benzeyebilir. Bir kural olarak, iğne yaralama hayvan yaşam ile uyumlu ke...

Cilt yara iyileşmesi mekanizmaları temel biyolojik ilgi ve insan sağlığına uygun. Omurgalılar ve memelilerde yara iyileşmesi düzenli yanıt birçok dokuda ve 1 sinyal karmaşık bir dizi ihtiva eder. Birçok basit bir genetik model organizmalar da cilt yaraları 2 şifa yeteneğine sahiptir. Bu cilt yara onarım genetik uysal modellerini analiz nedenle ilgi olduğunu. Biz ve diğerleri cilt yara için yeni model 3,4 şifa olarak Caenorhabditis elegans kullanmaya başlamışlardır. Bu protokolün amacı C kullanmak için araştırmacıların geniş bir dizi sağlamaktır bir araç olarak elegans epidermal yara iyileşmesinin moleküler ve hücresel mekanizmaları araştırmak. C. elegans cilt (ayrıca hipodermiste olarak da bilinir) epidermis ve dışı manikür 5 içermektedir. Yetişkin Epidermis büyük sinsityum k olan çok çekirdekli sinsitiyumların az sayıda oluşturulmaktadırnown olarak hyp7. Epidermis kendi apikal yüzeyinde manikür salgılar basit epitel olduğunu. Cilt aktif cilt-delici patojenlere karşı savunmak ve küçük yaralar 4 onarabilir. C yara onarımı elegans cilt tüm vahşi tip hayvanların iğne veya lazer radyasyonun sebep olduğu lokal deri hasarı nedeniyle küçük delici yaraları hayatta hayatta neredeyse, sağlamdır. C elegans cilt yaralama epidermal doğuştan gelen bağışıklık yanıtı, yara kapama ve skar oluşumu 4 olmak üzere tepkilerin bir paketi, tetikler. Yetişkin Epidermis post-mitotik ve yara iyileşmesi, epidermal proliferasyonu veya hücre göçü karşı lokal hücresel yanıtları içerir. O cilt yaralanma membran TRPM kanal GTL-2 ve iç Ca 2 + mağaza 3 gerektiren, Ca 2 + epidermal büyük ve devamlı bir artış tetikler göstermiştir. Epidermal Ca 2 + sinyal F-aktin halkalarının oluşumuna ve kapatma wo için gerekli olanund sitesi. Yaralama ayrıca nlp-29 gibi amper transkripsiyonunu aktive doğuştan gelen bağışıklık yanıtları uyarır. amper yaralama kaynaklı transkripsiyon, bir TIR-1 epidermis 4 özerk hareket / PMK-1 p38 MAP kinaz kaskad bağlıdır. Ya Ca 2 + sinyal yolu ya da doğuştan gelen bağışıklık yanıtının kusurlar düşük sağkalım sonrası yaralama yol açacaktır. C nispeten basit bir yapı elegans epidermis, in vivo görüntüleme için genetik tractability ve avantajları yara onarım birden yönlerini incelemek için o mükemmel bir sistem yapmak. Iğne yaralama ve lazer yaralama: Burada yaralama iki ortak yöntemleri için protokolleri sunuyoruz. İğne yaralama (iğne çektirmenin dışında) hiçbir özel ekipman gerektirir ve tecrübesi ile günde solucanlar yüzlerce yapılabilir. İğne yaralanma agar plakaları üzerinde büyüyen hayvanlar üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bunun aksine, lazer yaralama Anes gerçekleştiriliranestezisi sağlanır hayvanlar bir lamel altında ped agar üzerine monte edilmiş ve hasara karşı hücresel yanıtların canlı görüntüleme için uygundur.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-8</td><td></td></tr><tr><td>Plastik Petri plakası</td><td>Tritech Research</td><td>T3308</td><td>60 mm</td></tr><tr><td>Levamisol</td><td>Sigma</td><td>L9756</td><td>12 mM</td></tr><tr><td>Borosilikat cam kılcal</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>İğne çektirme</td><td>Sutter Aleti&nbsp;</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Sonsuz vida ucu (platin tel)</td><td>Tritech Research</td><td>PT-9010</td><td></td></tr><tr><td>M9 çözeltisi</td><td>Ev yapımı</td><td></td><td>3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O ila 1 litre. Trizol Invitrogen 15596026 otoklavlayarak sterilize edin</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>50 solucan için 500 ml kullanın</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green</td><td>Bio-Rad</td><td>1708882</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>PCR makinesi</td><td>Bio-Rad</td><td>C1000/CFX96</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu PCR tüpleri</td><td>Bio-Rad</td><td>MLL9601</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü analiz yazılımı</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>Metamorf</td><td></td></tr></tbody></table>

içinde yara yanıtları cilt yaralayarak yöntemleri ve testler ° c. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

