Name: Hızlı Bakteriyel Teşhis ve Antibiyotik Duyarlılık Testi için bir Kan Kültürü Peleti hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Keşfedin pozitif kan kültüründen bakteri peleti hazırlama yöntemini; santrifügasyon ve amonyum klorür lizi ile hızlı tanı ve antibiyotik duyarlılık testi için numune elde edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz laboratuvarda tekniklerini uygulamak için onların yardım için Lozan Üniversitesi Hastanesi Merkezi bakteriyoloji laboratuarının teknisyenleri teşekkür ederim.

Bu protokol geliştirilmiş ve rutin bir aracı olarak uygulamaya geçirilmeden önce kurumun araştırma ve geliştirme süreçleri ve etik kurallarını takip valide edilmiştir. Amonyum Klorür Eritrosit parçalayan Usulü ile bir Kan Kültürü Bakteriyel Pelet 1. Hazırlık <ol><li> Daha sonra santrifüjleme için pozitif kan kültürünün hazırlanması. <ol><li> Kan kültürü kapağını sterilize edin. Şişenin kapağı üzerinde% 70 etanol ekleyin ve yakmak. NOT: Bir laminer akış kaputun altında bu adımı yapmayın. </li><li> Laminar akış için şişe taşıyın. 20 G şırınga ile kan kültürü 5 ml toplayın. </li><li> Steril su (H2O) 45 ml içeren 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne kan kültür 5 ml ilave edilir ve örnek karıştırın. </li></ol></li><li> Liziz santrifüjleme ile kan kültürü bakteryel tanelerin hazırlanması. <ol><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Remolaboratuar vakum pompası ile (özellikle H2O ve kan hücreleri içeren) süpernatant ettik. </li><li> Solüsyonu (0.15 M NH4CI, 1 mM KHCO 3) yokedici ev yapımı amonyum klorür 1 ml pelletini. Kazıyarak ve tüp vorteks pelet bölmek ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 140 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Ağırlıklı olarak kırmızı kan hücreleri enkaz içeren süpernatant atın. <ol><li> Topak hemorajik gerçekleşmemesi durumunda, başka bir artık kırmızı kan hücreleri lize etmek için ve pelet yıkamak için steril damıtık H 2 0 2 ml pelletini. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 140 x g&#39;de santrifüjleyin ve süpernatant atılır. </li></ol></li><li> H2O 200 ul pelletini </li></ol></li><li> Çeşitli seçici ve seçici olmayan agar ortamında kan kültürünün alt kültür. <ol><li> 20 G şırınga ile kan kültürü 1 ml toplayın. </li><li> Kan kültürü int 1 damla aşılamakkan agar, çikolata agar, McConkey agar ve Schaedler agar dört kadran o. </li><li> % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de kan agarı ve çikolata agar plakaları inkübe, normal bir atmosferde Mc Conkey agar ve anaerobik koşullarda Schaedler agar. </li><li> Farklı medya üzerinde bakteri büyümesini izleyin. </li><li> Bakteriyel saflık için kontrol edin. </li></ol></li></ol> MALDI-TOF MS ile 2. Tanımlama <ol><li> Kan pelet doğrudan tanımlama. <ol><li> Transferi 1 MALDI hedef plaka üzerinde kan pelet ul ve 42 ° C ısıtma platformu üzerinde kurumaya bırakın. </li><li> 1 ul% 70 formik asit ile örnek Yerleşimi ve 42 ° C ısıtma platformu üzerinde kurumaya bırakın. </li><li> MALDI matris 1 ul numuneyi, kaplama ve bir 42 ° C ısıtma platform üzerinde kurumasına izin (α-siyano-4-hidroksisinamik asetonitril-% 2.5 trifloroasetik asit,% 50 asit çözeltisi, doymuş). </li><li> MAL geçinÜretici tarafından tarif edildiği gibi, bir MALDI-TOF MS sistemi DI-TOF MS analizi. </li><li> Kimlik puanı (puan &lt;2 ile örneğin) tür düzeyinde geçersiz ise, kan numunesinin pelet bir protein çıkarımı gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Kan kültürü topağından proteini ekstraksiyon işleminden sonra tanımlanması. <ol><li> Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 13000 x g&#39;de 70% etanol ve 1 ml santrifüj ile pelet 20 ul karıştırın. </li><li> Süpernatant atılır ve% 70 formik asit ve 25 ul pelet% 100 asetonitril 25 ul ekle. Vortex şiddetle pelet tekrar süspansiyon. Vorteks önce pipet uçları ile onları parçalayarak sert pelet süspanse. </li><li> Oda sıcaklığında 2 dakika için 13,000 x g&#39;de santrifüjleyin. Aktarım 1, bir MALDI hedef plaka üzerinde yüzer ul (ekstre proteinleri ihtiva etmektedir) ve 42 ° C&#39;de ısıtma platformunda kurumaya bırakın. 