Asya Tiger Sivrisinek içinde Photoperiodic Diapause RNA-seq Analizler Deneysel ve Biyoinformatik Protokolü, Aedes albopictus

Aşağıdaki deneyin genel amacı, foto periyodik diyapoz yanıtının transkripsiyonel bileşenlerini tanımlamaktır. Model olmayan bir sivrisinek seksenleri dirsek pictus'unda, bu, ilk olarak farklı foto periyodik tedaviler yoluyla biyolojik olarak çoğaltılmış diyapoz ve diyapoz olmayan yumurta örneklerinin üretilmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, yüksek verimli RNA dizilimi için her replikadan RNA çıkarılır.

RNA dizileri daha sonra onları konglar halinde birleştirmek ve açıklama eklemek için hesaplamalı olarak işlenir. Sonuç olarak, diyapoza neden olan ve diyapoza neden olmayan foto dönemlere yanıt olarak gen ekspresyonundaki varyasyonlar, Reeds MAP'den RNA düzeneğine kadar çıkarılabilir. Bu tekniğin, mikroışın analizi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, genom dizisi veya bir mikrodizi gibi önceki bir genetik kaynağın, diyapoz koşullarına yanıt olarak gen ekspresyonunun küresel tahminlerini elde etmek için gerekli olmamasıdır.

Bu yöntem, DPO'ların transkripsiyonel temeli veya model olmayan organizmalardaki diğer önemli ekolojik adaptasyonlar gibi ekolojik genomik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, yeterli miktarda diyapoz ve DPO olmayan yumurta elde etmek zor olabileceğinden ve aşağı akış biyoinformatik analizi zor olabileceğinden mücadele edeceklerdir. Bu yöntem için ilk olarak, yüksek verimli DNA dizileme teknolojilerinin daha uygun fiyatlı hale geldiğini fark ettiğimizde ve prosedüre başlamadan önce model olmayan organizmalarda tüm genom ekspresyon profillerini elde etmek için zor bir yöntem sunduğumuzda aklımıza geldi.

Optimum diyapoz ifadesi ve yaklaşık %80 bağıl nem için 21 santigrat derecede programlanabilir aydınlatmalı iki fotoğraf periyodu kabini ayarlayın Bir kabini 16 sekiz açık karanlık döngü ile diyapoza neden olmayan bir fotoğraf periyodu için programlayın ve diğerini ışıklar aynı anda açıkken diyapoza indükleyen sekiz 16 açık karanlık döngü için programlayın her iki kabinin fotoğraf dönemleri arasındaki sirkadiyen zamanı senkronize etmesi için. Daha sonra, uygun sayıda yumurta için yumurta kağıtlarını 500 mililitre deiyonize suya batırın ve bir mililitre öğütülmüş köpek maması ve salamura karides maması bulamacı ekleyin. Kabı ağ ile örtün, yerinde tutmak için ağın etrafına bir lastik bant yerleştirin.

Daha sonra yumurtaları 16 sekiz açık koyu uzun gün fotoğraf periyodu dolabında yaklaşık 24 saat kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, grup başına yaklaşık 30 yumurtadan çıkmış larvayı, 90 mililitre deiyonize su ile doldurulmuş 10'a 10'a iki santimetre Petri kaplarına aktarın. Her 48 ila 72 saatte bir, larvaları temiz bir tabağa aktarın ve her transferde taze yiyecek bulamacı ile besleyin.

Yaklaşık altı gün sonra, her bir fotoğraf periyodu işlemi için üç ila dört yetişkin kafesinin altını ıslak filtre kağıdı ile kaplayın ve durgun sudan kaçınırken kafesteki yerel nemi artırmak için filtre kağıdını yeterince deiyonize su ile nemlendirin. Kafesin yan tarafındaki kalıcı işaretleyici ile fotoğraf periyodunu, çoğaltma numarası kafesinin başlangıç tarihini ve deneyle ilgili diğer bilgileri not edin. Daha sonra 10 gün boyunca her gün, puy'u 25 mililitre su başına en fazla 50 puy olacak şekilde küçük bardaklar temiz suya deney için uygun yetişkin kafeslerine aktarın ve ortaya çıkan yetişkinlere şeker sağlamak için kafesin üst ağına organik kuru üzüm yerleştirin İlk kan yemeğinden dört ila beş gün sonra yumurta pozisyonunu uyarmak için, Dokulu, ağartılmamış bir kağıt havluyla kaplı koyu renkli 50 mililitrelik bardakları yarısına kadar deiyonize su ile doldurun ve yumurtaları toplamak ve saklamak için her kafese bir bardak koyun.

Her kafesteki yumurta kağıtlarını yeni kağıtlarla değiştirin, yakın zamanda çıkarılan kağıtları Petri kaplarına yerleştirin ve yumurta saklama üzerinde kafa karıştırıcı etkilerden kaçınmak için sekiz adet 16 açık koyu kısa gün fotoğraf dönemi dolabında saklayın. Toplama işleminden yaklaşık 48 saat sonra, yumurta kağıtlarını açık havada, gevşek ve dokunulduğunda hafif nemli olacak, ancak kağıtların sudan kararmasına veya yumurtadan çıkmayı teşvik etmesine neden olacak kadar ıslak olmayacak şekilde kurutun. Diyapoz olaylarını ölçmek için, her bir yumurta kağıdına yumurta sayısını kaydedin.