C. elegans epidermis ve manikür yaralama kaynaklanan lokalize hasarı onarmak basit ama sofistike deri tabakası oluşturur. Bu modelde, yara cevaplarını ve onarım çalışmaları sitoskeletal ve doku hasarına genomik yanıtların anlamamıza ışıklı var. En sık kullanılan iki yöntemler C. yara elegans yetişkin deri mikroenjeksiyon iğneler, ve yerel laserler ile azabı vardır. Yerel yaralama İğne manikür, epidermis ve ilişkili dışı matriks bozan ve aynı zamanda iç dokularına zarar verebilir. Daha lokalize hasara lazer ışınlama ile sonuçlanır. Yaralama yüksek epidermal Ca 2+ (saniye-dakika), oluşumu ve yara yerinde (1-2 saat), antimikrobiyal peptit genlerin yüksek transkripsiyon bir aktin içeren halkanın kapatılması da dahil olmak üzere kolayca tahlil tepkilerin bir arkaya (2-24 tetikler saat), ve skar oluşumu. Esasen bütün vahşi tip yetişkin hayvanlar, nerede yaralama hayattayara onarımı veya diğer cevaplar kusurlu mutantlar olarak hayatta kalma azalma göstermektedir. Detaylı iğne ve lazer yaraladığı protokoller ve kantitatif ve yara tepkiler ve onarım süreçleri (Ca dinamikleri, aktin dinamikleri, antimikrobiyal peptit indüksiyon ve hayatta kalma) görselleştirme için testler sunulmaktadır.

Böyle GCaMPs gibi Ca sensörleri (Şekil 1) ile görüntülendi lazer veya iğne yaralama, epidermal Ca düzeylerinde hızlı ve sürekli yükseklik tetikleyecektir. Ca yükseklik saniye içinde oluşur ve birkaç dakika onlarca yükseltilmiş olarak kalır. Çoğaltılabilir yaralama İğne Yaralı sitelerde (Şekil 2), F-aktin halkaların oluşumu ile sonuçlanır; Bu dakika içinde görünür ve yaralama sonra yavaş yavaş yakın 1-2 saat üzerinde. Aktin halkaları daha az sıklıkta daha hassas lazer yaralama sonra oluş...

Yetişkin C. elegans derisi, yara kapanması, yara oluşumu ve doğuştan gelen bağışıklık dahil olmak üzere epitelyal yara tepkileri çalışmaları için izlenebilir bir modeldir.