2.1.2 anlatıldığı gibi devam edin. </li></ol></li></ol> 3. Bakteriyel IDENTIFBir Otomatik Mikrobiyal Sistemi ile ication ve Antibiyotik Duyarlılık Testleri <ol><li> Otomatik bir sistem ile bakteriyel mikrobiyal kimlik ve AST için bakteriyel süspansiyonun hazırlanması. <ol><li> Mikrobiyal otomatik sistem ile uyumlu steril% 0.45 NaCI çözeltisi 3 ml içeren plastik bir tüp hazırlanır. </li><li> 0,6-0,8 bir McFarland bulanıklığa tekabül eden bir bakteri süspansiyonu elde etmek için% 0,45 NaCl çözeltisi içinde kan kültürü pelet yeterli hacim. Bir densitometer makine kullanarak bulanıklığı ölçün. Not: Kan kültürü bakteri topağın hacminin 0,6-0,8 bir McFarland bulanıklık elde etmek için 50 ila 200 ul arasında değişir. </li></ol></li><li> Üretici tarafından tarif edildiği şekilde tanımlanması için otomatik Gram-pozitif (GP) veya Gram-negatif (GN) kartları ve Gram pozitif koklar ve Gram-negatif bakterilerin antibiyotik duyarlılık testi için otomatik AST kartları inoküle. NOT: identificatioMALDI-TOF MS kimlik skor değeri&gt; 2 ise n GP veya GN kartlarla uygulanmaz. Kan agar (GP ve GN) ve MacConkey agarı (GN) plakaları üzerinde bakteri süspansiyonu alt-kültürleme ile bakteri süspansiyonu saflığını kontrol edin. </li></ol> Disk Difüzyon Testi ile 4. Antibiyotik Duyarlılık Testleri Disk difüzyon deneyi antimikrobiyal duyarlılık testi (EUCAST, Sürüm 3.0 Nisan 2013 www.eucast.org) Avrupa komitesi tarafından açıklanmıştır. <ol><li> Bakteriyel süspansiyonun hazırlanması disk difüzyon deneyi ile antimikrobiyal duyarlılık testleri. <ol><li> Steril% 0.9 NaCl çözeltisi, 3 ml ihtiva eden bir cam tüp hazırlanır. </li><li> 0.5 McFarland bulanıklığa tekabül eden bir bakteri süspansiyonu elde etmek için% 0.9 NaCI çözeltisi içinde kan kültürü pelet yeterli hacim. Bir densitometer makine kullanarak bulanıklığı ölçün. NOT: Kan kültürü hacmiBakteriyel küçük topak, 0,6-0,8 arasında bir McFarland bulanıklık elde etmek için 50 ila 200 ul arasında değişir. </li><li> Bakteriyel süspansiyonun vorteksleyin. </li></ol></li><li> Mueller-Hinton agar (MH) veya Mueller-Hinton agar-agar titiz organizmalar (TKF) üzerine bakteri süspansiyonu aşılanması (MH,% 5 at kanı defibrine ve 20 mg / β-nikotinamid adenin dinükleotid L ile takviye edilmiştir). <ol><li> Bakteriyel süspansiyon içinde bir steril pamuklu çubuk daldırma ve hafifçe cam tüpün iç duvarında çubukla çevirerek fazla sıvıyı çıkarın. </li><li> Üç yönde silmeli veya otomatik bir plaka rotator ile MH / TKF agar levhasının tüm yüzeyi üzerine eşit şekilde yayılır bakteri süspansiyonu. </li></ol></li><li> Aşılanmış agar plakaları üzerinde antimikrobiyal disklerin uygulanması. <ol><li> El ile kurutuldu, aşılanmış agar plakalarının yüzeyi üzerine veya bir duyarlılık bir disk dağıtıcısı kullanılarak yakından diskleri uygulanır. </li><li> Uygun tempe inkübe plakasıdüşene ve antimikrobiyal duyarlılık testi EUCAST disk difüzyon yöntemi tarif edildiği gibi atmosfer (Sürüm 3.0 Nisan 2013 www.eucast.org). </li></ol></li></ol> 5. Otomatik MRSA Belirlenmesi için Tanı Testi PCR tabanlı <ol><li> Bir mikropipet kullanarak, 20 sn boyunca PCR tabanlı tanı test kiti ve vorteks otomatik MRSA ile sağlanan örnek reaktif şişenin içine kan kültürü pelet 50 ul aktarın. </li><li> 1 ml&#39;lik bir mikropipet kullanılarak kartuşun örnek portuna numuneyi dağıtmak. PCR sisteminin otomatik olarak kartuşunun takılması ve üretici tarafından tarif edildiği gibi tahlil başlar. </li></ol>

