Name: Kemirgen Gözyaşı bezi kurgulama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Keşfedin kemirgen gözyaşı bezi gelişimini ex vivo kültür ve immünofloresan mikroskopi kullanarak. Bu yöntem sinyal yolaklarını analiz ederek göz sağlığı araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar ucsf Kaynak Tahsis Programı tarafından sağlanan fon kabul etmek istiyorum.

Tüm hayvan çalışmaları Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu önerilere sıkı göre altında yapıldı. Protokol California Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC), San Francisco tarafından onaylandı. 1. Fare Embriyonik Gözyaşı bezleri (LG): Hasat ve Mikrodiseksiyon <ol><li> Bilimsel Araştırma Etik komite için Kurumsal Hayvanlar tarafından onaylanan prosedürleri takiben uygun embriyonik günde hasat embriyolar servikal dislokasyon tarafından onaylanması ardından, yükselen CO 2 inhalasyon ile hamile CD-1 (veya transgenik) kadın aşımına euthanize. Vajinal fiş keşif e0&#39;ın gün belirleyin. Not: Gözyaşı bezleri (Lgs) itibaren e14 tek tomurcuk aşamasından hasat edilebilir. Ancak, e16 (5-10 tomurcukları) embriyolar ex vivo kültür için en tutarlı sonuçlar verir. </li><li> V sterilize% 70 etanol kullanılarak fare Entral tarafında. Cildi çimdik ve steril cerrahi makas ile orta hatta bir kesi yapmak; deri yoluyla kesilmiş ve karın boşluğuna maruz periton. 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiş Her bir uterusa ve yerine soğuk PBS (fosfat tamponlu salin) ya da DMEM F12 ortamında üstündeki mesometrium boyunca keserek 2 rahim boynuzları çıkarın. </li><li> Forseps kullanarak (# 5), amnion kesesi embriyolar çıkarın ve soğuk PBS içeren ikinci bir steril Petri kabı içine yerleştirin. Gözleri veya kafa alana dokunmayın dikkatli olun. </li><li> Bir transillüminasyonu tabanı ile bir mikroskop üzerine embriyo yerleştirin. 1.7 - embriyo &lt;E17 ise, adımları 1.5 gerçekleştirin. Embriyolar iseniz&gt; E17, bu adımlar bu nedenle 1.8 adıma geçin, faydalı olabilir, ancak şart değildir. </li><li> Sadece alt çene altındaki gövde (aşama 1, şekil 2) &#39;deki Bağın gelen kafa Severga steril neşter (# 10 bıçak). Mandibula diseksiyon plaka üzerinde şimdi böylece başını döndürün. Kafa ve yaklaşık ¼ beyin (adım 2, 1. kesim, Şekil 2) dorsal tarafına kaldırmak için bir neşter stabilize forseps kullanın - Bu kıkırdak e15 etrafında stiffens kez özellikle önemlidir. </li><li> Neşter gözler arasındaki burun delmek böylece başını döndürün. Gözleri ayrı yarımları (aşama 2, 2. kesme, Şekil 2) artık demektir ki, başlığın merkezinden geçen bir kesim yapın. </li><li> İki # 5 forseps kullanarak, başın bir yarısını almak ve aşırı doku (Şekil 2 adım 3) çıkarın. (Gözün alt arka köşede bulunur) LG bu kaldırma işlemi kayıp değil bu yüzden başını yönlendirmek için emin olun. Fazlalığı serebral, kıkırdak ve burun çevresindeki doku ve gözün altında çıkarın. Bezi bu noktada zor görünür olduğundan, doğru aşırı doku kaldırma t sonra yönlendirilmiş gözü sağlamako LG konumunu kaybetmemek. </li><li> Dikkatle posterior, hem forseps ile göz alt köşesinde cildi kapmak. Dikkatle LG maruz forseps ile açık çekerek cildi çıkarın. LG görselleştirmek yardımcı olmak için doku altında ve üstünde ek aydınlatma kullanın. Not: LG, koyu, yoğun mezenşimin içinde bir kanal üzerinde bir tomurcuk olarak görünüm ile ayırt, bu noktada