Içinde Yara Yanıtları Cilt yaralayarak Yöntemleri ve Testler ° C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yara görme zarafetini sağlamak için kullanılan yöntemleri göstermek ve yaraya karşı epidermal tepkileri görselleştirmektir. Bu, epidermisin bir mikroenjeksiyon iğnesinden gelen deliklerin neden olduğu küçük deliklerle yaralanmasıyla elde edilebilir. İkinci bir yaralama yöntemi lazer ışınlaması kullanır.Bu, mikroskopi için monte edilmiş hayvanlar üzerinde yapılabilir ve yara yanıtının anında görüntülenmesine izin verir. Sonuçlar, yaralamanın epidermal kalsiyumun hızlı bir şekilde yükselmesini tetiklediğini, ardından yara bölgesi çevresinde birkaç saat içinde kapanan bir aktin halkasının birikmesini ve böylece yaranın iyileşmesine izin verdiğini göstermektedir. Ve burada gösterilen lazer yaralama yöntemleri, şu anda nematod C Elgan'da en yaygın kullanılan cilt yaralama yöntemleridir.Bu yöntemler, cilt hücrelerinin yaralanmayı nasıl tespit ettiği ve buna nasıl tepki verdiği gibi yara böbrek alanındaki temel soruları ele almak için kullanılır. Hayvanları yavaşlatmak için yaklaşık yarım saat boyunca buzun üzerine genç yetişkin solucanlar içeren bir tabak koyun. Bu soğumaya bağlı uyuşukluk, hassas iğne yarası için önemlidir.Solucanlar normalde stereo mikroskop altında yaralanmak için çok hızlı hareket ettiğinden, solucanları görüntüleyin ve bir kazma kullanarak hepsini plakanın ortasına taşıyın. Ardından, 100 mikrolitrelik bir pipet ucuyla mikro enjeksiyon için kullanılana benzer bir iğneyi tutun. Bir iğne tutucu olarak, iğne ucunu bir solucanın her iki ucuna getirin, gonadlardan kaçının, ya posterior pH farenks ile iç gonad arasında ya da posterior gonad ile rektum arasında.Ardından kütiküle yaklaşık olarak dik bir açı ekleyin. Solucanın içine yaklaşık beş ila 10 mikron nüfuz eden kısa ve yumuşak bir iğne yapın. Bu iğne yaraları bağırsak gibi iç organlara da zarar verebilir.Yaradan sızan hücresel içeriği gözlemlemek için bir dakika bekleyin. Birkaç saniyelik sızıntı tamamdır, ancak bundan daha fazlası yaranın öldürücü olacağını gösterir. Yara yanıtlarının görüntülenmesi, yara lateral epidermal sinsityumda veya lateral dikişte yapılırsa en kolay olacaktır.İğne yaralanmasında, büyük bir iğne yerine küçük bir delik açmak çok önemlidir. Merdiven solucanları hızla öldürebildiğinden, bir yara tepkisi oluşturmak için gerekli minimum hasarı tekrarlanabilir bir şekilde sağlamak için pratik gereklidir: Her hayvanı kırılana veya kirlenene kadar aynı iğneyi kullanarak yaralamaya devam edin. Tecrübe ile plakadaki 25 hayvanın tümünü beş dakika içinde yaralamak oldukça mümkün Tam olarak nematodlar üzerinde.Bu protokol, dönen bir disk fokal mikroskop çizgisine bağlı bir femto segment lazer veya iki foto mikroskoptakiler gibi femto femtosaniye litre kullanarak nokta taramaları kullanır. Ayrıca yeterli olmalı. Bir burgu pedi üzerinde 10 genç yetişkin toplayarak başlayın.Onları iki mikrolitrelik bir damla 12 milimolar lail solüsyonunda felç edin. Daha sonra üzerlerini bir örtü ile örtün ve felç olana kadar birkaç dakika bekleyin. Hayvanın tamamen felç olması şarttır.12 mili daha fazla sadece yanıtı etkilemeyecektir. Bununla birlikte, diğer immobilizasyon yöntemleri de kullanılabilir. Femtosaniye lazer gücünün, objektiften önce ölçüldüğü gibi 140 miliwatt'a ayarlandığından ve lazer tekrarlama oranının 80 megahertz'de olduğundan emin olun.Şimdi, epidermal hücrenin apikal yüzeyine odaklanarak, hedef solucanın lateral, anterior veya posterior sinsityal epidermisine odaklanan yüksek sayısal açıklığa sahip 100 x objektif kullanarak dönen bir disk konfokal mikroskobu altında solucanları bulun. Lazeri 20 milisaniye ile ayrılmış iki adet 200 milisaniyelik darbe için parlatın. Bu epidermisi yaralamak için yeterli olmalıdır.Bir dakika bekleyin ve köpürme olarak görünecek olan sitoplazmanın lokal bozulmasını gözlemleyin. Bir floresan belirteç varsa, lokalize ağartma gözlenebilir. Bu protokol, G Camp three gibi epidermisteki kalsiyum sensörlerini eksprese eden ve ayrıca transgen ekspresyon seviyesi için dahili bir kontrol olarak TD domates gibi kırmızı bir floresan proteini eksprese eden C zarafetini kullanır.Her iki yaralama yöntemi de dönen disk konfokal mikroskobu ile bunu görüntülemek için kalsiyum yükselmelerini tetiklese de, yara iki saniyelik bir aralık süresi ve 114 milisaniyelik bir uyarma ve lazer pozlaması ile hızlandırılmış görüntüler elde ettikten sonra lazer yaralama kullanılmalıdır. Lazer yaralama için kullanılanla aynı büyütme, her 30 saniyede bir veya daha uzun süre görüntü alınabilen iki saatlik kurslar gibi daha uzun süreler için uygundur. Metin protokolü, analiz rutinleri önerir.Bu protokol, iğne yaralama kültüründen sonra çağrı 19 gibi epidermal spesifik bir promotörün kontrolü altında bir F aktin belirteci GFP mosin eksprese eden solucanlar kullanır. Yaralı solucanlar 20 santigrat derecede bir saat boyunca kuluçka makinesine tabi tutulur ve daha sonra iğne yaralanmasından hemen sonra aktin dinamiklerini incelemek için Zacks'i aktin halkasının görüntü oluşumuna götürür, yaralı hayvanları bir slayt üzerindeki bir burgu pedine aktarın ve onları lail ile uyuşturun. Daha sonra konvansiyonel konfokal mikroskopi kullanarak hayvanları görüntüleyin.Halka çapını ölçmek için aktin halkasını ölçmek için bir ila iki saat boyunca 0.5 mikrometre aralıklarla Zacks'i edinin. İlk olarak, Z yığınının maksimum yoğunluk projeksiyonunu yapın ve GFP MOI'leri ve halkası üzerinde birbirinden 45 derecede dört çizgi taraması çizin. Ardından, halkanın çapını, kapanmış halkalar için dört taramanın ortalama tepe tepe mesafesi olarak hesaplayın.Çap sıfır O olarak tanımlanır, lazer veya iğne yarası, kalsiyum sensörü G kampı tarafından görselleştirildiği gibi epidermal kalsiyum seviyelerinde hızlı ve sürekli bir artışı tetikler. Ön gövdedeki epidermisin yanal görünümü, epidermal çekirdek olan bir X ve N DeMars ile işaretlenmiş lazer yarasını gösterir. Kalsiyum artışı yara bölgesinden hızla yayılır Bir yara bölgesinden 2040 ve 60 mikrondaki kalsiyum seviyelerinin ölçülmesi, bu erken kalsiyum yanıt kinetiğini göstermeye yardımcı olur.Kalsiyum yükselmesi onlarca dakika kalır ve iğne yarası güvenilir bir şekilde kalır. İki saat içinde yara bölgelerinde yavaş yavaş kapanan f aktin halkalarının oluşumuna neden olur. Bu, hayvanlarda P çağrısı 19 GFP MOI'leri kullanılarak görselleştirildi.Bu halkalar daha az sıklıkla hassas lazer yaralama ile üretilir. Akton halkasının çapı, dört satırlık bir tarama kullanılarak ölçüldü. Çizgi taramalarının nicelleştirilmesi, aktin halkasının yaradan çeşitli mesafelerde nasıl farklı yoğunluklara sahip olduğunu gösterir. Site.Bu yara iyileştirme yöntemlerinin geliştirilmesi, araştırmacıların, doğuştan gelen bağışıklık tepkileri ve yara kapanması da dahil olmak üzere, yara onarımının birçok yönü için bir model olarak deniz zarafetinden yararlanmalarına izin vermiştir. Femto segment lazerlerin tehlike arz ettiğini unutmayın. Femto segment lazerle çalışan herkes lazer güvenliği eğitimini tamamlamış olmalıdır.

