Name: Primer Hücre Kültürü Araştırmaları Chick retina Verimli Gen Transferi: Bir Eski-ovo Elektroporasyon Yaklaşımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Öğrenin, embriyonik tavuk retinasında yüksek verimli gen transferi için ex ovo elektroporasyon yöntemini. Bu teknik, primer hücre kültürlerinde fotoreseptör biyolojisi araştırmalarını kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Veri analizine verdiği destek için David O'Brien'a ve eleştirel tartışmaları için Canto-Soler laboratuvarının tüm üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma, NIH hibeleri EY004859 ve EY022631 (MVCS), Core Grant EY1765 ve Research to Prevent Blindness, Inc.'den sınırsız bir departman hibesi ile desteklenmiştir.

Bu çalışmada tarif edilen tüm prosedürler, Johns Hopkins Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından kurallara göre gerçekleştirilmiştir. Öncesinde Zaman: 1. Araçlar, Reaktifler ve Yemekleri Hazırlama <ol><li> Yumurtalar hazırlanması: Bir yumurta kuluçka makinesi içinde 5 gün 37,5 ° C ve% 60 bağıl nemde döllenmiş Beyaz Legorn tavuk yumurtası inkübe edin. NOT: standartlaştırılması ve embriyonik gelişim senkronizasyonu için yararlı olabilir kapasitesi sallanan, ama sallanan bir inkübatör bu protokol sonucu için kesinlikle gerekli değildir. </li><li> Plazmid hazırlanması: <ol><li> Gerektiğinde tasarım plasmid (RNAi teknolojisinde 1,34 kullanımı yoluyla örneğin) geni aşırı ekspresyonu veya aşağı doğru düzenleme için yapılırlar. Mümkün olan her yapı içinde bir raportör gen (örneğin, EGFP, RFP veya LacZ gibi) içerir. Not: CMV gibi bazı yaygın olarak kullanılan promotörler, bir süre sonra susturulması hale gelebilir. CAG promoter (tavuk beta-aktin promoteri, CMV artırıcı ile) ilgi 35-37 genin etkin, uzun vadeli ifade sağlayan, çok iyi bir alternatiftir. </li><li> Şekilde steril PBS içerisinde 1.5 ug / ul bir konsantrasyonda bir plazmid çözeltisi hazırlayın. İSTEĞE BAĞLI: vaktinden plazmid çözüm hazırlayın ve dondurulmuş Kullanıma hazır olana kadar saklayın. NOT: Yüksek plazmid konsantrasyonları kullanılarak oysa alt plazmid konsantrasyonları transfeksiyon verimliliği 1 düşük, verimlilik önemli bir artışa yol açmaz. </li></ol></li><li> Elektrotlar: <ol><li> Anot kullanımı için kalın bir altın (Belirli Malzemeler / Ekipman Tablo) elektrodu uçlu. % 70 etanol ile silin. Not: altın İzolasyon maruz kalan yaklaşık 0,5 mm bırakarak, elektrot uçlu, elektrik akımının sızmasını en aza indirmek için tavsiye edilir. Yalıtım malzemesi için bilgiler Özgül Materyallerin Tablo bulunabilir. </li><li> 2.5 mm kare b dışında bir katot yapın(normalde Mikropipet Elcikler kullanılan) 4.5 mm genişliğinde öküz filament. Forseps yardımı ile, kare kutu geri almak ve uzun bir şerit haline filamanın düzeltin. Daha sonra, diseksiyon mikroskobu ve bir kılavuz olarak bir cetvel kullanarak altında, tabanda 3 mm uzunluğunda kare &quot;U&quot; şekline filamanın bükülmesi ve diğer tarafta filament kalan uzunluğu (Şekil 1 ile birlikte, bir yandan 2 mm yükseklikte C - D). Forseps kullanarak,% 96 etanol ve alev elektrot sterilize etmek batırın. Sonra elektrot uzun koluna küçük bir timsah klibi ile bir elektrik kurşun takın. </li></ol></li><li> Elektroporasyon Odası Kurulumu: <ol><li> 100 mm Petri kabı kullanarak bant (Şekil 1E) için, aşağı, düz tarafı bunu steril bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp kapağı kesme ve yapıştırılması ile elektroporasyon odasını hazırlayın. Not: işe benzer büyüklükte bir oyuk şeklinde diğer bir kap; Ancak, bir mikrosantrifüj tüp kapağı kolayca erişilebilir ve otoklavlanabilir. Kuyuplazmid çözümün bir atık sonuçlanması bir civciv göz ve katot elektrot evine kadar büyük, ama çok büyük olmamalıdır. </li></ol></li></ol> 2. Ex ovo Elektroporasyon Prosedürü <ol><li> Araçların Hazırlanması: <ol><li> Mikro-diseksiyon araçları sterilize batırarak (yumurta kabukları açılması ve embriyolar, RPE kaldırmak için Dumont cımbız kavisli ince ucu 2 çift dışarı karıştırıyordu için büyük kavisli Moloney forseps 2 çift, Bonn bir çift kaldırma lens ve vitreus için forseps dişli) % 96 etanol ve alevli ipuçları. % 70 etanol batırılmış mendil kullanarak temizleyin diseksiyon kapsamı. Bir 37 ° C su banyosu içinde, steril Kalsiyum-Magnezyum içermeyen Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (CMF-HBSS) bir