Daha sonra tek tek kağıtları yaklaşık 80 mililitre deiyonize su ile 90 mililitrelik bir Petri kabına tamamen daldırın. Yumurtadan çıkmalarını teşvik etmek için yaklaşık 0.25 mililitre yiyecek bulamacı ekleyin ve 24 saat sonra Petri kabını siyah bir yüzeye aktarın. Şimdi bir tarafına bir ışık kaynağı yerleştirin, larvalar ışıktan uzaklaşacak ve yıldız larvalarında ilk önce bireyin net bir şekilde çetelesini sağlayacaktır.

Bireylerin yeniden sayılmasını önlemek için saydıktan sonra her larvayı çıkarmak için bir pipet kullanın. Daha sonra yumurta kağıtlarını kuruması için yeni bir Petri kabına koyun. Bir hafta sonra ikinci bir yavru partisini saydıktan sonra, kalan yumurtadan çıkmamış yumurtalarla birlikte yumurta kağıtlarını, yaklaşık 80 mililitre taze ağartma solüsyonu içeren yeni 90 mililitrelik Petri kaplarına yerleştirin ve kağıtların tamamen ağartma solüsyonuna batırılmasına dikkat edin.

Kağıtları gece boyunca bir davlumbaz altında bırakın ve ertesi gün yumurtadan çıkmamış yumurtaların sayısını hesaplamak için bir ışık mikroskobu kullanın. Bir yumurta embriyonlaşırsa, sırt tarafında birbirine zıt iki küçük siyah nokta olarak görünen gözlerle kirli beyaz bir renk sergileyecektir. Başlamak için, kalan nükleazları gidermek ve RNA bozulmasını önlemek için tezgahı RNA dekontaminasyon solüsyonu ile dikkatlice temizleyin.

Daha sonra, gelişim zamanında gelişmekte olan embriyoları içeren en az 400 sivrisinek yumurtasını fırçalamak için bir deve kılı fırçası kullanın. Cam öğütücülere ilgi noktası. Bir çeker ocakta, bir mililitre triol ekleyin ve yumurtaları tamamen toz haline gelene kadar öğütün ve ardından triolde RNA ekstraksiyonunu gerçekleştirin, ardından üreticinin talimatlarına göre izopropanol çökeltme işlemini gerçekleştirin.

Şimdi, üreticinin talimatlarına göre, 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca 50 mikrolitre reaksiyonda 10 mikrograma kadar RNA başına bir mikrolitreye kadar D ns kullanın. Daha sonra, reaksiyonu oda sıcaklığında beş dakika boyunca beş mikrolitre askıya alınmış DNA inaktivasyon reaktifi içinde inkübe edin. Kuluçka süresi boyunca süspansiyonu üç kez hafifçe girdaplayın.

Daha sonra RNA ekstraktlarını 10.000 kez G ve Eloqua'da 1.5 dakika boyunca süpernatanlar içeren RNA'yı dizileme için taze tüplere santrifüjleyin. Son olarak, elde edilen yeni nesil sıralama verilerinin okuma, hazırlama, derleme ve açıklamadan diferansiyel ifade analizine kadar nasıl işleneceğine ilişkin ayrıntılar için ekteki metne bakın. Bu ilk şekilde, iki temsili RNA örneğinin florometrisi, yaklaşık 2000 nükleotidde iki bant göstermektedir.

Böcek 28'in ribozomal RNA'sı, kısa süreli ısıtma veya hidrojen bağlarını kıran maddelerle kolayca bozulan hidrojen bağları tarafından bir arada tutulan iki polinükleotid zincirinden oluşur. Elde edilen iki bileşen, ikinci RNA örneğinde 18 s'lik bir ribozomal RNA ile yaklaşık olarak aynı boyuttadır, bu temsili deneyde yüksek düzeyde bozunma gözlemlenebilir. Bir albopictus sivrisineğinin temsili bir grubunun foto periyodik tedavisi, kısa gün yetiştirilen sivrisineklerde yüksek diyapoz olaylarına ve uzun gün yetiştirilen sivrisineklerde düşük diyapoz olaylarına neden oldu.

Kopyalar arasında bazı farklılıklar olmasına rağmen, örneğin, kısa ikinci gün grubu, diğer kopyalardan daha düşük bir diyapoz olayı sergiledi. Dijital olarak normalleştirilmiş okumalardan oluşan bir Trinity montajı, ortalama conig uzunluğu 1020 3.1 ve maksimum Conti uzunluğu 20.892 olan 76.377 contig ile sonuçlandı. Conti uzunluklarının dağılımının daha kısa contiglere doğru büyük ölçüde çarpık olduğunu unutmayın.

Bu, Denovo transkriptom düzeneğinin tipik bir örneğidir. Bu son grafikte, yumurta pozisyonundan 11 ve 21 gün sonra diyapoza neden olan koşullar altında yetiştirilen embriyoların benzer bir iş akışından elde edilen diferansiyel ekspresyon analizleri, bu iki zaman periyodu arasında 3.128 farklı şekilde ifade edilen geni ortaya koymaktadır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde yapılırsa, doku oluşturma ilahi bilişim analizinden altı ila sekiz ay içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü denerken, bir sonraki adıma geçmeden önce her adımdaki başarının doğrulanması gerektiğini unutmamak önemlidir. Örneğin, bu prosedürü takiben RNA bütünlüğünü test etmeden önce deneysel koşulların DPA'lar ve diyapoz olmayan yumurtalar ürettiğini onaylayın. Kantitatif R-T-P-C-R veya karşılaştırmalı genomik analiz gibi diğer yöntemler, ilgilenilen genlerin doku veya gelişime özgü ekspresyonu ve/veya moleküler evrim süreçleri ile ilgili ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.

Triol ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken eldiven, laboratuvar önlüğü ve çeker ocak kullanmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.