görünür olmalıdır. </li><li> Dikkatle LG ve ilgili mezenşimi LG veya ilişkili kanalı kapmak için dikkatli olmak, forseps kullanarak uzak çevreleyen dokudan (diyagram ve görüntüler bakın) incelemek başlar. Bezi çevreleyen dokudan serbest sonra, yavaşça LG kanalının dibinde gözünü çevreleyen epitel kavrayarak tüm bezini çıkarın. Yoğunlaştırılmış bir mezenşimin içine epitel invaginates olarak görülebilir epiteli çevreleyen mezenşimi korumak için özen gösterin. Not: Tissu&#39;dan bazı ilave gerie (herhangi bir küçük kemik fragmanları, kas ve bağ doku) komşu / büyüme faktörü sinyal önlemek için gerekli olabilir. </li><li> Kültür, hasat 4 - 5 bezleri ve plaka başına ilişkili mezenşimin (Lgs hemen diseksiyon üzerine ekilir); RT-PCR 6 RNA lisis tampon 100 ul başına 14 bezlerinin en az toplamak. </li></ol> 2. ex vivo Kültür Plakaları hazırlayın Bu prosedür, gelişmekte olan tükürük bezi 7,8 için kullanılana dayanır. <ol><li> Cam tabanlı bir 50 mm çaplı bir mikro çanak 7 50 ug / ml, askorbik asit ve 50 ug / ml holo-transferrin ile birlikte kültür ortamı (100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiş), DMEM F12 200 ul ekle. Not: Daha önce embriyonik tükürük bezinde morfogenetiğine maksimize etmek için bunu buldum DMEM F12 seçildi. </li><li> 13 mm POLYCARB Floatmedyanın üstüne 0.1 mikron gözenekleri ile onat membran filtre. </li><li> İsteğe bağlı Adım: 3 mg / ml&#39;lik bir son konsantrasyon sağlamak için DMEM / F12 ile 1 (hafifçe karıştırmak için, 200 ul pipet kullanın, santrifüj 1 dakika boyunca kabarcıklar görüldüğünde): 3-D laminin 1 seyreltin. Ekle Bu 15 ul filtre 3-D laminin seyreltilmiş. Not: Bu seyreltme epitel dallanma ödün vermeden, 3B durumda LG muhafaza edilmesi için uygun olduğu bulunmuştur. Bununla birlikte, LG&#39;nin kültürü için gerekli değildir. </li><li> Filtrenin üzerine ya da laminin içine 5 LG - 4 yerleştirin. Kültür Lgs ex vivo olarak 24 - 48 saat (Şekil 3) veya 20 qPCR daha fazla analiz için dk ya da immüno-boyama (Şekil 4)% 4 PFA ile yapışması. Embriyonik glandüler doku QPCR analizi için, Rebustini ark bakın., 2011. Embriyonik bez dokularında imüno-analizi için aşağıdaki alıntılarda bakınız: Hoffman ve arkadaşları, (2002), Steinberg ör.T ve arkadaşları., (2005). </li></ol> 3. Fare Postnatal ve Erişkin Gözyaşı bezleri (LG): Diseksiyon <ol><li> Uygun hayvan etik komitenin standartlarına göre doğum sonrası fareyi euthanize. Doğum sonrası yavrular gün 8 ya da daha genç, steril makas ile kafa kesilmesinin euthanize. Doğum sonrası gün 8 veya üzeri için,% 70 etanol ile kürk sprey. </li><li> LG bulmak için, fare yukarıdan aydınlatma ile bir mikroskop altında yan yanal yatıyordu. Not: doğum sonrası ve yetişkin LG karotid arter, masseter kas ve dermis (Şekil 5) ile çevrelenmiştir. </li><li> Küçük diseksiyon makas kullanarak, yanal LG nerede olması gerektiğini Epidermisteki küçük bir kesi yapmak. </li><li> Forseps kullanarak, LG maruz kulak doğru epidermis çekerek açın. </li><li> Yavaşça çevreleyen dokudan LG gevşetmek için forseps kullanın. </li><li> LG çevreleyen dokudan serbest bırakıldıktan sonra, dikkatli, kanal tarafından LG kaldırmakkanal ve göz çevresindeki epitel (Şekil 1) bağlamak nerede kavrama tarafından. </li><li> RT-PCR için RNA, liziz tamponu içinde LGS yerleştirin veya immün için 20 dakika boyunca% 4 PFA ile yapışması. </li></ol>