şişe ısıtın. Sıcak CMF-HBSS ile tam 3/4 100 mm steril Petri kapları doldurun. </li><li> Başka bir temiz diseksiyon mikroskobu altında elektroporasyon odasına yerleştirin ve plazmid çözüm 120 ul ile doldurun. Elektroporasyon aparatı elektrotları geç yapmaEmin ısmarlama elektrot negatif kutbuna bağlı olan ve altın pozitif kutup elektrodu uçlu. </li></ol></li><li> Embriyo Koleksiyon: <ol><li> % 70 etanol içinde ıslatılmış mendillere kabukları ile silerek yumurta temizleyin. Kültürleri kirlenmesini önlemek için taşıma protokolün geri kalanı boyunca steril prosedür koruyun. Büyük kavisli Moloney forseps kullanarak dikkatlice yavaşça (hava bölmesinin üstünde) bir yumurta yuvarlak ucunda dokunarak ve ardından sürükleyici ve kabuk parçaları çekerek yumurta kabuğunda bir delik açın. </li><li> Forseps başka çift membranlar kaldırmak ve yumurta dışarı karıştırıyordu embriyo toplamak ile (dikkatli olmak embriyo zarar vermemek için). CMF-HBSS ile bir tabak koyun. NOT: 2.4.4 belirtildiği gibi elektroporasyon için retina bardak istenen sayısını elde etmek için gerektiği kadar embriyolar toplayın </li><li> KRİTİK ADIM: Hamburger ve Hamilton 38 göre embriyolar Sahne. NOT: Optimum verimlilik embriyolar elde etmek içinevre 27 (Şekil 2A) olmalıdır. </li><li> Moloney forseps kullanarak kafaları kesilmek suretiyle embriyolar Euthanize. </li></ol></li><li> Retina Kupaları edinme: <ol><li> İnce Dumont cımbız kullanarak, dikkatle gözleri enükleasyon ve yeni bir CMF-HBSS çanak aktarın. </li><li> Optik sinir başı yakınında her göz, arka kısmından başlayarak, iki ince Dumont cımbız kullanarak, nöral zarar vermemeye RPE dikkatli olmak teşrih nöral retina ve RPE ve dikkatle arasındaki cımbız her çiftin bir ipucu tanıtmak Retina (Şekil 2B). NOT: RPE yardımcı olacaktır çözeltide Ca 2 + ve Mg 2+ eksikliği daha kolay nöral retina ayırmak. </li></ol></li><li> Elektroporasyon: <ol><li> 15 Volt, 50 msn süreli ve 950 msn aralığının 5 kare darbeleri teslim Electroporator parametreleri ayarlayın. Yer &#39;U&#39; elektroporasyon odası (mikrosantrifüj kapak dolgu içinde negatif elektrot şeklindeplazmid içeren çözeltinin 120 ul) ile ed. </li><li> Kullanımı kavisli Dumont cımbız (değil karıştırıyordu basarak) elektroporasyon odasına tek retina fincan aktarmak ve elektrodun alt ve yukarı bakacak objektif yönüne retinanın arka kısmı ile, &#39;U&#39; şekilli elektrodun içine yerleştirin ( Şekil 2B). </li><li> Bir sonraki lens, gözün ön kısmını dokunur ve Electroporator ayak pedalı elektrik atımları teslim kullanarak böylece anot yerleştirin. </li><li> CMF-HBSS ile yeni bir Petri kabı elektropore retina fincan aktarın ve kalan retina bardak her biri ile elektroporasyon prosedürü tekrarlayın. Not: 6 retina bardak kadar transfeksiyon verimi önemli bir azalma olmadan aynı plazmid çözeltisi ile elektropore edilebilir. </li><li> Bonn dişli forseps ile onları kavrama ve yavaşça t içinden çekerek her electroporated retina fincan lens ve vitreus vücuda kaldırkavisli Dumont cımbız arkası ile yerinde gözü tutarken o açılış öğrenciye. </li><li> Standart prosedürler izlenerek Electroporated retina hücreleri ayrışma ve kültür geçin. NOT: civciv retina hücreleri ayrışma ve kültürü üzerinde detaylı bir protokol için Vergara ve Canto-Soler, 2012, Ek dosyaya 4 21 bakın Bu protokolde hücreler poliornitin kaplı 6-kuyucuğu veya 35 düşük yoğunlukta numaralı seribaşı. -mm yemekleri (6 x 10 5 hücre / 35 mm çaplı kuyu veya çanak). Kullanılan ortam penisilin / glutamin, 10% fetal buzağı serumu (FCS) ve 100 ug / ml&#39;de, linoleik asit-BSA ile 199 ortamıdır. Kültürler,% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde muhafaza edilir. Bu prosedürü kullanarak, 5-6 x 10 6 hücre genellikle her aşama 27 Electroporated göz başına elde edilebilir. NOT: İdeal olarak, en fazla 3 saat embriyo toplama ve hücre kaplama arasında geçmelidir, iyi hücre hayatta kalmasını sağlamak içinve stresi en aza indirmek. Gözlem ve daha fazla analiz için tipik bir zamanlama bu noktada hücreler, iyi bir morfolojik ve moleküler farklılaşma elde ettik ve hayatta kalma hala yüksek olduğu için, kültür içinde 4 gün sonra olur. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Vergara, M. N., Gutierrez, C., O'Brien, D. R., Canto-Soler, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+electroporation+of+retinal+cells%3A+a+novel%2C+high+efficiency+method+for+functional+studies+in+primary+retinal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Ex vivo electroporation of retinal cells: a novel, high efficiency method for functional studies in primary retinal cultures.</a> Exp Eye Res. 109, 40-50 (2013).</li>
