Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

Bu prosedürün genel amacı, bunu yapmak için canlı hücre zarlarındaki lipitlerin ve proteinlerin difüzyon yasasını ölçmektir. İlk olarak, mikroskobun nokta yayılma işlevi, nanoskopik floresan boncukların görüntülenmesiyle kalibre edilir. Daha sonra, floresan olarak etiketlenmiş bir ilgilenilen molekül de dahil olmak üzere lipozom bazlı vektörler hazırlanır ve transfeksiyon veya doğrudan dahil etme yoluyla canlı hücrelere verilir.

Canlı hücre plazma zarının hızlı görüntülenmesi, toplam iç yansıma floresan mikroskobu ile gerçekleştirilir. Son olarak, korelasyon fonksiyonu hesaplanır ve moleküler difüzyon yasası Gauss uydurma ile çıkarılır. Elde edilen veriler.

İncelenen lipid veya proteinin hareket modunu tanımlayın. Bu tekniğin, foto ağartma yaklaşımı sonrası konvansiyonel floresan geri kazanımı veya klasik tek nokta floresan korelasyon spektroskopisine göre en büyük avantajı, moleküler difüzyon yasasının ölçülmesine izin vermesidir. Sistemin öncelikli bir bilgisini biliyoruz.

Ayrıca klasik tek parçacık izleme metodolojilerinin aksine. Burada, mular yer değiştirme, parçacık yörüngelerini çıkarmaya gerek kalmadan ölçülür. Sonuç olarak, bu metal, örneğin genetik olarak kodlanmış floresan proteinler gibi nispeten kabul edilen ve yoğun molekül ile kombinasyon halinde kolayca kullanılabilir.

Genel olarak, bu yöntem, protein veya lipid hareketinin plazma zarı yapısını ve fonksiyonel organizasyonu nasıl düzenlediği gibi hücresel moleküler biyoloji alanındaki kilit soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve bunlara ve ilgili sorulara verilen yanıtlar herkese açık hale getirilecek ve sadece ticari bir mikroskop kullanılarak, genel prosedürün gösterilmesi zo tarafından gerçekleştirilecektir. laboratuvardan bir doktora öğrencisi. Bu protokole, görüntüleme sisteminin nokta yayılma işlevini kalibre ederek başlayın. Daha önce 500 mikrolitrelik bir santrifüj tüpüne eklenen 90 mikrolitre damıtılmış su içinde 10 mikrolitre floresan boncuk çözeltisini seyrelterek başlayın.

Bir neşter kullanarak bir sauna ikram banyosunda çözeltiyi 20 dakika boyunca sonikleştirin, bir santimetre karelik bir parça %3 AGA gül jeli kesin ve bir Petri kabına koyun. Jelinin üstüne 10 mikrolitre seyreltilmiş floresan boncuk çözeltisi koyun. Daha sonra forseps kullanarak, jel parçasını iki santimetrelik bir cam Petri kabında ters çevirin.

Yine forseps kullanarak. Damlayı dağıtmak için jel parçasını aşağı doğru bastırın. Bir sonraki adım, ticari bir toplam iç yansıma floresan mikroskobundan oluşan satın alma kurulumunu açın.

Bir uygulama paketi, gelişmiş floresan yazılımı ve/veya Solis görüntü elde etme yazılımı çalıştıran bir bilgisayara bağlı bir inkübatör ve hızlı bir EMCCD kamera ile donatılmıştır. Numuneyi, I parçasını ve iletilen ışığı kullanarak mikroskop tablasındaki tutucuya yerleştirin. Jelin sınırına odaklanın.

Ardından jeli objektifin üzerinde ortalayın ve Leica uygulama paketinde lazer hizalama prosedürünü başlatmak için odağı ayarlayın, gelişmiş floresan yazılımı otomatik hizalamayı seçin ve otomatik hizalama prosedürünü izleyin. Lazer, ve/veya Solis edinme yazılımında hizalandıktan sonra, ayarlar düğmesine tıklayın. Bir pencere açılacaktır.

Kamera pozlamasını 100 milisaniyeye, kazanılan EM'yi 1000'e, tekrarı 100'e ayarlayın ve kare aktarımı onay kutusunu işaretleyin. Ardından otomatik kaydetme penceresine tıklayın ve deneyin adını girin. İzole edilmiş tek noktalarla bir görüş alanı bulun.

Genellikle bir boncuk agregasını temsil eden parlak bir noktaya odaklanın. Ardından 100 kare elde edin. Birkaç tek noktanın görüntüsünü elde etmek için bu adımı beş ila altı kez tekrarlayın.