<ol><li>Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmunity+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+keratoconjunctivitis+sicca%5BTitle%5D)+AND+%22Current+allergy+and+asthma+reports%22%5BJournal%5D)">Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca.</a> Current allergy and asthma reports. 14, 403(2014).</li>
<li>Makarenkova, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF10+is+an+inducer+and+Pax6+a+competence+factor+for+lacrimal+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF10 is an inducer and Pax6 a competence factor for lacrimal gland development.</a> Development. 127, Cambridge, England. 2563-2572 (2000).</li>
<li>Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+regulation+of+lacrimal+gland+secretory+processes%3A+relevance+in+dry+eye+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+retinal+and+eye+research%22%5BJournal%5D)">Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases.</a> Progress in retinal and eye research. 28, 155-177 (2009).</li>
<li>Nigam, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+can+the+intrinsic+power+of+branching+morphogenesis+be+used+for+engineering+epithelial+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Concise review: can the intrinsic power of branching morphogenesis be used for engineering epithelial tissues and organs.</a> Stem cells translational medicine. 2, 993-1000 (2013).</li>
<li>Qu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosaminoglycan-dependent+restriction+of+FGF+diffusion+is+necessary+for+lacrimal+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Glycosaminoglycan-dependent restriction of FGF diffusion is necessary for lacrimal gland development.</a> Development. 139, Cambridge, England. 2730-2739 (2012).</li>
<li>Rebustini, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MT2-MMP-dependent+release+of+collagen+IV+NC1+domains+regulates+submandibular+gland+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">MT2-MMP-dependent release of collagen IV NC1 domains regulates submandibular gland branching morphogenesis.</a> Developmental cell. 17, 482-493 (2009).</li>
<li>Hoffman, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+Profiles+of+Mouse+Submandibular+Gland+Development%3A+FGFR1+Regulates+Branching+Morphogenesis+in+Vitro+Through+BMP-+and+FGF-Dependent+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gene Expression Profiles of Mouse Submandibular Gland Development: FGFR1 Regulates Branching Morphogenesis in Vitro Through BMP- and FGF-Dependent Mechanisms.</a> Development. 129, 24-5778 (2002).</li>
<li>Steinberg, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGFR2b+signaling+regulates+ex+vivo+submandibular+gland+epithelial+cell+proliferation+and+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGFR2b signaling regulates ex vivo submandibular gland epithelial cell proliferation and branching morphogenesis.</a> Development. 132, Cambridge, England. 1223-1234 (2005).</li>
<li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnox%2C+SM+%22Parasympathetic+innervation+maintains+epithelial+progenitor+cells+during+salivary+organogenesis%22">Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis</a>. 329, Science. New York, N.Y. 1645-1647 (2010).</li>
<li>Magenheim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+restrain+pancreas+branching%2C+differentiation+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth.</a> Development. 138, Cambridge, England. 4743-4752 (2011).</li>
<li>Jaskoll, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF10%2FFGFR2b+signaling+plays+essential+roles+during+in+vivo+embryonic+submandibular+salivary+gland+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">FGF10/FGFR2b signaling plays essential roles during in vivo embryonic submandibular salivary gland morphogenesis.</a> BMC developmental biology. 5, 11(2005).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature cell biology. 16, 118-126 (2014).</li>
<li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasympathetic+stimulation+improves+epithelial+organ+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration.</a> Nature communications. 4, 1494(2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Kültürüne çok yönlülük ve LG ex vivo gelişimini incelemek için önemli avantajlar sağlamaktadır manipüle. Bu araştırmacı hipotezleri ve nöronal, endotelyal ve mezenkimal hücreler organı oluşturacak nasıl etkileşimde epitel değerlendirmek için yapılabilir pertürbasyonların sayıda test edebilir hızını içerir. Bu modeli kullanarak, ancak, uyarılar bir dizi bulunmaktadır. İlk olarak, izolasyon sayesinde bezi sırada artık sinirler veya kan damarlarının 9,10 tarafından teslim sinyalleri ile bağlantılı olara...