methods-for-skin-wounding-and-assays-for-wound-responses-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, solucan epidermisinde çok hassas yaralanmalara neden olmak için kullanılan bir lazer yaralama yöntemini tanıtmaktadır. Örnek protokol, yara tepkisi ve onarımı üzerine yapılan bir çalışmadan alınmıştır.

Epidermal Lazer Yarası: C. elegans'ta Onarım Süreçlerini İncelemek İçin Lokalize Hasara İndükleme

Çok geç evre Drosophila embriyoların embriyonik epidermis hızlı lastik yara cevap analizi için bir in vivo sistemi sağlar ve memeli modelleri tercüme için, yara iyileşmesi çalışmalar ilerlemek için genetik manipülasyon ya da mikro-enjeksiyon kimyasal tedaviler ile kombine edilebilir.

Mikroenjeksiyon Yara Deneyi ve<em&gt; In vivo</em&gt; Epidermal lokalizasyonu Tepki Gazeteciler Yara<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar.

Bir protokol C. anoksi / açlıkla kullanan tarif edilir iskemi / reperfüzyon modeli elegans. Fonksiyonel sonuçlar artmış mortalite, GFP etiketli nöronal süreçleri görünür anormallikleri, ve nöronal fonksiyonu gerektiren bozulmuş davranışsal tepkileri içermektedir.

