Nucleofection İnsan THP-1 Makrofagların Yüksek Verimli Transfeksiyonu

Bu prosedürün genel amacı, yüksek hücre canlılığı olan ve hücre aktivasyonu olmayan insan THP bir makrofajını güvenilir bir şekilde transfekte etmektir. Bu, ilk olarak THP bir monositin 48 saat boyunca önceden ayırt edilmesiyle gerçekleştirilir. İşlemin ikinci adımı, erken TP bir makrofajın ayrılmasıdır.

Üçüncü adım, lonza'nın nükleo faktör teknolojisini kullanarak hücreleri IRNA veya plazmid DNA ile transfekte etmektir. Son adımlar, hücreleri yeniden tohumlamak ve daha da farklılaştırmaktır. Sonuç olarak, başarılı gen yıkımı veya aşırı ekspresyonu, kantitatif gerçek zamanlı PCR, Western blot geri dönüşü vb. yoluyla gösterilebilir.

Bu tekniğin lipofeksiyon gibi diğer transfeksiyon yaklaşımlarına kıyasla en büyük avantajı, yüksek hücre canlılığı ile birlikte yüksek transfeksiyon verimliliği elde edebilmemiz ve mikrofaj fonksiyonunu ve davranışını değiştirmememizdir. Ne yazık ki, bu teknik yüksek seviyeli uygulamalar için uygun değildir, çünkü bu protokol için aynı anda daha yoğun bir transfect gerçekleştirilemez. Transfeksiyondan 24 saat önce RPMI 1640'ta THP bir hücreyi% 10 FCS ve% 1 kalem strep L glutamin ile kültürleyin, hücreleri ayırın ve onlara taze ortam sağlayın.

Ertesi gün. 75 santimetre karelik bir doku şişesinde 10 ila 15 milyon hücreyi, takviye edilmiş RPMI ortamına,% 1 esansiyel olmayan amino asitler,% 1 sodyum piruvat,% 10 mililitre başına 10 nanogram, PMA ve 48 saat sonra 50 mikromolar beta merkaptoetanol ile tohumlayarak hücreleri önceden ayırt edin, ortamı aspire edin ve altı mililitre Accutane ile değiştirin. Biri hücreleri ayırmak için 37 santigrat dereceye kadar ısındı.

Kuluçka sırasında 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Hücrelerin nükleo sonrası sevgi bakımı için yeterli transfeksiyon ortamı ve yetiştirme ortamı hazırlayın. 30 dakika sonra, hücrelerin ayrıldığını ve etrafa baktığını kontrol edin.

Bazı hücreler hala bağlıysa, şişeyi bir mikro pipetle hafifçe pompalayın veya çıkarmak için basit bir çalkalama kullanın. Kazıyıcı kullanmayın. Süspansiyonu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 300 Gs'de ve oda sıcaklığında beş dakika santrifüjleyin, süpernatanı aspirasyonla çıkarın ve hücre peletini yeniden süspanse edin.

Bir mililitre RPM'de, 37 santigrat dereceye kadar orta ısıtın, hücreleri sayın ve anında transfeksiyon için iki ila iki buçuk milyon hücre içeren mikro çöp tüpü alikotları yapın. Bu protokolün hızlı bir şekilde yürütülmesi esastır. Hücre ölümü kaybını önlemek için, tüm materyallerin önceden hazırlandığından emin olun İlk santrifüj, tüm transfeksiyon alikotları 250 GS'de ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca dönerken, tüm nükleo efektör veterinerlere yarım mikrogram plazmid DNA veya bir mikrogram SI RNA yükleyin Veterinerin minimum hacmini işgal etmeleri için yüksek konsantrasyonlu seyreltme kullanın.

Şimdi süpernatanı hücre alikotlarından sadece birinden aspire edin. Hücreleri nükleo faktör çözeltisinde 100 mikrolitreye kadar askıya alın. Hücrelerin 15 dakikadan fazla solüsyona maruz kalmasına izin vermeyin.

Hücreleri Q veterinerine aktarın ve hafifçe vurarak karıştırın. Daha sonra, iki model B nükleo faktörü üzerinde Y 0 0 1 programını kullanarak hücreleri transfekte edin. Tek kullanımlık bir pipet kullanarak, elektroporasyonlu hücreleri bir reaksiyon şişesine taşıyın ve hemen hücrelere yarım mililitre önceden uyarılmış transfeksiyon ortamı ekleyin.

Şimdi, hepsi transfekte olana kadar her bir hücre alikotu ile işlemi tek tek tekrarlamaya devam edin. Çekirdek sevgisini tamamladıktan sonra, hücrelerin her bir transfeksiyonunu 2.5 mililitre ılık transfeksiyon ortamı ile altı oyuklu bir plakanın kuyusuna aktarın. Her birini bir mikro pipetle iyice karıştırın.

Yüklenen tüm plakaların dört saat boyunca inkübe etmesine izin verdikten sonra, hücrelerin durumunu mikroskop altında kontrol edin. Dört saat sonra, gerekirse hücrelerin çoğu plakaya yapıştırılmalıdır. En fazla.

Bir saatlik başka bir kuluçka süresi, her seferinde bir kuyu üzerinde çalışarak yeterli sahe sağlayacaktır. Transfeksiyon ortamını yapışan hücrelerden aspire edin ve eşit hacimde ılık yetiştirme ortamı ile değiştirin. Bu adım sırasında hücreleri ayırmamaya dikkat edin.

Şimdi, hücreleri gerektiği kadar uzun süre kuluçkaya yatırın. Gerekirse, her 48 saatte bir ortamı değiştirin, tedavileri uygulamak için plan yapın, böylece transfekte edilen DNA veya RNA en yüksek etkiye ulaştığında sona erer. Hücreleri efektörlerle tedavi ederken, PMA ve beta merkaptoetanol içermeyen serum içermeyen bir ortam kullanın.

Hücrelerin serum olmadan 24 saatten fazla kuluçkaya yatmasına izin vermemeye dikkat edin. Protokol transfekte etmek için kullanıldı, IRNA hücresel morfolojisine sahip THP bir makrofajlar değerlendirildi. Akış sitometrik ölçümüne göre.

Hücrelerde apoptoz ve nekroz oranı hem transfekte edilmiş kültürlerde hem de kontrol kültürlerinde düşüktü. Bununla birlikte, dikkatli sayımlar, transfekte edilen örnekler için hem apoptoz hem de nekrozun biraz daha yüksek olduğunu ortaya koydu. Bunun nedeni, transfekte edilmiş THP bir makrofajların plakalardan ayrılmasının, UNT transfekte edilmiş hücrelere göre daha zor olması olabilir.

Genel olarak, transfeksiyon oranları akış sitometrisi ile analiz edildiği gibi% 90'ın üzerindeydi. Floresan S-I-R-N-A kullanılarak transfeksiyon verimliliği de floresan mikroskobu ile doğrulandı. Transfeksiyonun işlevselliği, IL 10 RB ekspresyonunun genetik olarak yıkılmasıyla gösterildi.

Kısa enterferans yapan RNA kullanma Bir kez ustalaştıktan sonra, transfect, uygun şekilde gerçekleştirilirse bir ila bir buçuk saat içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, kültür ortamının performans üzerinde önemli bir etkisi olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu, metin protokolünde özetlenmiştir.