Gözyaşı bezi (LG) görme keskinliği ve sağlık, bakım ve göz yüzeyinin hücrelerinin korunması için kritik sulu gözyaşı salgılanmasından sorumludur. Batma, ışık duyarlılığı ile karakterize ve vizyonunu 1 azalır sulu eksik Kuru Göz Hastalığı: En sık ve zayıflatıcı göz bozuklukları birinde LG disfonksiyon sonuçları. İnsanda LG gözün lateral ucunda yukarıdaki yörüngede bulunduğu yeri 3 - oküler yüzey üzerine 5 boşaltım kanalları mevduat gözyaşları. Fare büyük göz bezlerinin üç çift, çoğu çalışılan tek bir boşaltım kanalı yoluyla göze seyahat gözyaşları ile kulak (exorbital) için gözyaşı bezi (LG) bulunduğu ön ve ventral olduğunu. Diğer glandular organlara benzer şekilde, LG, yoğunlaştırılmış mezenşim içinde tek bir epitel tomurcuk birden tomurcuğu mermi ve talimat için oluk oluşumu maruz kalmakta ve epitel dallanma morfojenezinin sürecinde gelişir(Şekil 1) salgılama asinüs ve kanalların karmaşık bir birbirine birleşik ağ m 2. Gelişimi sırasında epitel vaskülare olur yanı olarak ağır şekilde üstün servikal ganglion 3 sempatik sinirler tarafından pterigopalatin ganglion parasempatik sinirler tarafından ve daha az bir ölçüde innerve. Türleri nöronal, epitel, endotel ve mezenkimal hücreler yani bu hücrelerin her biri arasındaki etkileşimleri, işlevi ve yetişkin doku bakımı için gereklidir. Ancak, arası hücre tipi iletişim bu süreçleri kılavuzları nasıl yanı sıra LG gelişimini ve yenilenmesini koordine yatan moleküler mekanizmalar belirsizdir. Embriyonik ex vivo kültür tekniklerinin ortaya çıkışı, çok dallanmış organ 4 gelişimsel ve rejeneratif yolların belirlenmesi izin vermektedir. Ex vivo kültürlenmesiyle araştırmacıya (beni organı manipüle yeteneği verirchanical, genetik veya kimyasal) tanımlanmış koşullar altında yanı sıra gerçek zamanlı organ gelişimi ve hücre-hücre etkileşimleri karakterize etmek. Farenin exorbital LG, bu tekniğin son derece müsait olduğunu ve son çalışmalar gelişimini 2,5 düzenleyen sinyalizasyon sistemi tanımlamıştır. Ancak, LG gelişimini ve yenilenmesini destekleyen moleküler ipuçlarını anlamak için ihtiyaca rağmen, şu anda büyük olasılıkla nedeniyle organın izole teknik zorluklar, ilgili yeterli kalır. Bu yazıda, izole ve gelişim programları tanımlamak için embriyonik fare LG ex vivo kültürünü gerçekleştirmek için nasıl açıklar.