<ol><li>Alberti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+sepsis+and+infection+in+ICU+patients+from+an+international+multicentre+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentre cohort study.</a> Intensive care medicine. 28, 108-121 (2002).</li>
<li>Angus, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+severe+sepsis+in+the+United+States%3A+analysis+of+incidence%2C+outcome%2C+and+associated+costs+of+care%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care.</a> Critical care medicine. 29, 1303-1310 (2001).</li>
<li>Vincent, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis+in+European+intensive+care+units+results+of+the+SOAP+study%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Sepsis in European intensive care units results of the SOAP study.</a> Critical care medicine. 34, 344-353 (2006).</li>
<li>Micek, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Empiric+combination+antibiotic+therapy+is+associated+with+improved+outcome+against+sepsis+due+to+Gram-negative+bacteria+a+retrospective+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Empiric combination antibiotic therapy is associated with improved outcome against sepsis due to Gram-negative bacteria a retrospective analysis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54, 1742-1748 (2010).</li>
<li>Seifert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+importance+of+microbiological+findings+in+the+diagnosis+and+management+of+bloodstream+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The clinical importance of microbiological findings in the diagnosis and management of bloodstream infections.</a> Clin Infect Dis. 48, S238-S245 (2009).</li>
<li>Barenfanger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+mortality+associated+with+prompt+Gram+staining+of+blood+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+clinical+pathology%22%5BJournal%5D)">Decreased mortality associated with prompt Gram staining of blood cultures.</a> American journal of clinical pathology. 130, 870-876 (2008).</li>
<li>Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+treatment+of+bloodstream+infection%3A+laboratory+reporting+and+antimicrobial+management%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management.</a> J Clin Microbiol. 41, 495-497 (2003).</li>
<li>Clerc, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+on+the+clinical+management+of+patients+with+Gram-negative+bacteremia+a+prospective+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Impact of matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry on the clinical management of patients with Gram-negative bacteremia a prospective observational study.</a> Clin Infect Dis. 56, 1101-1107 (2013).</li>
<li>Meex, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+identification+of+bacteria+from+BacT%2FALERT+anaerobic+positive+blood+cultures+by+MALDI-TOF+MS+MALDI+Sepsityper+kit+versus+an+in-house+saponin+method+for+bacterial+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+medical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Direct identification of bacteria from BacT/ALERT anaerobic positive blood cultures by MALDI-TOF MS MALDI Sepsityper kit versus an in-house saponin method for bacterial extraction.</a> Journal of medical microbiology. 61, 1511-1516 (2012).</li>
<li>Moussaoui, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+identifies+90%25+of+bacteria+directly+from+blood+culture+vials%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials.</a> Clin Microbiol Infect. 16, 1631-1638 (2010).</li>
<li>Seng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ongoing+revolution+in+bacteriology+routine+identification+of+bacteria+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Ongoing revolution in bacteriology routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Clin Infect Dis. 49, 543-551 (2009).</li>
<li>Stevenson, L. G., Drake, S. K., Murray, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+bacteria+in+positive+blood+culture+broths+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of bacteria in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry.</a> J Clin Microbiol. 48, 444-447 (2010).</li>
<li>Croxatto, A., Prod&34hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+clinical+diagnostic+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology.</a> FEMS Microbiol Rev. 36, 380-407 (2012).</li>
<li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+bacterial+identification+in+positive+blood+cultures+by+use+of+two+commercial+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct bacterial identification in positive blood cultures by use of two commercial matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry systems.</a> J Clin Microbiol. 51, 1733-1739 (2013).</li>
<li>Prod&34hom, G., Bizzini, A., Durussel, C., Bille, J., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry+for+direct+bacterial+identification+from+positive+blood+culture+pellets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for direct bacterial identification from positive blood culture pellets.</a> J Clin Microbiol. 48, 1481-1483 (2010).</li>
<li>Prod&34hom, G., Durussel, C., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+blood-culture+bacterial+pellet+preparation+for+faster+accurate+direct+bacterial+identification+and+antibiotic+susceptibility+testing+with+the+VITEK+2+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+medical+microbiology%22%5BJournal%5D)">A simple blood-culture bacterial pellet preparation for faster accurate direct bacterial identification and antibiotic susceptibility testing with the VITEK 2 system.</a> Journal of medical microbiology. 62, 773-777 (2013).</li>
<li>Clerc, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+and+PCR-based+rapid+diagnosis+of+Staphylococcus+aureus+bacteraemia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry and PCR-based rapid diagnosis of Staphylococcus aureus bacteraemia.</a> Clin Microbiol Infect. , (2013).</li>
<li>Martiny, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+rapid+microbial+identification+directly+from+positive+blood+cultures+using+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry+on+patient+management%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Impact of rapid microbial identification directly from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry on patient management.</a> Clin Microbiol Infect. 19, E568-E581 (2013).</li>
<li>Stoneking, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Would+earlier+microbe+identification+alter+antibiotic+therapy+in+bacteremic+emergency+department+patients%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+emergency+medicine%22%5BJournal%5D)">Would earlier microbe identification alter antibiotic therapy in bacteremic emergency department patients.</a> The Journal of emergency medicine. 44, 1-8 (2013).</li>
<li>Nordmann, P., Dortet, L., Poirel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+extended-spectrum-beta-lactamase-producing+Enterobacteriaceae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae.</a> J Clin Microbiol. 50, 3016-3022 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Geleneksel pozitif kan kültürü tanı yaklaşımları ile karşılaştırıldığında, amonyum klorür parçalama santrifüj yaklaşımı kullanarak bakteriyel pelet hızlı edinimi 24 saat ve 48 saat 24 ile AST rapor süresi (Şekil 1 ve 16&#39;dan kimlik rapor süresini azaltmak 3). Uygun antibiyotik tedavisi hızlı bir giriş kan dolaşımı enfeksiyonları muzdarip hastaların sonuçlarını iyileştirmek esastır. Böylece, yaklaşık 8 ila 16 saat içinde elde edilen hızlı bir AST ardından ...

