Içinde Yara Yanıtları Cilt yaralayarak Yöntemleri ve Testler ° C. elegans

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yara görme zarafetini sağlamak için kullanılan yöntemleri göstermek ve yaraya karşı epidermal tepkileri görselleştirmektir. Bu, epidermisin bir mikroenjeksiyon iğnesinden gelen deliklerin neden olduğu küçük deliklerle yaralanmasıyla elde edilebilir. İkinci bir yaralama yöntemi lazer ışınlaması kullanır.

Bu, mikroskopi için monte edilmiş hayvanlar üzerinde yapılabilir ve yara yanıtının anında görüntülenmesine izin verir. Sonuçlar, yaralamanın epidermal kalsiyumun hızlı bir şekilde yükselmesini tetiklediğini, ardından yara bölgesi çevresinde birkaç saat içinde kapanan bir aktin halkasının birikmesini ve böylece yaranın iyileşmesine izin verdiğini göstermektedir. Ve burada gösterilen lazer yaralama yöntemleri, şu anda nematod C Elgan'da en yaygın kullanılan cilt yaralama yöntemleridir.

Bu yöntemler, cilt hücrelerinin yaralanmayı nasıl tespit ettiği ve buna nasıl tepki verdiği gibi yara böbrek alanındaki temel soruları ele almak için kullanılır. Hayvanları yavaşlatmak için yaklaşık yarım saat boyunca buzun üzerine genç yetişkin solucanlar içeren bir tabak koyun. Bu soğumaya bağlı uyuşukluk, hassas iğne yarası için önemlidir.

Solucanlar normalde stereo mikroskop altında yaralanmak için çok hızlı hareket ettiğinden, solucanları görüntüleyin ve bir kazma kullanarak hepsini plakanın ortasına taşıyın. Ardından, 100 mikrolitrelik bir pipet ucuyla mikro enjeksiyon için kullanılana benzer bir iğneyi tutun. Bir iğne tutucu olarak, iğne ucunu bir solucanın her iki ucuna getirin, gonadlardan kaçının, ya posterior pH farenks ile iç gonad arasında ya da posterior gonad ile rektum arasında.

Ardından kütiküle yaklaşık olarak dik bir açı ekleyin. Solucanın içine yaklaşık beş ila 10 mikron nüfuz eden kısa ve yumuşak bir iğne yapın. Bu iğne yaraları bağırsak gibi iç organlara da zarar verebilir.

Yaradan sızan hücresel içeriği gözlemlemek için bir dakika bekleyin. Birkaç saniyelik sızıntı tamamdır, ancak bundan daha fazlası yaranın öldürücü olacağını gösterir. Yara yanıtlarının görüntülenmesi, yara lateral epidermal sinsityumda veya lateral dikişte yapılırsa en kolay olacaktır.

İğne yaralanmasında, büyük bir iğne yerine küçük bir delik açmak çok önemlidir. Merdiven solucanları hızla öldürebildiğinden, bir yara tepkisi oluşturmak için gerekli minimum hasarı tekrarlanabilir bir şekilde sağlamak için pratik gereklidir: Her hayvanı kırılana veya kirlenene kadar aynı iğneyi kullanarak yaralamaya devam edin. Tecrübe ile plakadaki 25 hayvanın tümünü beş dakika içinde yaralamak oldukça mümkün Tam olarak nematodlar üzerinde.

Bu protokol, dönen bir disk fokal mikroskop çizgisine bağlı bir femto segment lazer veya iki foto mikroskoptakiler gibi femto femtosaniye litre kullanarak nokta taramaları kullanır. Ayrıca yeterli olmalı. Bir burgu pedi üzerinde 10 genç yetişkin toplayarak başlayın.

Onları iki mikrolitrelik bir damla 12 milimolar lail solüsyonunda felç edin. Daha sonra üzerlerini bir örtü ile örtün ve felç olana kadar birkaç dakika bekleyin. Hayvanın tamamen felç olması şarttır.

12 mili daha fazla sadece yanıtı etkilemeyecektir. Bununla birlikte, diğer immobilizasyon yöntemleri de kullanılabilir. Femtosaniye lazer gücünün, objektiften önce ölçüldüğü gibi 140 miliwatt'a ayarlandığından ve lazer tekrarlama oranının 80 megahertz'de olduğundan emin olun.