<table><tbody><tr><td>HEPES içermeyen DMEM / F12</td><td>SH3027101</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>P0781</td><td>sığır serumundan Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Albümin çözeltisi</td><td>A9576</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit% 16 Çözelti</td><td>15710</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>1x'te %4'e Seyreltilmiş PBS</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Su 10x</td><td>BP665-1</td><td>Fisher Scientific Fosfat</td><td></td></tr><tr><td>Tamponlu Tuzlu Su 1x</td><td></td><td></td><td>10x stok</td></tr><tr><td>holo-Transferrin sığır</td><td>T1283</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25&nbsp'den hazırlanmıştır; su içinde mg / ml stok çözeltisi. Tek kullanımlık alikotları -20&nbsp'de dondurun; & derece ; C. DMEM / F12 ortamına 50 &nbsp; nihai konsantrasyona ekleyin; &mu; g/ml'dir.</td></tr><tr><td>L-askorbik asit (C Vitamini)</td> <td>A4544</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25 &nbsp; su içinde mg / ml stok çözeltisi. Tek kullanımlık alikotları -20&nbsp'de dondurun; & derece ; C. DMEM / F12 ortamına 50 &nbsp; nihai konsantrasyona ekleyin; &mu; g/ml'dir.</td></tr><tr><td>BioLite 100 mm Doku Kültürü İşlem Görmüş Kaplar</td><td>130182</td><td>Thermo Scientific</td><td>Doku kültürü uygulanmamış plakalar da kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Alt kademeli aydınlatıcılı Stereo Mikroskop</td><td>Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss</td><td>İletilen bir ışık tabanına sahip herhangi bir stereo diseksiyon mikroskobu kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Stereo Mikroskop için Alt Kademe Aydınlatıcı Tabanı</td><td>TLB 4000</td><td>Diagnostics Instruments, Inc.</td><td></td></tr><tr><td>Şahin 35&nbsp; mm Doku Kültürü İşlem Görmüş Yemekler</td><td>353001</td><td>Corning Doku</td><td>kültürü ile muamele edilmemiş plakalar da kullanılabilir.</td></tr><tr><td>50 mm kaplamasız cam alt tabaklar</td><td>P50G-1.5-14-F</td><td>MatTek Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Geniş alan floresan mikroskobu</td><td>Axio Observer Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td>Herhangi bir floresan mikroskobu (dik, ters çevrilmiş veya stereo diseksiyon mikroskobu), takılı bir dijital kamera ile düşük büyütmede GFP ekspresyonunu izlemek için kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Konfokal Mikroskop</td><td>TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td>Detaylı hücre yapılarını görmek için konfokal mikroskopi gereklidir. Herhangi bir konfokal mikroskop kullanılabilir.</td></tr><tr><td>İSVİÇRE Mikro İnce Forseps, #5 (11.2&nbsp; cm)</td><td>17-305X</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td>Epitelden mezenşimin çıkarılması için ince uçlar gereklidir. Tungsten iğneleri de kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Dumont Standart Uçlu Forseps, #5 (11&nbsp; cm)</td><td>91150-20</td><td>Güzel Bilim Araçları (ABD), Inc.</td><td>Embriyolardan bez toplamak için idealdir.</td></tr><tr><td>Yeniden Kullanılabilir Plastik Cerrahi Bıçak Sapları, stil no. 3.</td><td>4-30</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Paslanmaz Çelik Steril Cerrahi Bıçaklar, no. 10</td><td>4-310</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous-Micro Total RNA İzolasyon Kiti</td><td>AM1931</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 3D Kültür Matrisi Laminin I</td><td>3446-005-01</td><td>Trevigen</td><td>6 mg / ml stok DMEM / F12 ile 1: 1 oranında seyreltilmiş</td></tr><tr><td>Zamanlanmış hamile Crl: CD1 (ICR) fareler</td><td></td><td>Charles River Labs</td><td>Embriyoları 14. günde hasat edilir (fiş keşif günü 0. gün olarak belirlenmiştir).</td></tr><tr><td>Nükleopor İzi Kazınmış Hidrofilik Membranlar, 0.1&nbsp; &mu; m gözenek boyutu, 13&nbsp; mm</td><td>110405</td><td>Whatman</td><td></td></tr><tr><td>Zamanlanmış hamile Pax6-Cre, GFP fareleri</td><td>Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>LG'nin nasıl bulunacağını öğrenmek için isteğe bağlı fareler.</td></tr></tbody></table>

kemirgen gözyaşı bezi kurgulama

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

Gözyaşı bezi (LG) korneanın yapısını ve işlevini, görme için gerekli şeffaf bir doku korumak için gerekli sulu gözyaşı salgılar. 5 kanallar - insanda bir tek LG 3 ile oküler yüzeye gözyaşları veren her gözün lateral ucunda yukarıdaki yörüngede bulunur. Fare büyük göz bezlerinin üç çift, çoğu okudu kulağına exorbital gözyaşı bezi (LG) bulunduğu ön ve ventral olduğunu. Diğer glandular organlara benzer şekilde, LG, yoğunlaştırılmış mezenşim içinde tek bir epitel tomurcuk salgılama asinüs ve kanalların karmaşık bir birbirine birleşik bir şebekenin oluşturulması için tomurcuk ve kanal formasyonu birçok kere maruz kalmakta ve epitel dallanma morfojenezinin sürecinde gelişir. Bu ayrıntılı süreci iyi gibi pankreas ve tükürük bezi gibi diğer birçok epitelyal organlarda belgelenmiştir. Bununla birlikte, LG daha az araştırılmıştır ve morfojenezini kontrol eden mekanizmalar zayıf biçimde altındadırdurdu. Biz bir model sistem olarak bu altında temsil bulma diseksiyon ve LG kültürleme ile ilişkili zorluklar bir sonucu olduğunu sanıyorum. Bu nedenle, burada diseksiyon hasat embriyonik ve doğum sonrası LG için teknikler ve doku ex vivo kültür için yöntemleri tarif eder.