Hastanede yatan hastalarda kan dolaşımı enfeksiyonları ve sepsis morbidite ve mortalitenin önemli bir nedenidir. Böylece, enfeksiyonlar kan dolaşımına bağlı mortalite hastanede yatan hasta% 37 ila% 14 gözlenir ve yoğun bakım ünitelerinde hasta 1-3% 35 artabilir. Enfeksiyöz ajan hızlı kimlik optimum antimikrobiyal tedaviyi yönlendirmek ve antimikrobiyal tedavi 4,5&#39;den başarılı sonucunu artırmak için çok önemlidir. Pozitif kan kültürü Gram lekelerin hızlı analiz zaten antimikrobiyal tedavinin 6,7 ama enfeksiyöz ajan doğru kimlik uyarlaması üzerinde önemli bir etkiye sahiptir hastalara iyi adapte antibiyotik tedavi sağlamak için gereklidir. Örneğin, farklı antibiyotik tedavi rejimleri enterokok ve Gram boyama ile ayırt etmek zordur streptokoklar ile bakteriyemi takip uygulanması gerekir. Benzer şekilde, türlere tanımlama levEl 8-laktamlara β karşı arttırılmış bir direnç kazandıran bir kromozom AMPc geni kodlayan, Gram negatif enterobakteriler tespit etmek için gereklidir. Pozitif kan kültürü ile, geleneksel tanısal yaklaşım biyokimyasal testler, farklı seçici medya büyüme ve otomatik mikrobik tanımlama sistemleri dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımlar ile ilave inkübasyon öncesinde kimlik birkaç saat gerektirir farklı agar plakaları üzerinde bulaşıcı ajan, altkültürü etmektir. Geleneksel bir yaklaşım teşhis sonuçlarına süresi yaklaşık 1-3 gün taşımaktadır. Mikroorganizmaların hızlı tespit edilmesi için matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon time-of-flight kütle spektrometresi (MALDI-TOF) teknolojisinin ortaya hızlı bir şekilde pozitif kan şirketinden de agar plakaları üzerinde büyüyen kolonilerin mikroorganizmaların değil tanımlamak için yeni bir aleti kültürler (Şekil 1) 9-12. ThKan kültürlerinden bir enfeksiyon ajanı tanımlamak için MALDI-TOF E kullanımı önemli bir kaç dakika yerine geleneksel yöntemlerle gerekli saat ve gün sonuçlarına süresini azalttı. Croxatto ve ark. 13 tarafından ele alındığı şekilde, MALDI-TOF tanımlama etkinliği mikroorganizmaların saflık ve miktarı da dahil olmak üzere farklı parametrelere dayanır. Bu iki kriter kolaylıkla agar plakaları üzerinde büyüyen koloniler elde edilen ayrı fakat MALDI-TOF kimlik müdahale edebilir bir çok selüler ve protein bileşenlerini içeren kan kültürü gibi kompleks örnekleri, bakteriyel zenginleştirme ve arıtması için bir ön tedavi analitik gerekmektedir. Kan kültüründen çeşitli mikroorganizmaların izolasyon yöntemleri bakteriyel çıkarma 9,14, serum ayırıcı yöntemi 10 saponin ya da diğer hafif deterjanlar yöntemi dahil, bir çok çalışma kullanılmıştır, lizis santrifüj yöntemleri 12 </skadar&gt; ve bu sepsityper kiti gibi ticari çözümleri. Bizim bakteriyoloji tanısal laboratuvar MALDI-TOF ile bakteri ve maya hızlı tanımlama ve otomatik tanımlama sistemleri (Şekil 2) 15 izin amonyum klorür eritrosit-lizis dayalı basit bir kan kültürü, bakteriyel pelet hazırlık geliştirmiştir. Bu kan kültürü pelet hazırlık aynı zamanda Gram boyama gibi diğer doğrudan aşağı uygulamalar için bir örnek sunmak, metisilin dirençli Staphylococcus aureus hızlı tespiti (MRSA) için POCT-PCR&#39;lerine ve antibiyotik duyarlılık testi gibi otomatik PCR tabanlı tanı testleri AST otomatik sistemleri ve / veya agar plakaları üzerinde disk difüzyon deneyleri (Şekil 3) ile incelenmiştir. Prod&#39;hom ve arkadaşları tarafından açıklandığı gibi, bu çalışmada, kan kültürü bakteryel tanelerin hazırlanması için farklı adımları açıklar. 15 (Şekil 4). Biz de de olacakkâtip kan kültürü pelet yapılabilir ana üç uygulama için protokoller: otomatik Enterobacteriaceae için sistemleri 16 ve stafilokok ve otomatik PCR-ile MALDI-TOF 15, kimlik (ID) ve antibiyotik duyarlılık testi (AST) tarafından Identification MRSA 17&#39;nin saptanması için tanısal test göre.

