Bir Üç boyutlu Kollajen Matrix içindeki Hücre Göç Analizi

Bu prosedürün genel amacı, hücrelerin üç boyutlu ortamdaki göç davranışını analiz etmektir. İlk olarak, ilgilenilen hücreleri üç boyutlu bir kollajen kafesine gömün. Ardından, hızlandırılmış video mikroskobu ile hücrelerin hareketini kaydedin, daha sonra bilgisayar destekli hücre takibi ile migrasyon parametrelerini tanımlayın ve bir elektronik tablo yazılımı uygulaması kullanarak hücre izleme verilerini analiz edin.

Sonuç olarak, bu yöntem, kanser bağlamında kanser hücrelerinin veya lökositler, lenfositler ve kök hücreler gibi normal hücrelerin göçünü hangi faktörlerin ve sinyal iletim yollarının düzenlediğini araştırmak için kullanılabilir. Bu nedenle, hücre göçü, modüle edici faktörler ve ilişkili sinyal transeksiyon yolları hakkında bilgi, tümör hücresi göçünü ve metastatik yayılmayı bozmak için yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesi için yardımcı olabilir. Göç odaları için iki kat erimiş parafin balmumu, vazelin karışımını bir cam slaytın ortasına hızlı bir şekilde fırçalayın, bir kapak ekleyin, kaydırın ve iki kat parafin mumu, vazelin karışımı ile kapatın.

Daha sonra göç odalarını 1,5 mililitrelik reaksiyon tüplerine bir rafa dik konumda yerleştirin. Kollajen süspansiyonu için 20 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. 50 mikrolitre 10 XMEM ve 27 mikrolitre %7.5 Sodyum bikarbonat çözeltisini birleştirin, iyice karıştırın.

Daha sonra 375 mikrolitre sıvı kollajen süspansiyonu ekleyin ve pH'ı 7.5 olan açık mor bir renk için iyice karıştırın. Şimdi 50 mikrolitre hücre süspansiyonuna 100 mikrolitre son kollajen süspansiyonu ekleyin ve kollajen lifinin başladığını not ederken iyice karıştırın. Polimerizasyon. PH 7.5'te, karışımı göç odalarına aktarın.

Kollajen süspansiyon hücresi karışımını migrasyon zinciri haznesinin altına eşit olarak dağıtmak için migrasyon haznesine hafifçe vurun. Göç odalarını rafa dik konuma getirin ve 30 dakika inkübe edin. Polimerize kollajen kafesi hafif bulanık olduğunda, ancak yine de açık mor bir renk olduğunda, göç odalarını uygun ortamla doldurun ve göç odasını parafin mumu ile kapatın.

Vazelin karışımı. Göç odasında 37 x büyütme kullanarak mikroskop aşaması ısıtıcısını 10 santigrat dereceye ayarlayın. Görüş alanında yaklaşık 50 hücreye veya daha fazlasına odaklanın.

Çok kameralı bir video gözetim yazılımı uygulaması kullanarak hücre göçünü hızlandırılmış modda kaydedin. Hücre migrasyon filmlerini uygun bir dosya biçiminde kaydedin. Hücre geçişi film dosyalarını, hücre türü ve deneysel koşullar gibi destekleyici bilgileri içeren bir veritabanına bağlayın.

Ardından, tarafsız bir analiz için uygun bir hücre izleme yazılımı uygulaması kullanarak hücre göçü filmlerini analiz edin. Hücrelerin toplamda göçmen aktif olup olmadığını bilmeden analiz için hücreleri rastgele seçin, tipik bir hücre göçü deneyinde hücre başına yaklaşık 60 XY koordinatı belirleyin. Hücre bölünmesi durumunda, izlemede takip etmek için rastgele bir yavru hücre seçin.

Bir hücrenin geçirdiği toplam mesafeyi hesaplamak için elektronik tablo programı gibi uygun bir yazılım uygulaması kullanarak hücre izleme verilerini analiz edin. Mikrona dönüştürmek için sayısal piksel değerlerinin toplamını bir düzeltme faktörü ile çarpın. 25 mikron eşiğinden daha az göç eden hücreleri hareket etmeyen hücreler olarak tanımlayın ve sayısal değerleri virgülle değiştirin.

Ardından, lokomotor aktiviteyi, iki zaman noktası arasında hareket eden izlenen hücre popülasyonunun hücrelerinin yüzdesi olarak hesaplayın. Ayrıca, aktif hareket süresini, gözlem süresinin zaman çerçevesine göre bir hücrenin taşındığı toplam sürenin yüzdesi olarak hesaplayın. Ardından, adam Whitney U testini kullanarak istatistiksel anlamlılığı hesaplayın ve hücre göç verilerini görüntüleyin.

Tipik bir hücre izleme veri dosyası, her sütunun izlenen bir hücreyi temsil ettiği bir tabloya benzer. Satırlar, hücre hareketiyle ilgili konumsal bilgileri içerir. Zamanla, hücrelerin lokomotif davranışı, analiz edilen hücre popülasyonunun ortalama lokomotor aktivitesi ve ayrıca aktif hareket süresi ile karakterize edilebilir.

Bu örnek, dört bağımsız deneyden elde edilen 120 hücrenin göç aktivitelerini göstermektedir. Her elmas, bir hücrenin en az iki zaman noktası arasında hareket ettiğini gösterir. Gri çizgiler hareketli ve hareketsiz hücreleri ayırt eder.

Lokomotif aktivitesinin parametresi bir XY diyagramı veya bir kutu grafiği olarak görüntülenebilir. Analiz edilen hücre popülasyonunun dinamiklerini görselleştirmek için, bir histogram aynı hücrelerin aktif olduğu süreyi etkili bir şekilde gösterir. MDA, HER2 ve M-D-A-N-E-O meme kanseri hücre hatlarının göç davranışının bu analizi, her iki hücre hattının da benzer spontan lokomotor aktivite sergilediğini göstermektedir.

Aktif zaman parametresi, M-D-A-N-O meme kanseri hücrelerine kıyasla biraz daha fazla sayıda spontan hareket eden M-D-A-H-E-R hücresi ortaya çıkardı. Mililitre EGF başına 100 nanogram ile stimülasyon, hareketli hücrelerin sayısı ve aktif hareket süresi ile ölçüldüğü gibi MDA HER2'nin önemli ölçüde artmış bir göç aktivitesi ile sonuçlandı. İlginç bir şekilde, M-D-A-N-E-O hücreleri, EGF stimülasyonuna yanıt olarak göç etti ve fosfolipaz c gama bir inhibitörü uc 3 1 22 ile kaydırılmış bir zaman aktif model tedavisi gösterdi, hem MD-E-R iki hem de MDAN'ın hem spontan hem de EGF'nin neden olduğu göçü azalttı.

EEO hücreleri. Zaman aktif parametresinin analizi, MDAN EEO hücrelerinin iki mikromolar U 7 3 1 2 2 ile muamelesinin, esas olarak hareket etmeyen hücrelerin artmasına atfedilen, belirgin şekilde azalmış bir lokomotor aktivite ile sonuçlandığını ortaya koydu. Lenfositlerin ve lökositlerin üç boyutlu bir kollajene göçüne hakim olduktan sonra, harfler ve ment, tümör hücrelerinin gece boyunca kaydedildiği yaklaşık iki saat içinde kaydedilebilir.