LG epitel dallanma morfojenezinin sürecinde gelişir. E14, e15, E16, E17, ve P2 disseke embriyonik LGS aydınlık görüntüler bu olay göstermektedir. <img alt="Şekil 1," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51970/51970fig1highres.jpg" width="600"> Şekil 1. LG morfogenetiğine dallanma epitel sürecinde gelişir. Taze e14, e15, E16, E17 ve P2 disseke embriyonik LGS aydınlık görüntüler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/5...

Gözyaşı bezi (LG) vizyon ve göz sağlığını korumak için gerekli gözyaşının sulu bileşenlerini üreten bir dallanma organdır. Burada LG gelişiminde rol oynayan sinyal yolları deşifre üzere kemirgen LG diseksiyonu ve ex vivo kültür teknikleri açıklar.

Kemirgen Gözyaşı bezi kurgulama

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bez gelişimi sırasında sinyalleşme olaylarının manipülasyonu ve analizi için ex vivo bir yaklaşım kullanarak lakrimal bez gelişimini analiz etmektir. Bu, ilk olarak 16. gün embriyolarının lakrimal bezlerinin diseke edilmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, bezler, lakrimal bez gelişimini değiştiren küçük moleküllü inhibitörler veya büyüme faktörleri içeren kültür, ortam içinde yüzen filtrelere yerleştirilir.24 saat sonra, bezler sabitlenir ve ilgilenilen gelişimsel proteinler için immün boyama yapılır. Sonuç olarak, ex vivo lakrimal bez gelişimi sırasında protein ekspresyonundaki değişiklikler immünofloresan mikroskobu ile analiz edilebilir. Bu yöntem, gözyaşı bezi gelişimi alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.Örneğin, gözyaşı bezini tanımlayan sinyal mekanizmaları nelerdir? Morfogenez: Bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir, çünkü lakrimal bezin erken embriyonik gelişim sırasında bazı görsel rehberlik ve onu bulmak için pratik yapmadan tanınması zordur. Lakrimal bezi embriyonik bir fareden toplamak için, embriyonik bir günün, 14 ila 16 hamile farenin ventral tarafını sterilize etmek için% 70 etanol kullanın.Daha sonra cildi sıkıştırın ve peritonu ortaya çıkarmak için hayvanın orta hattı boyunca cildi kesin, karın boşluğunu ve myometriumu ortaya çıkarmak için peritonu kesin ve myometriumun her iki boynuzunu çıkarın ve soğuk PBS'ye yerleştirin. Daha sonra, embriyoları amniyotik keselerden soğuk PBS içeren ikinci bir steril Petri kabına aktarmak için beş numaralı forseps kullanın, gözlere veya baş bölgesine dokunmamaya dikkat edin. Başı gövdeden kestikten sonra, alt mandibulanın hemen altında, mandibula şimdi diseksiyon plakası üzerinde olacak şekilde kafayı döndürün.Daha sonra kafayı stabilize etmek için forseps ve beynin sırt tarafının yaklaşık dörtte birini çıkarmak için bir neşter kullanın, kafayı neşterin gözler arasındaki burnu delebileceği şekilde yönlendirin ve ardından başın ortasından bir kesik yapın, böylece gözler şimdi ayrı yarımlarda olur. Daha sonra, yukarıdaki ve altındaki aydınlatmayı kullanarak, cildi gözün arka alt köşesinden tutun ve daha koyu yoğunlaştırılmış bir mezenşim içindeki bir kanal üzerinde tomurcuk olarak görünmesi gereken lakrimal bezi ortaya çıkarmak için cildi forseps ile dikkatlice çekin. Lakrimal bezi ve ilişkili mezenşimi, lakrimal bezi veya ilişkili kanalını tutmamaya