Tek Düzlem Aydınlatma Modülü ve geniş alan Mikroskop Mikro-kılcal Yaklaşım

Bu prosedürün genel amacı, ters mikroskoplar için bir ışık tabakası uyarma modülü kullanarak tek düzlemli aydınlatma mikroskobu gerçekleştirmek ve bunu üç boyutlu hücre sferoidlerine uygulamaktır. Bu, ilk olarak, bir hücre sferoidini bir mikrotitre plakasının kuyusundan yıkamayı takiben inkübe etmek üzere ikinci bir oyuğa aktarmak için bir pipet kullanılarak gerçekleştirilir. S sferoidi daha sonra dikdörtgen bir kılcal damara sokulur.

İkinci adım, ışık levhası aydınlatma modülünü ters çevrilmiş mikroskop konumlandırma tablasının taban plakasına monte etmektir. Daha sonra, steroid içeren kılcal damar, mikroskopi için özel bir numune tutucuya yerleştirilir. Son adım, algılama yolundaki ışık tabakası ile mikroskop objektif merceğinin odak düzlemi arasındaki eşleşmeyi ayarlamaktır.

Sonuç olarak, üç boyutlu floresan ölçümleri, ilaçların alımı veya S sferoidinin yapısı ile ilgili tek görüntüler veya Zacks hakkında bilgi elde etmek için hücre sferoidi içindeki odak düzleminin varyasyonu ile gerçekleştirilebilir. Bu tekniğin mevcut ışık tabakası mikroskoplarına göre en büyük avantajı, mevcut bir mikroskoba uyarlanabilen ve araştırma için büyük ölçüde özgürlük sağlayan bir modülden oluştuğu için uygun maliyetli ve çok yönlü olmasıdır. Bu tekniğin etkileri, özellikle mikroakışkan sistemin adaptasyonu, akış koşulları altında hızlı süreçlerin araştırılmasına izin verdiğinden, tedavi ve tanı için kullanılan ilaçların ve ajanların araştırılmasına kadar uzanır.

Şimdi bu uyarma yöntemi, herhangi bir tespit tekniği ile birlikte, düşük ışık dozlarında canlı hücre steroidleri hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca cipro balıkları, artila embriyoları gibi diğer canlı sistemlere ve ayrıca optik CLE doku örneklerine de uygulanabilir. Başlamak için, 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna kültür ortamında 50 mikrolitre ısıtılmış 1.5 aero ekleyin ve bir ila iki saat katılaşmasına izin verin.

Daha sonra, hazırlanan 96 kuyulu plaka brüt S'nin her bir oyuğunda yaklaşık 150 MCF yedi meme kanseri hücresini,% 5 karbondioksit ve 37 santigrat derecede bir inkübatörde yaklaşık 200 ila 300 mikrometre çapa kadar beş ila yedi gün boyunca tohumlayın. Daha sonra, hücre steroidlerini antrasiklin antibiyotik doksorubisin hidroklorür ile kültürde iki mikromolar ve sekiz mikromolar arasında değişen bir konsantrasyonda altı saat boyunca inkübe edin. Orta İnkübasyondan sonra, mikroskopiden önce hücreleri OID'yi kültür, besiyeri veya Earl'ün denge tuzu çözeltisi ile yıkayın.

Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın ve tek düzlemli aydınlatma mikroskobunu veya SPM uyarma modülünü konumlandırma tablasının taban plakasına monte edin. Mikroskobu, mikroskobun algılama yolunda 10 kez veya 20 kez büyütülen bir mikroskop objektif lensi ve uygun bir uzun geçiren filtre ile donatın. Ardından, mikroskobun algılama portuna entegre bir kamera monte edin.

Tercihen 470 nanometre uyarma dalga boyuna sahip bir lazerin paralel harmanlanmış bir ışını veya bir lazer diyotu kullanın ve bunu spin modülüne uygulayın. Ardından, silindirik merceği 90 derece döndürün, bu da ışık tabakasının ışın belinin eksenel olarak ayarlanması için ışık tabakasını dikey bir konuma aktarır. Numune tutucuya floresan boya içeren bir sıvı içeren bir kılcal damar yerleştirin.

Numune tutucuyu kılcal damarla birlikte mikroskobun konumlandırma tablosuna takın. Kılcal damarın konumunu, ortalanacak ve ışık tabakasının ışın beli odakta olacak şekilde hizalayın. Silindirik merceğin kendisinin eksenel konumunun değişmesiyle ışın belini ayarlayın.

Ayarlamadan sonra lensi geri çevirin. Hücre steroidini, iç kesiti 600 x 600 mikrometre ve duvar kalınlığı 120 mikrometre olan dikdörtgen bo silikat cam kılcal damarlar içinde ayrı ayrı veya gruplar halinde yerleştirin. Bunu başarmak için, boş kılcal damarı başparmak ve orta parmağınızla dik olarak alın ve üst açıklığı işaret parmağınızla kapatın.