Elde edilen seriyi MATLAB gibi bir veri işleme programına aktarın ve yığının zaman içinde ortalamasını alın. Ardından ölçülen ortalama yoğunluk görüntüsünü görüntüleyin. Parlak, küçük bir floresan noktayı yakınlaştırın ve merkezi kabaca noktanın en parlak pikseli olarak tanımlayın.

Son olarak, parçacığın etrafına çizmek istediğiniz ilgilendiğiniz bölgenin boyutunu, bir Gauss fonksiyonu ile seçilen yoğunluk dağılımına uymak için tipik olarak bir mikron yanında seçin. gause fit komutunu seçin. Uyumun iyi olduğunu doğrulamak için elde edilen kalıntıları inceleyin.

Son olarak, kamerayı ekteki belgede açıklandığı gibi kalibre edin. Sistem kalibre edildikten sonra, görüntü elde etmek için hücreleri etiketlemenin zamanı gelmiştir. Lipid infüzyonu için gerekli lipozomları, her biri bir mililitre kloroform içeren ayrı bir mikro santrifüj tüpünde bir miligram DOPE, bir miligram D-O-T-A-P ve bir miligram PPE ADO 4 88'i çözerek hazırlamaya başlayın.

Daha sonra, DOPE ve D-O-T-A-P çözeltilerinin her birini 0,5 mililitre 25 mikrolitre PPE ATO 4 88 çözeltisi ile birleştirin. Tüpü santrifüjlü bir buharlaştırıcıya koyun ve 280 gs'de dönüşü başlatın. Vakum pompasını çalıştırın ve 24 saat dönmesine izin verin.

Ertesi gün, tüpe 0,5 mililitre 20 milimolar heis tamponu ekleyin ve 15 dakika boyunca girdaplayın. Daha sonra tüpü sonik bir yemek banyosuna yerleştirin ve 40 santigrat derecede 15 dakika boyunca sonikat yapın. Hücreleri hazırlamak için, bir P 100 kabını birleşik Çin hamster yumurtalığını yıkayın veya bir hücreyi 10 mililitre PBS ile üç kez CHOK'layın.

Sonra bir mililitre tripsin ekleyin ve beş dakika boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücrelerin bu hücre içeren çözeltinin 150 mikrolitre tohumunu askıya almak için% 10 FBS ile desteklenmiş dokuz mililitre D-M-E-M-F 12 ekleyin. Aynı ortamdan 800 mikrolitre içeren 22 milimetre cam tabanlı bir Petri kabında.

Hücreleri 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Lipid katılımı için, hücre ortamını 500 mikrolitre serum içermeyen ortamla değiştirin ve 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, iki mikrolitre lipozom çözeltisi ekleyin ve 15 dakika daha inkübe edin.

Ardından hücreleri PBS ile yıkayın ve yeni DM EMF 12 ekleyin. Deneyden en az 12 saat önce görüntülemeden önce, mikroskop aşamasını ve optik bileşenleri deney sıcaklığına getirmek için mikroskop inkübatörünü açın. Bu prosedürün en zor adımı bu edinimdir.

Başarıyı sağlamak için, sistem için her alım parametresini optimize ettiğinizden emin olun. Çalışılıyor. Deney günü mikroskobu açın, kameraların çalışma sıcaklığına ulaşmasını bekleyin.

Deneyi gerçekleştirmek için iki kamera kullanacağız. Birinci kamera görüntüleme için, ikinci kamera ise hücreyi seçmek için kullanılacaktır. Bu yapılandırma, yazılımda elde edilebilecek en hızlı edinme süresine izin verecektir.

İletilen ışık görüntüleme parametrelerini ayarlamak için. 20 milisaniye girin Pozlama süresi için, her iki kamera için EM kazancı için bir milisaniye girin. Ardından yazılımda kontrast modu penceresini açın ve sola dönün.

Parlak alan seçeneğini seçmek için BF'ye tıklayın. Numuneyi göz merceklerinden görüntülerken numuneleri tutucuya koyun. Numuneyi odak noktasına getirin.

Ardından ışığı manuel olarak birinci kameraya gönderin ve yarıkları hafifçe itin, böylece yalnızca görüntülenecek yatırım getirisi aydınlatılır. Ardından, bir hücreyi seçilen bölgeye taşıyın ve yazılımı kullanarak ışığı ikinci kameraya gönderin. Ardından yazılımda, bir referans oluşturmak için bir yatırım getirisi çizin.