<table><tbody><tr><td>20 G iğne</td><td>Terumo, Leuven, Belçika</td><td>NN-2038R</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon tube</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, ABD</td><td>352070</td><td>50 ml santrifüj tüpleri</td></tr><tr><td>Amonyum klorür</td><td>Merck, Darmstadt, Almanya</td><td>101145</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum hidrojen karbonat</td><td>Fluka, St. Louis, MO, ABD&nbsp;</td><td>60340</td><td></td></tr><tr><td>Formik asit</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD&nbsp;</td><td>F0507</td><td>Yanıcı, aşındırıcı</td></tr><tr><td>&#945;-Siyano-4-hidroksisinnamik asit</td><td>Fluka, St. Louis, MO, ABD&nbsp;</td><td>70990</td><td>Akut toksisite</td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD&nbsp;</td><td>271004</td><td>Yanıcı, akut toksisite</td></tr><tr><td>Trifloroasetik asit</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD&nbsp;</td><td>T6508</td><td>Aşındırıcı, akut toksisite</td></tr><tr><td>Vitek 2 60 cihazı</td><td>Biom & eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Fransa</td><td>27202</td><td>otomatik mikrobiyal sistem cihazı</td></tr><tr><td>Vitek 2 Gram-pozitif (GP) kart</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Fransa</td><td>21342</td><td>otomatik GP&nbsp; kimlik kartı</td></tr><tr><td>Vitek 2 AST-P580 kartı</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Fransa</td><td>22233</td><td>otomatik mikrobiyal AST sistemi</td></tr><tr><td>Vitek 2 Gram negatif (GN) kart</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Fransa</td><td>21341</td><td>otomatik GN&nbsp; kimlik kartı</td></tr><tr><td>Vitek 2 AST-N242 kartı</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Fransa</td><td>413391</td><td>otomatik mikrobiyal AST sistemi</td></tr><tr><td>Xpert MRSA</td><td>Cepheid, Sunnyvale, Ca, ABD&</td><td>nbsp; GXMRSA-100N-10</td><td>nükleik asit amplifikasyon teknolojisi MRSA</td></tr><tr><td>GeneXpert IV cihazı</td><td>Cepheid, Sunnyvale, Ca, ABD</td><td>GXIV-4-D</td><td>nükleik asit amplifikasyon teknolojisi cihazı</td></tr><tr><td>Microflex LT MALDI-TOF MS cihazı</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Almanya</td><td>BDAL microflex LT/SH</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96 hedef çeliği BC</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Almanya</td><td>280799</td><td>MALDI hedef plakası</td></tr><tr><td>Densitometre Densicheck cihazı</td><td>Biom & eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Fransa</td><td>27208</td><td></td></tr><tr><td>MALDI Sepsityper kit 50</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Almanya</td><td>8270170</td><td></td></tr><tr><td>Mac Conkey agar</td><td>Biolife, Milano, İtalya</td><td>4016702</td><td></td></tr><tr><td>Mueller-Hinton agar</td><td>Oxoid, Hampshire, İngiltere</td><td>CM0337</td><td>Mueller-Hinton agar (MH)&nbsp;</td></tr><tr><td>MHF agar</td><td>Biyom ve eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Fransa</td><td>43901</td><td>Mueller-Hinton agar-titiz organizmalar agar (MHF)</td></tr><tr><td>BD columbia III agar</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, ABD</td><td>254071</td><td>kan agar</td></tr><tr><td>BD çikolatalı agar</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, ABD</td><td>254089</td><td>çikolatalı agar</td></tr><tr><td>BD schaedler agar</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, ABD</td><td>254084</td><td>Schaedler agar</td></tr></tbody></table>