<li>Chalmel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod-derived+Cone+Viability+Factor-2+is+a+novel+bifunctional-thioredoxin-like+protein+with+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential.</a> BMC Mol Biol. 8, 74(2007).</li>
<li>Goureau, O., Regnier-Ricard, F., Desire, L., Courtois, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+nitric+oxide+in+photoreceptor+survival+in+embryonic+chick+retinal+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Role of nitric oxide in photoreceptor survival in embryonic chick retinal cell culture.</a> J Neurosci Res. 55 (4), 423-431 (1999).</li>
<li>Hewitt, A. T., Lindsey, J. D., Carbott, D., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+survival-promoting+activity+in+interphotoreceptor+matrix+preparations%3A+characterization+and+partial+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor survival-promoting activity in interphotoreceptor matrix preparations: characterization and partial purification.</a> Exp Eye Res. 50 (1), 79-88 (1990).</li>
<li>Leveillard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+rod-derived+cone+viability+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of rod-derived cone viability factor.</a> Nat Genet. 36, 755-759 (2004).</li>
<li>Lorentz, O., Sahel, J., Mohand-Said, S., Leveillard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+survival%3A+identification+of+RdCVF%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Cone survival: identification of RdCVF.</a> Adv Exp Med Biol. 572, 315-319 (2006).</li>
<li>Nakamura, M., Singh, D. P., Kubo, E., Chylack Jr, L. T., Shinohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LEDGF%3A+survival+of+embryonic+chick+retinal+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">LEDGF: survival of embryonic chick retinal photoreceptor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (5), 1168-1175 (2000).</li>
<li>Paes-de-Carvalho, R., Maia, G. A., Ferreira, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+regulates+the+survival+of+avian+retinal+neurons+and+photoreceptors+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Adenosine regulates the survival of avian retinal neurons and photoreceptors in culture.</a> Neurochem Res. 28 (10), 1583-1590 (2003).</li>
<li>Stenkamp, D. L., Gregory, J. K., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoid+effects+in+purified+cultures+of+chick+embryo+retina+neurons+and+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinoid effects in purified cultures of chick embryo retina neurons and photoreceptors.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (8), 2425-2436 (1993).</li>
<li>Fuhrmann, S., Kirsch, M., Hofmann, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+neurotrophic+factor+promotes+chick+photoreceptor+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ciliary neurotrophic factor promotes chick photoreceptor development in vitro.</a> Development. 121 (8), 2695-2706 (1995).</li>
<li>Toy, J., Norton, J. S., Jibodh, S. R., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+homeobox+genes+on+the+differentiation+of+photoreceptor+and+nonphotoreceptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of homeobox genes on the differentiation of photoreceptor and nonphotoreceptor neurons.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (11), 3522-3529 (2002).</li>
<li>Yan, R. T., He, L., Wang, S. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-photoreceptor+activity+of+chick+neurogenin1%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Pro-photoreceptor activity of chick neurogenin1.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (12), 5567-5576 (2009).</li>
<li>Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neurite+growth+in+purified+retina+neuronal+cultures%3A+Effects+of+PNPF%2C+a+substratum-bound%2C+neurite-promoting+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of neurite growth in purified retina neuronal cultures: Effects of PNPF, a substratum-bound, neurite-promoting factor.</a> J Neurosci Res. 8 (2-3), 165-177 (1982).</li>