Şimdi, epidermal hücrenin apikal yüzeyine odaklanarak, hedef solucanın lateral, anterior veya posterior sinsityal epidermisine odaklanan yüksek sayısal açıklığa sahip 100 x objektif kullanarak dönen bir disk konfokal mikroskobu altında solucanları bulun. Lazeri 20 milisaniye ile ayrılmış iki adet 200 milisaniyelik darbe için parlatın. Bu epidermisi yaralamak için yeterli olmalıdır.

Bir dakika bekleyin ve köpürme olarak görünecek olan sitoplazmanın lokal bozulmasını gözlemleyin. Bir floresan belirteç varsa, lokalize ağartma gözlenebilir. Bu protokol, G Camp three gibi epidermisteki kalsiyum sensörlerini eksprese eden ve ayrıca transgen ekspresyon seviyesi için dahili bir kontrol olarak TD domates gibi kırmızı bir floresan proteini eksprese eden C zarafetini kullanır.

Her iki yaralama yöntemi de dönen disk konfokal mikroskobu ile bunu görüntülemek için kalsiyum yükselmelerini tetiklese de, yara iki saniyelik bir aralık süresi ve 114 milisaniyelik bir uyarma ve lazer pozlaması ile hızlandırılmış görüntüler elde ettikten sonra lazer yaralama kullanılmalıdır. Lazer yaralama için kullanılanla aynı büyütme, her 30 saniyede bir veya daha uzun süre görüntü alınabilen iki saatlik kurslar gibi daha uzun süreler için uygundur. Metin protokolü, analiz rutinleri önerir.

Bu protokol, iğne yaralama kültüründen sonra çağrı 19 gibi epidermal spesifik bir promotörün kontrolü altında bir F aktin belirteci GFP mosin eksprese eden solucanlar kullanır. Yaralı solucanlar 20 santigrat derecede bir saat boyunca kuluçka makinesine tabi tutulur ve daha sonra iğne yaralanmasından hemen sonra aktin dinamiklerini incelemek için Zacks'i aktin halkasının görüntü oluşumuna götürür, yaralı hayvanları bir slayt üzerindeki bir burgu pedine aktarın ve onları lail ile uyuşturun. Daha sonra konvansiyonel konfokal mikroskopi kullanarak hayvanları görüntüleyin.

Halka çapını ölçmek için aktin halkasını ölçmek için bir ila iki saat boyunca 0.5 mikrometre aralıklarla Zacks'i edinin. İlk olarak, Z yığınının maksimum yoğunluk projeksiyonunu yapın ve GFP MOI'leri ve halkası üzerinde birbirinden 45 derecede dört çizgi taraması çizin. Ardından, halkanın çapını, kapanmış halkalar için dört taramanın ortalama tepe tepe mesafesi olarak hesaplayın.

Çap sıfır O olarak tanımlanır, lazer veya iğne yarası, kalsiyum sensörü G kampı tarafından görselleştirildiği gibi epidermal kalsiyum seviyelerinde hızlı ve sürekli bir artışı tetikler. Ön gövdedeki epidermisin yanal görünümü, epidermal çekirdek olan bir X ve N DeMars ile işaretlenmiş lazer yarasını gösterir. Kalsiyum artışı yara bölgesinden hızla yayılır Bir yara bölgesinden 2040 ve 60 mikrondaki kalsiyum seviyelerinin ölçülmesi, bu erken kalsiyum yanıt kinetiğini göstermeye yardımcı olur.

Kalsiyum yükselmesi onlarca dakika kalır ve iğne yarası güvenilir bir şekilde kalır. İki saat içinde yara bölgelerinde yavaş yavaş kapanan f aktin halkalarının oluşumuna neden olur. Bu, hayvanlarda P çağrısı 19 GFP MOI'leri kullanılarak görselleştirildi.

Bu halkalar daha az sıklıkla hassas lazer yaralama ile üretilir. Akton halkasının çapı, dört satırlık bir tarama kullanılarak ölçüldü. Çizgi taramalarının nicelleştirilmesi, aktin halkasının yaradan çeşitli mesafelerde nasıl farklı yoğunluklara sahip olduğunu gösterir. Site.

Bu yara iyileştirme yöntemlerinin geliştirilmesi, araştırmacıların, doğuştan gelen bağışıklık tepkileri ve yara kapanması da dahil olmak üzere, yara onarımının birçok yönü için bir model olarak deniz zarafetinden yararlanmalarına izin vermiştir. Femto segment lazerlerin tehlike arz ettiğini unutmayın. Femto segment lazerle çalışan herkes lazer güvenliği eğitimini tamamlamış olmalıdır.