Iskemi / reperfüzyon içinde bir anoksisi-açlık Modeli<em&gt; C. elegans</em

Mechanobiology araştırma için yeni araçlar nasıl mekanik stres anlamak için gerekli biyokimyasal yollar etkinleştirir ve biyolojik yanıt aydınlığa çıkartıyor. Burada, hücresel tepkilerin yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlayan bir mikrosıvısal tuzak ile immobilize hayvanların seçici mekanik uyarılması için yeni bir yöntem vitrin.

Mekanik stimülasyon ve yüksek çözünürlük görüntüleme C. elegans bir havacilik aygıtı kullanma

Bu el yazması kültürlü epitel hücre monolayers üzerinde yapılan nasıl kesi benzeri lezyonlar elverişli bir konuma sahip modeli şifa vitrogörüntüleme için tarafından confocal sağlayan, yarası. açıklar veya lazer tarama mikroskobu ve yüksek kaliteli sağlayabilir nicel ve nitel veri hücre davranış ve mekanizmaları geçişinde dahil çalışmak için.

Mikroskopi Vitro yara iyileşmesi sırasında epitel hücre göç değerlendirilmesi için yöntemleri temel

Biz bir non-invaziv vivo içinde aerodinamik ve maliyet-etkin, protokolü Imaging görselleştirmek ve reaktif oksijen türlerine (ROS) bir fare excisional yara modelinde oluşturulan ölçmek için L-012, bir chemiluminescent luminol-analog, kullanan açıklar.

Vivo Reaktif oksijen türleri içinde bir fare görüntüleme modeli yara

Burada, primer fibroblastlar kullanarak in vitro çizik testve farelerde in vivo deri yara iyileşmesi test için bir protokol salıyoruz. Her iki tahliller in vitro ve in vivo yara iyileşmesini değerlendirmek için basit yöntemlerdir.

In Vitro ve In Vivo In Vivo Analizi Yara İyileşmesi için Scratch Migration Tahlil ve Dorsal Skinfold Odası

Burada, biri hücresel ve sitokin yara iyileştirici yanıtlarını değerlendirmek, diğeri ise yara kapatma oranını ölçmek için tasarlanmış iki murine yara iyileşmesi modeli tanımlanmıştır. Bu yöntemler, kötü yara iyileşmesiçeşitli yönlerini mekanizmaları belirlemek için diyabet gibi karmaşık hastalık modelleri ile kullanılabilir.

Dorsal Subkutan Polivinil Alkol Sünger İmplantasyonu ve Eksizyonal Kuyruk Deri Yara Modelleri kullanılarak Akut Yara İyileşmesinin Değerlendirilmesi.

Yara kaynaklı poliploidizasyon, hücrelerin hücre kaybını telafi etmek için bölmek yerine boyut olarak büyüdüğü korunmuş bir doku onarım stratejisidir. Burada epitel yara onarım ploidy ve genetik düzenleme ölçmek için bir model olarak meyve sinek nasıl kullanılacağı hakkında ayrıntılı bir protokoldür.

Yara kaynaklı Poliploidizasyonu Incelemek için Bir Drosophila Modeli

Burada, ex vivo insan derisini kullanarak yara onarımını değerlendirmek için optimize edilmiş bir teknik ve tam montajlı bir boyama yaklaşımı sergiliyoruz. Bu metodoloji, potansiyel yara tedavilerinin değerlendirilmesi için klinik öncesi bir platform sağlar.

Cilt Onarımını Doğru Değerlendirmek için İnsan Ex vivo Yara Modeli ve Tam Montajlı Boyama Yaklaşımı

Bu yazıda, canlı bir Clytia hemisphaerica medusa'nın epitelinde yara oluşturmak ve in vivo olarak yüksek çözünürlükte yara iyileşmesini görüntülemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Ek olarak, yara iyileşmesi sırasında epitel hücrelerinde ve hücre dışı matrikste sinyal süreçlerini bozmak için boyalar ve ilaçlar tanıtmak için bir teknik sunulmaktadır.

Cnidarian Model Organizma Clytia hemisphaerica'yı Kullanarak İn Vivo Epitelyal Yara İyileşmesini Karakterize Etmek

Öğrenin C. elegans epidermisinde yara yanıtlarını görselleştirme yöntemlerini. Mikroenjeksiyon iğnesi ve lazer ile yaralama teknikleri, kalsiyum sinyallemesi ve aktin halka oluşumunu incelemek için kullanılır.

Içinde Yara Yanıtları Cilt yaralayarak Yöntemleri ve Testler ° C. elegans

Daha fazla video keşfet