<li>Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+retinal+cell+differentiation+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A model of retinal cell differentiation in the chick embryo.</a> Prog Retin Eye Res. 19 (5), 529-557 (2000).</li>
<li>Adler, R., Hatlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+and+differentiation+of+embryonic+retinal+cells+after+terminal+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plasticity and differentiation of embryonic retinal cells after terminal mitosis.</a> Science. 243 (4889), 391-393 (1989).</li>
<li>Adler, R., Lindsey, J. D., Elsner, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+cone-like+properties+by+chick+embryo+neural+retina+cells+in+glial-free+monolayer+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of cone-like properties by chick embryo neural retina cells in glial-free monolayer cultures.</a> J Cell Biol. 99 (3), 1173-1178 (1984).</li>
<li>Adler, R., Magistretti, P. J., Hyndman, A. G., Shoemaker, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+cytochemical+identification+of+neuronal+and+non-neuronal+cells+in+chick+embryo+retina+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Purification and cytochemical identification of neuronal and non-neuronal cells in chick embryo retina cultures.</a> Dev Neurosci. 5 (1), 27-39 (1982).</li>
<li>Belecky-Adams, T., Cook, B., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlations+between+terminal+mitosis+and+differentiated+fate+of+retinal+precursor+cells+in+vivo+and+in+vitro%3A+analysis+with+the+%27window-labeling%27+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlations between terminal mitosis and differentiated fate of retinal precursor cells in vivo and in vitro: analysis with the 'window-labeling' technique.</a> Dev Biol. 178 (2), 304-315 (1996).</li>
<li>Hyndman, A. G., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+retina+development+in+vitro.+Effects+of+tissue+extracts+on+cell+survival+and+neuritic+development+in+purified+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural retina development in vitro. Effects of tissue extracts on cell survival and neuritic development in purified neuronal cultures.</a> Dev Neurosci. 5 (1), 40-53 (1982).</li>
<li>Politi, L. E., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+enriched+populations+of+cultured+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Generation of enriched populations of cultured photoreceptor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 27 (5), 656-665 (1986).</li>
<li>Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rediscovering+the+chick+embryo+as+a+model+to+study+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development.</a> Neural Dev. 7, 22(2012).</li>
<li>Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+cellular+types+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Determination of cellular types in the retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1677-1682 (1993).</li>
<li>Repka, A., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+retinal+precursor+cells+born+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of retinal precursor cells born in vitro.</a> Dev Biol. 153 (2), 242-249 (1992).</li>
<li>Morris, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetry+in+a+receptor+mosaic+demonstrated+in+the+chick+from+the+frequencies%2C+spacing+and+arrangement+of+the+types+of+retinal+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Symmetry in a receptor mosaic demonstrated in the chick from the frequencies, spacing and arrangement of the types of retinal receptor.</a> J Comp Neurol. 140 (3), 359-398 (1970).</li>
<li>Li, H., Chan, S. T. H., Tang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+rat+brain+cells+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Transfection of rat brain cells by electroporation.</a> J Neurosci Methods. 75 (1), 29-32 (1997).</li>
<li>Martinez, C. Y., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+primary+central+and+peripheral+nervous+system+neurons+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transfection of primary central and peripheral nervous system neurons by electroporation.</a> Methods Cell Biol. 71, 339-351 (2003).</li>