dikkat ederek çevredeki dokudan dikkatlice inceleyin.Daha sonra lakrimal bez çevreleyen dokudan serbest kaldığında, gözü çevreleyen epiteli lakrimal bez kanalının tabanında nazikçe kavrayın ve tüm bezi çıkarın. Epitelin içine girdiği yoğun bir doku olarak gözlenebilen epiteli çevreleyen Meen chi'yi korumaya özen gösterin. Daha sonra, doğum sonrası veya yetişkin bir fareden lakrimal bezi toplamak için 24 saat boyunca kültür ortamı ve küçük molekül inhibitörleri veya büyüme faktörleri içeren bir Petri kabında bir filtre başına dört ila beş lakrimal bezi kültürleyin, önce göz çevresine% 70 etanol püskürtün.Daha sonra hayvanın yan tarafını yukarıdan aydınlatmalı bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Daha sonra, lakrimal bezin yerleştirilmesi gereken yerden epidermiste lateral olarak bir kesi yapmak için küçük diseksiyon makası kullanın. Daha sonra, doğum sonrası ve yetişkin farede karotis arter, topuzlu kas ve dermis ile sınırlanan lakrimal bezi ortaya çıkarmak için epidermisi kulağa doğru çekin Lakrimal bezi forseps ile çevreleyen dokudan nazikçe gevşetin ve ardından lakrimal bez çevreleyen doku tutuşundan serbest bırakıldıktan sonra, kanal ve gözü çevreleyen epitelin birleştiği ve bezi dikkatlice çıkardığı yer.Son olarak, immünoboyamadan önce lakrimal bezleri 20 dakika boyunca% 4 para formaldehit ile sabitleyin. İlgilenilen gelişimsel proteinler için, lakrimal bez epitelyal dallanma morfogenezi süreci boyunca gelişir. Embriyonik lakrimal bezlerin embriyonik 14, 15, 16, 17. günlerde ve doğum sonrası ikinci günde diseke edilen bu parlak alan görüntüleri bu süreci göstermektedir.Epitelin boyutu arttıkça, bu görüntülerde gösterildiği gibi mezenşim miktarının azaldığına dikkat edin. Lakrimal bezler, in vivo kültür koşulları altında, in vivo bez kültürlerindekine benzer şekilde gelişir ve yeni diseke edilmiş lakrimal bezler, immünofloresan analizi için sabitlenebilir. Örneğin, bu görüntüde, epitel sinirlerinin ve kan damarlarının lekelenmesi.Bir embriyonikte, vahşi tip bir CD'den 16 lakrimal bez bir embriyo, doğum sonrası veya yetişkin PAC altı CRE faresi tarafından lakrimal bezde GFP ekspresyonu gözlenebilir, bu transgenik hayvanlardan lakrimal bezin hızlı bir şekilde tanımlanmasını ve diseksiyonunu kolaylaştırır. Bu yöntem gözyaşı bezi gelişimi hakkında fikir verebilse de, otoimmün hastalık veya ışınlama tedavisine bağlı gözyaşı bezi disfonksiyonu gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, ex vivo kültür analizi için murin lakrimal bezinin nasıl bulunacağını ve izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, kuru göz hastalığı modeli oluşturmak için bir tavşandan superior lakrimal bezin palpebral ve orbital olmak üzere iki parçanın çıkarılması için cerrahi prosedür açıklanmaktadır. Bu tavşan modeli, oküler yüzey homeostazı, patofizyoloji ve oküler terapötik çalışmalar için uygundur.

Superior Lakrimal Bezin Çıkarılması: Superior Lakrimal Bezin Palpebral ve Orbital Kısımlarının Tavşan Modelinden Çıkarılması İçin Cerrahi Bir Teknik

Bu videoda, hayvanda gözyaşı üretimi üzerindeki etkiyi incelemek için bir tavşan modelinden büyük inferior lakrimal bezi çıkarmak için cerrahi bir prosedürü açıklıyoruz.