hızlı bakteriyel teşhis ve antibiyotik duyarlılık testi için bir kan kültürü peleti hazırlanması

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Kan dolaşımı enfeksiyonları ve sepsis morbidite ve mortalitenin önemli bir nedenidir. Bakteriyemi muzdarip hastaların başarılı bir sonuç optimum antibiyotik tedavisine rehberlik enfeksiyöz ajan hızlı bir tanımlanmasına bağlıdır. Pozitif kan kültürü Gram leke analizi hızla yapılmış ve zaten önemli ölçüde antibiyotik rejimi etkileyebilir edilebilir. Bununla birlikte, enfeksiyöz ajanın doğru tespit hala en iyi hedef tedaviyi saptamak için gereklidir. Burada, disk difüzyon testi ile, MALDI-TOF MS, antibiyotik duyarlılık testi (AST) tarafından tespit edilmesi veya otomatik AST sistemleri gibi çeşitli gerekli alt uygulama için bir numune olarak kullanılabilecek bir pozitif kan kültürü hızlı ve basit bir Bakteri taneleri bir preparasyonunu sunmak ve otomatik diagnostik testi PCR tabanlı. Kan kültürü, bakteriyel pelet üzerine doğrudan uygulanabilir bu farklı kimlik ve AST sistemlerinin performansı çok si olanperformansına Milar normal agar plakaları üzerinde büyüyen koloniler izole elde. Geleneksel yöntemlere göre, bir bakteri pelet hızlı edinimi önemli ölçüde belirlenmesini ve AST hem rapor süresini azaltır. Böylece, aşağıdaki kan kültürü pozitifliği, MALDI-TOF ile tanımlama 8 içinde sırasıyla 18 saat, otomatikleştirilmiş AST sistemleri veya disk difüzyon deneyleri ile AST sonuçları ise daha az 1 saat içinde rapor edilebilir. Benzer bir şekilde, hızlı, PCR bazlı tahlilin sonuçları klinisyene bakteremi raporu müteakiben en az 2 saat iletilebilir. Birlikte, bu sonuçlar, kan kültürü bakteri pelet hızlı hazırlanması kimlik ve AST geri dönüş süresi ve dolayısıyla kan dolaşımı enfeksiyonları olan hastaların başarılı sonuç üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir.

Prod'hom ve ark. 15 tarafından yapılan çalışmada, 78 hastadan 122 pozitif kan kültürü amonyum klorür liziz santrifüj ile elde edilen bakteriyel peletler MALDI-TOF MS ile analiz edilmiştir. 122 pozitif kan kültürü üzerinden, 95 (% 77.9) doğru cins düzeyinde tür düzeyinde ve bir (% 0.8) olarak tespit edilmiştir. Geri kalan 26 (% 21.3), kan kültürü topaklar, MALDI-TOF ile güvenilir bir kimlik verdi. Bunlar arasında, 21 13 streptokok ve 5 koagülaz-negatif stafilokok içeren gram pozitif bakteri. Önemli ol...