Alt açıklığı, çevresindeki sıvıdaki hücre sferoidine yaklaştırın, steroid içerideyken üst açılış sıvısından işaret parmağını serbest bırakın. Kılcal kuvvetler tarafından hemen ıslanacaktır. S sferoidinin yerçekimi ile doldurulmuş kılcal damar içindeki konumunu ayarlayın.

Alternatif olarak, steroidi pipetleme yoluyla kılcal damara uygulayın. Pipetin ucunun açıklığının bir yandan S küresel boyutu için yeterince büyük, diğer yandan kılcal damarın iç çapına eşit veya daha küçük olmasına dikkat edin. Daha sonra S sferoidini içeren kılcal damarı mikroskopiden özel bir numune tutucuya yerleştirin.

Numune tutucuyu kılcal damar ile mikroskobun konumlandırma tablosuna takın ve hücre steroidinin konumunu ortalanacak ve odaklanacak şekilde hizalayın. Yansıma aynasının ve silindirik merceğin konumunu ayarlayarak algılama yolunda ışık tabakası ile mikroskop objektif merceğinin odak düzlemi arasındaki eşleşmeyi ayarlayın. Bir hücre steroidinin iç cam yüzeye daha sonra hücresel yapışmasını desteklemek için kılcal damarı 30 dakika boyunca fetal baldır serumu veya FCS ile doldurun.

Hücre steroidini FCS kaplı kılcal damara soktuktan sonra tükenmiş kılcal damarda kalan FCS kaplamasının en az 12 saat kurumasını bekleyin. Daha önce olduğu gibi, steroidin hücresel yapışmasına neden olmak için kılcal damarı inkübatörde iki ila dört saat daha bırakın. Ardından, bir kabarcık tuzağı içeren mikroakışkan sistemin flx kısmını kurun.

Borunun flx'ini floresan boya, ilaç veya ajan içeren kültür ortamıyla doldurmak için peristaltik bir pompa kullanın. Önce kabarcıksız kılcal damarı akış borusuna sıkıştırın ve ardından kılcalın diğer tarafını tahliye borusuna sıkıştırın. Su banyosunun sıvı sıcaklığını istenen değere ayarlayın.

Ardından peristaltik pompayı istenen pompa hızına ayarlayın. Pompalanan sıvıyı, veri toplama ve analizi için açık döngü kurulumuyla bir alıcıya toplayın. Görüntü alımı için lazer gücünü ve entegrasyon süresini ayarlayın.

ZS yığınının artışını, üç boyutlu veri analizi için tercih edilen beş ile 10 mikrometre arasında bir değere ayarlayın. Hafif tabaka kalınlığı yaklaşık 10 mikrometre olduğundan, hücre steroidi içindeki odak düzleminin değişmesiyle tek görüntülerin veya Zacks'in ölçümlerini gerçekleştirmeye devam edin. Daha önce altı saat boyunca sekiz mikromolar doksorubisin ile inkübe edilmiş bir mc yedi hücreli steroidin Zack taraması gösterilmiştir.

Görüntüler, doksorubisinin hücresel alımı ve dağılımı ve bozunması hakkında ayrıntılı bilgi verir. Steroid kırmızı floresan doksorubisin dış hücre tabakası içindeki ürün esas olarak çekirdekte lokalize olurken, iç küresel alanlarda, bir bozunma ürünü tarafından sunulan yeşil floresan hücresel zarda baskın hale gelir. Kemoterapötik ilaç doksorubisin'in doğal mc yedi insan meme kanseri hücresi S'de alımı, spm tarafından seçilen tek bir hücre tabakası için gösterilmiştir.

Akış sistemi içinde iki mikromolar ve kültür ortamının uygulanması üzerine, doksorubisin ve bozunma ürününün kırmızı ve yeşil floresansı, akış sistemi içindeki kültür ortamında iki mikromolar doksorubisin uygulanması üzerine sürekli olarak artmış, doksorubisin kırmızı ve yeşil floresansı ve bozunma ürünü sürekli olarak artmıştır. Mastering yapıldıktan sonra, ışık tabakası eleme modülünün montajından 3D numunelerin floresan görüntülerinin kaydedilmesine kadar sadece birkaç dakika sürer. Ölçüm ve akış durumu söz konusu olduğunda, numunenin kılcal damarın iç yüzeyine yapıştığından emin olmak ve numuneye ulaşarak kılcal damardan ayrılabilecek hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek çok önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, çeşitli mikroskoplara uyarlanabilen çok yönlü modül ile ışık tabakası aydınlatma mikroskobu hakkında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.