Tavşan Modelinden İnferior Lakrimal Bezin Çıkarılması: Daha Büyük İnferior Gözyaşı Bezini Tavşan Gözü Yörüngesinden Çıkarmak İçin Cerrahi Bir Prosedür

Bu videoda, üst lakrimal bezin orbital lobuna Concanavalin A enjeksiyonu yoluyla bir tavşan modelinde kuru göz hastalığını indükleme prosedürü açıklanmaktadır. Geliştirilen model, kuru göz hastalığını tedavi etmek için çeşitli ilaçların etkinliğini incelemek için yararlıdır.

Superior Lakrimal Bezin Orbital Lobuna Enjeksiyon Yapılması: Tavşan Modelinde Kuru Göz Hastalığını İndüklemek İçin Bir Teknik

Lakrimal bezi (LG), α-pürüzsüz Kas aksini (αSMA) ifade eden iki hücre türüne sahiptir: miyoepitelyal hücreler (MECs) ve perikayt. MECS ektodermal orijinli, birçok glandüler dokularda bulunan, perikayt endodermal kökeni vasküler pürüzsüz Kas hücreleri iken. Bu protokol, murine LGs 'den MECs ve perikaytları yalıtır.

Yetişkin Murine lacrimal ve submandibular bezlerden Myoepitelyal hücrelerin izolasyonu

Bu makalede, orbital gözyaşı bezi sisteminin tüm bölümlerine konkain A enjekte ederek tavşanakut veya kronik kuru göz hastalığı neden bir yöntemin geliştirilmesi açıklanmaktadır. Bu yöntem, daha önce bildirilenlerden daha üstün, farmakolojik ajanların çalışması için uygun kuru göz tekrarlanabilir, istikrarlı bir model oluşturur.

Kıprimal Bezlere Concanavalin A Enjeksiyonu ile Indüklenen Sulu-Eksik Kuru Göz Hastalığının Tavşan Modeli: İlaç Etkinliği Çalışmalarına Uygulama

Yeni bir yaklaşım cerrahi tüm orbital gözyaşı bezleri kaldırarak tavşan kronik kuru göz hastalığı neden sunulmuştur. Bu yöntem, daha önce bildirilenfarklı, iyi gözyaşı fizyolojisi ve patofizyolojisi ve oküler terapötik çalışma için uygun sulu eksik kuru göz istikrarlı, tekrarlanabilir bir model üretir.

Tavşanlarda Komple Dakriyoadenektomi Kullanarak Şiddetli Kuru Göz Modelinin Oluşturulması

Yetişkin lakrimal bez (LG) kök hücreleri için üç boyutlu, serumsuz kültür yöntemi, LG organoid oluşumunun indüksiyonu ve asinar veya duktal benzeri hücrelere farklılaşması için iyi bir şekilde kurulmuştur.

Lakrimal Bez Kök Hücreleri için Üç Boyutlu, Serumsuz Kültür Sistemi

Bu protokol, birincil fare ve insan dokusundan türetilen lakrimal bez organoidlerinin nasıl kurulacağını, sürdürüleceğini, genetik olarak değiştirileceğini, farklılaştırılacağını, fonksiyonel olarak karakterize edileceğini ve nakledileceğini açıklar.

Fare ve İnsan Lakrimal Bezi Organoidlerinin Kurulması, Bakımı, Farklılaşması, Genetik Manipülasyonu ve Transplantasyonu

Burada, sulu eksikliği olan kuru göz çalışmasına bir temel sağlamak için bir sıçan lakrimal bez disfonksiyonu modeli oluşturuyoruz.

Skopolamin Kaynaklı Gözyaşı Bezi Disfonksiyonu Olan Bir Sıçan Kuru Göz Modeli

Burada, ekstraorbital ve infraorbital lakrimal bezleri eksize ederek su eksikliği olan kuru gözün fare modelini oluşturmak ve su eksikliği olan kuru gözde oküler yüzeydeki değişiklikleri değerlendirmek için bir yöntem sunuyoruz.

Sulu Eksiklik Kuru Gözünün Bir Fare Modelinin Kurulması

Keşfedin kemirgen gözyaşı bezi gelişimini ex vivo kültür ve immünofloresan mikroskopi kullanarak. Bu yöntem sinyal yolaklarını analiz ederek göz sağlığı araştırmalarına katkı sağlar.

Kemirgen Gözyaşı bezi kurgulama

Daha fazla video keşfet