İlk olarak, lazeri yazılımla hizalamak için otomatik hizalamayı seçin. Ardından otomatik hizalama prosedürünü başlatmak için kolimatörü etkinleştir'i seçin. Ardından üstteki inkübatörü açın ve lazer ışınını toplayın.

Lazer, yazılım penceresinin sol alt köşesinde hizalandığında, penetrasyon derinliğini 70 nanometre olarak ayarlamak için 70 düğmesine tıklayın. Bu, Leica uygulama paketinde lazerin alt cam üzerindeki yaklaşık 70 derecelik bir geliş açısına karşılık gelecektir. Gelişmiş floresan yazılımı maruz kalma süresi metin kutusu.

EM kazancı metin kutusuna 70 milisaniye girin. Aynısını ikinci kamerada da yapmak için 1000 girin. Ayarlar penceresini açın ve ilgili metin kutularına aynı numaraları girin.

Ardından, canlı düğmesine tıklayın. Floresan birinci kameraya gönderilecek ve numunenin bir görüntüsü ekranda görünecektir. Bir floresan hücre ilgilenilen referans bölgesine ulaşana kadar numuneyi hareket ettirin.

Ardından, ışığı ikinci kameraya göndermek için mikroskop gövdesinin önündeki düğmeye basın ve ve/veya taban yazılımındaki hücre zarına odaklanmak için Z konum tekerleğini doğru bir şekilde hareket ettirin. Ayarlar penceresini açın ve elde edilebilecek minimum pozlama süresi olan 1000 EM kazanç kırpılmış sensör modunu 10 beşinci tekrara ayarlayın ve görüntü serisini almaya başlamak için otomatik kaydetme seçeneğini ayarlayın. Yazılımın kamera simgesine tıklayın ve satın alma işleminin bitmesini bekleyin.

Ardından ayarlar penceresini açın, EM kazancını devre dışı bırakın ve kırpılmış mod seçeneğinden kontrolü kaldırın. Çekim sırasında, kameranın sıcaklığı genellikle yaklaşık iki ila üç derece artar. Bu nedenle, yeni bir hücreden görüntü almadan önce, optimum çalışma sıcaklığına ulaşılana kadar bekleyin.

Yine, görüntüleme tamamlandıktan sonra, ilgilenilen molekülün floresan olarak etiketlenmiş bir varyantını elde etmek için görüntülemeden ortalama kare yer değiştirmeyi hesaplamak için ekteki belgedeki talimatları izleyin. CHOK bir hücreleri ya ADO 4 88 PPE ile etiketlendi ya da reseptör veya T-F-R-G-F-P'de bir transfer ile transfekte edildi ve bu videoda tarif edildiği gibi TIRF ile görüntülendi. Burada görülebileceği gibi, ADO 4 88 PPE için ölçülen difüzyon yasası düzdür, daha önce uyarılmış emisyon tükenmesi floresansı, korelasyon spektroskopisi veya T-F-R-G-F-P ile transfeksiyonu takiben sabit FCS ölçümleri ile gösterildiği gibi çoğunlukla serbest bir difüzyonu gösterir, T-F-R-G-F-P için ölçülen difüzyon yasası başlangıçta düzdür ve saniyede yaklaşık 0,7 mikron karelik bir ortalama görünür difüzyon katsayısı ile ortalama moleküler yer değiştirmenin 100 nanometrenin altında kalır.

Bunu, görünür yayılımda saniyede 0,2 mikron kareye kadar hızlı bir azalma izler. Tipik olarak kırınım sınırlı FCS ile ölçülen değer. Bu son örnekte gösterildiği gibi, mevcut yaklaşımın, GFP gibi nispeten loş ve yoğun etiketler kullanarak bile birkaç on nanometrelik bir çözünürlükle ortalama moleküler yer değiştirmeyi kolayca ölçebileceğini belirtmek ilginçtir.

Ayrıca, görünür difüzyon katsayısının azalmaya başladığı uzamsal ölçek, önceki tahminlere uygun olarak, zar iskeleti tarafından protein kısmi hapsedilmesinin karakteristik boyutunu yaklaşık 120 nanometre olarak belirler. Veri analizi prosedürüne hakim olduktan sonra bu edinim birkaç dakika içinde gerçekleştirilebilir. Bu tekniğin, hücresel ve moleküler biyoloji alanındaki araştırmacıların, yaşam örneklerinde protein ve lipid difüzyonunun uzay-zamansal düzenlemesini kolay ve nicel olarak keşfetmelerinin önünü açacağına inanıyoruz.