Pozitif kan kültürü hızlı bir Bakteri taneleri bir preparasyon, MALDI-TOF ile tanımlama, Gram boyama antibiyotik duyarlılık testi ve PCR-esaslı testi gibi uygulamalar için bir numune olarak kullanılabilir. Sonuçlar hızla kan dolaşımı enfeksiyonlarından muzdarip hastaların sonuçlarını iyileştirmek için klinisyenler için tebliğ edilebilir.

Hızlı Bakteriyel Teşhis ve Antibiyotik Duyarlılık Testi için bir Kan Kültürü Peleti hazırlanması

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Bu prosedürün genel amacı, çeşitli uygulamalar için numune olarak kullanılabilecek pozitif bir kan kültüründen bir bakteri peleti hazırlamaktır. Bu, santrifüjlemeyi takiben önce pozitif bir kan kültürünün steril su ile karıştırılmasıyla gerçekleştirilir. Pelet, ikinci bir santrifüjleme turundan sonra kırmızı kan hücrelerini bitlemek için amonyum klorür içinde yeniden süspanse edilir.Pelet suda yeniden süspanse edilir. Son adım, elde edilen peletin matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyonu, uçuş süresi, gram boyama, antibiyotik duyarlılık testi ve/veya PCR bazlı testler ile bakteri tanımlaması için kullanılmasıdır. Sonuç olarak, elde edilen sonuçlar, kan dolaşımı enfeksiyonlarından muzdarip hastaların sonuçlarını iyileştirmek için klinisyenlere hızlı bir şekilde iletilebilir.Bu tekniğin, pozitif kan kültürlerinin bakteri alt kültürü gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bakteri tanımlamasını yaklaşık altı ila 24 saat azaltmak ve antibiyotik direnci sonuçlarına kadar geçen süreyi yaklaşık 24 saat azaltmaktır. Bu yöntem, antibiyotik tedavisine hızlı bir şekilde adapte olmaya ve kan dolaşımı enfeksiyonlarından muzdarip hastaların sonuçlarını iyileştirmeye yardımcı olabilir.

preparation-blood-culture-pellet-for-rapid-bacterial-identification

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

In situ hibridizasyon tayininde floresan bir Peptid Nükleik Asit (PNA BALIK) kullanarak bir pozitif kan kültürü, Enterococcus faecalis ve diğer Enterococcus türleri doğrudan tanımlanması için hızlı bir protokoldür.

Belirlenmesi için 1.5 Saat Usulü Enterococcus</emDoğrudan Kan Kültürleri> Türler

Bakteriyel patojen teşhis için basit bir günlük akışı düzeninin tasarım enfeksiyonu kan hızlı tanıma sağlar. Sekiz klinik bakteriyel hedefleri ve antibiyotik direnç profilleri dahil olması daha uygun tedaviye yol açabilir aynı gün klinisyen bir ilk fikir sunuyor.

Kan örneklerinden Bakteriyel Patojen Algılama ve Antimikrobiyal Direnç Testi için bir günlük iş akışı şeması

Biz son zamanlarda basit bir bakteriyel tespiti için floresan assay "mix-ve-okuma" kurmak için uygulanabilir Flourogenik DNAzyme probları üretmek için yeni bir yaklaşım bildirdin. Bu özel DNA sondaları böylece floresans sinyali kuşağa bakteriyel algılama çevirme belirli bakteri tarafından üretilen ham hücre dışı karışımı (CEM) varlığında, bir kromofor-değiştirilmiş-DNA RNA kimerik substratın bölünme katalize. Bu yazıda, "RFD-EC1" ifade belirli bir DNAzyme prob modeli bakterinin tespiti için...

Flourogenik DNAzymes kullanarak Bakterilerin Tespiti

Kaynak: Feltwell, T., et.al. süreksiz bir yoğunluk gradyanı kullanarak bakterileri kapsül miktarına göre ayırmak. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, değişen kapsül üretimine sahip bakteri suşlarının hazırlanmasını ve karakterizasyonunu göstermektedir. Kapsülle ilişkili genlerde farklı mutasyonlar taşıyan patojenik suşlar kültürlenir, sıvı ortamda büyütülür ve kapsül fenotiplerini pelet yoğunluğuna göre ayırt etmek için santrifüjlemeye tabi tutulur. Tampon işlemi, kapsül yapılarını korurken hücreleri...