<li>Boatright, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5%27+flanking+regions+of+IRBP+and+arrestin+have+promoter+activity+in+primary+embryonic+chicken+retina+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The 5' flanking regions of IRBP and arrestin have promoter activity in primary embryonic chicken retina cell cultures.</a> Exp Eye Res. 64 (2), 269-277 (1997).</li>
<li>Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+phosphate+transfection+of+DNA+into+neurons+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture.</a> Curr Protoc Neurosci. Chapter 3, Unit 3.11(2001).</li>
<li>Kumar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bZIP+transcription+factor+Nrl+stimulates+rhodopsin+promoter+activity+in+primary+retinal+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The bZIP transcription factor Nrl stimulates rhodopsin promoter activity in primary retinal cell cultures.</a> J Biol Chem. 271 (47), 29612-29618 (1996).</li>
<li>Toy, J., Bradford, R. L., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-mediated+gene+transfection+into+chick+embryo+retinal+cells+in+ovo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Lipid-mediated gene transfection into chick embryo retinal cells in ovo and in vitro.</a> J Neurosci Methods. 104 (1), 1-8 (2000).</li>
<li>Werner, M., Madreperla, S., Lieberman, P., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+transfected+genes+by+differentiated%2C+postmitotic+neurons+and+photoreceptors+in+primary+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Expression of transfected genes by differentiated, postmitotic neurons and photoreceptors in primary cell cultures.</a> J Neurosci Res. 25 (1), 50-57 (1990).</li>
<li>Yuan, L., Kawada, M., Havlioglu, N., Tang, H., Wu, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+PRPF31+inhibit+pre-mRNA+splicing+of+rhodopsin+gene+and+cause+apoptosis+of+retinal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mutations in PRPF31 inhibit pre-mRNA splicing of rhodopsin gene and cause apoptosis of retinal cells.</a> J Neurosci. 25 (3), 748-757 (2005).</li>
<li>Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RCAS+vector+system%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Biol+%28Praha%29%22%5BJournal%5D)">The RCAS vector system.</a> Folia Biol (Praha). 50 (3-4), 107-119 (2004).</li>
<li>Das, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+system+for+RNA+interference+in+the+chicken+using+a+modified+microRNA+operon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon.</a> Dev Biol. 294 (2), 554-563 (2006).</li>
<li>Nguyen, A. T., Dow, A. C., Kupiec-Weglinski, J., Busuttil, R. W., Lipshutz, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+gene+promoters+for+liver+expression+by+hydrodynamic+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of gene promoters for liver expression by hydrodynamic gene transfer.</a> J Surg Res. 148 (1), 60-66 (2008).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CMV-beta-actin+promoter+directs+higher+expression+from+an+adeno-associated+viral+vector+in+the+liver+than+the+cytomegalovirus+or+elongation+factor+1+alpha+promoter+and+results+in+therapeutic+levels+of+human+factor+X+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice.</a> Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).</li>
<li>You, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+promoter-containing+vector+for+direct+cloning+and+enhanced+expression+of+PCR-amplified+ORFs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">A hybrid promoter-containing vector for direct cloning and enhanced expression of PCR-amplified ORFs in mammalian cells.</a> Mol Biol Rep. 37 (6), 2757-2765 (2009).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları olmadığını beyan ederler.

Bu protokolün başarısı için en kritik adım embriyoların uygun sahne seçmektir. Önceki yayınlarda, embriyonik gelişim evrelerinin bir dizi tipik kuluçka veya embriyonik gün gün (ED) tarafından tanımlanan, bu kültürlerin verilir; Böylece genellikle ED 6 embriyolar ED 5 kullanarak eşdeğer sonuçlar verecektir varsayılmaktadır. Bununla birlikte, yukarıda belirtildiği gibi sahne 27 (ED 5) üzerine, transfeksiyon verimi, toplam hücre nüfusunun yaklaşık% 22 olacak olduğunu bulmuşlardır; Henüz verim evre evre 29 28 embriyolar (ED...