Kapsül Oluşturan Patojenik Bakteri Suşlarının Kültürlenmesi ve İzole Edilmesi

Kaynak: Koeth, LM, et. al., Aerobik Olarak Büyüyen Bakterilerin Dalbavancin İn Vitro Duyarlılık Testi için Bir Referans Et Suyu Mikroseyreltme Yöntemi. J. Vis. Uzm. (2015).Bu video, Gram pozitif bakterilere karşı bir lipoglikopeptid antibiyotiğin minimum inhibitör konsantrasyonunu (MIC) belirlemek için et suyu mikroseyreltme yöntemini göstermektedir. Bakteri kolonisi izolasyonu, seyreltme, değişen antibiyotik konsantrasyonları ile mikroplaka kuyularının aşılanması ve kültür saflığının ve hücre...

Gram Pozitif Bakterilerin Antibiyotik Duyarlılık Testi İçin Bir Et Suyu Mikrodilüsyon Yöntemi

Bu videoda, bir peg plakası kullanarak biyofilmleri etkili bir şekilde ortadan kaldıran antimikrobiyal bileşiklerin taranması için bir test gösterilmektedir. Metodoloji, antimikrobiyal bileşiklerle muamele edildikten sonra biyofilmin metabolik durumunu izleyerek minimum biyofilm eradikasyon konsantrasyonunun belirlenmesini kolaylaştırır.

Antibakteriyel Ajanların Talınması için Bir Peg Plaka Biyofilm Testi

Uçuşu (MALDI-TOF) kütle spektrometresi (MS), doğrudan kan kültür çorbasına matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon zaman uygulanması bakteri tanımlanmasını hızlandırır. Sunulan yöntemi doğrudan kan kültür besi yerinden, Gram negatif bakterilerin tanımlanması için hızlı ve güvenilir bir yöntemdir.

MALDI-TOF kütle spektrometrisi kullanılarak kan kültür besi yerinden, Gram negatif bakterilerin hızlı belirlenmesi

Antimikrobiyal sinerji test birlikte kullanılan iki veya daha fazla antibiyotik etkisini değerlendirmek için kullanılır ve genellikle iki yöntemden birini kullanarak gerçekleştirilir: Dama Tahtası dizi ya da zaman-kill tahlil. Burada, otomatik bir, mürekkep püskürtmeli yazıcı destekli Dama Tahtası dizi sinerji teknik ve bir klasik saat-kill sinerji çalışma mevcut.

Antimikrobiyal sinerji mürekkep püskürtmeli yazıcı yoluyla tarafından test otomatik Dama Tahtası dizi ve el ile zaman-kill yöntem

Bu protokol, D 2O metabolizmasının tek hücreli uyarılmış Raman saçılma görüntülemesi ile 2.5 saat içinde hızlı antimikrobiyal duyarlılık testi (AST) testi sunar. Bu yöntem, klinikte hızlı tek hücreli fenotipik AST için dönüştürücü olan idrar veya tam kan ortamındaki bakteriler için geçerlidir.

Tek Bir Bakteride Döteryum Birleşmesinin Uyarılmış Raman Saçılma Görüntülemesi ile Hızlı Antimikrobiyal Duyarlılık Testi

EUCAST, otomatik kan kültürleri için doğrudan bir antimikrobiyal duyarlılık testi (AST) protokolü geliştirmiştir. Bununla birlikte, kütle spektrometresi tabanlı mikrobiyal tanımlamaya bağımlılığı, otomatik bir mikrobiyal tanımlama sisteminde doğrudan bir aşı hazırlama protokolü kullanılarak ortadan kaldırılabilir. Bu yaklaşım, numune alındıktan sonraki 24 saat içinde AST raporları sağlayabilir.

Kütle Spektrometresi Olmadan EUCAST RAST Yöntemini Kolaylaştırmak için Otomatik Bir Mikrobiyal Tanımlama Sistemi Kullanarak Doğrudan Mikrobiyal Tanımlama

Keşfedin pozitif kan kültüründen bakteri peleti hazırlama yöntemini; santrifügasyon ve amonyum klorür lizi ile hızlı tanı ve antibiyotik duyarlılık testi için numune elde edin.

Hızlı Bakteriyel Teşhis ve Antibiyotik Duyarlılık Testi için bir Kan Kültürü Peleti hazırlanması

Daha fazla video keşfet