Embriyonik civciv retina gelen ayrışmış hücre kültürleri yaygın olarak kendi yaşam 2-9, farklılaşma 10-12, neurite akıbet 13, ve daha fazlasını içeren fotoreseptör hücre biyolojisi çeşitli yönlerini incelemek için kullanılmıştır. Ruben Adler ve işbirlikçileri tarafından 1980&#39;li yıllarda geliştirilen ve onun ve diğer gruplar 14-20 tarafından mükemmelleştirilmiş bu sistemin avantajları, bir hayvan modelinde 21 olarak civciv içsel özelliklerinin bulunması. Hatta embriyonik aşamada civciv gözün büyük boy, kültürlerin için malzeme büyük miktarlarda sağlar. Kültürler embriyonik gün (ED) 5 kullanılarak yapılır Dahası, - 6 retinalar, 55 - Bu hayvanda fotoreseptör yaklaşık% 86 olduğu için kendi progenitör hücrelerin% 80 Fotoreseptörlerin 14,15,18,22,23 olarak ayırt ve koniler 24, bu kültürler, bu hücre tipi ilgili çalışma için özellikle uygundur. Biz son zamanlarda develo varped ve böylece, genetik missexpression çalışmaları 1 kolaylaştırarak bu sistem kullanışlılığı genişletilmesi, bu kültürlerde hücre yüksek verimli plazmid transfeksiyon sağlayan basit bir teknik ile karakterize edilir. Bu tekniğin geliştirilmesi, bir hücre bağımsız bir şekilde gen fonksiyonlarının araştırılmasında izin vermek için transfeksiyon kabul edilebilir bir düzeyde sağlayacak yöntemler bilimsel literatürde bir boşluk kaynaklanmıştır. Primer nöronal kültürlerin 25,26 transfect herkesin bildiği zor, çünkü bu bölümünde yer almaktadır. Bu amaç için daha önce mevcut olan en yaygın olarak kullanılan tekniklerin bazıları 3-5% sırasına verim neden olur ve ciddi yan etkilere 27-32 uygulayabilir gibi lipofeksiyon veya kalsiyum fosfat aracılı transfeksiyon gibi kimyasal nakil yöntemlerini, dahildir. Enzimatik muhabir sistemi ile Plazmidlerin kullanılması sinyalini yükselterek yoksul transfeksiyon verimlilik sorunu aşmak olsa bile, onlar değilHücre-spesifik etkileri ayırt ve bunların sonuçları bütünün temsilcisi olmayabilir küçük bir hücre popülasyonu dayanmaktadır. Civciv Yaygın olarak kullanılan bir yöntem olup, RCAS virüsü enfeksiyonu, çoğalan hücreler için geçerlidir, bu primer retina kültür sistemine 33 dolayısıyla uygun değildir. Mevcut protokolde civciv embriyosu gözler evre 27 (ED 5), retinal pigment epitel (RPE) çıkarılır ve retina kap bir plasmid ihtiva eden çözelti ile doldurulmuş bir elektroporasyon odasına yerleştirilen en çıkarılmış ve kullanılarak, elektroporasyon bakımından güçlü ölçüye standart teknikler kullanılarak retina ayrışması 21 ve kültür izledi elektrotlar. Bu prosedürü optimize sonra hayatta kalma ve farklılaşma özelliklerini ödün vermeden sürekli, kültür hücreleri ve yalnız fotoreseptör nüfus içinde% 25 toplam sayısının% 22 mertebesinde transfeksiyon verimliliği elde etmek mümkün olmuşturKültürler 1. Burada bu tekniğin başarı ve yeniden üretilebilirlik sağlamak için, bu prosedür tüm önemli adımları gösteren bir detaylı bir protokol sağlar.

<table><tbody><tr><td>ECM 830 Elektro Kare Poratör</td><td>BTX/ Harvard Aparatı</td><td>45-0052</td><td></td></tr><tr><td>Genetrode, L-Şekilli, 5 mm Altın Uçlu</td><td>BTX/ Harvard Aparatı</td><td>45-0115 model 512</td><td>Anot olarak kullanılan altın uçlu elektrot</td></tr><tr><td>Poliimid Boru</td><td>Vention Tıbbi</td><td>özel yapım</td><td>İç Çap: 0,5 mm / duvar kalınlığı: 0,15 - 0,2 mm. Altın uçlu elektrodu</td></tr> <tr><td>yalıtmak için kullanılır2,5 mm kare kutu filament, 4,5 mm genişliğinde</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>FB245B</td><td>Katot elektrot yapmak için kullanılır</td></tr><tr><td>HBSS, kalsiyum yok, magnezyum yok, fenol yok kırmızı</td><td>Gibco - Yaşam Teknolojileri</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Moloney forseps</td><td>Roboz</td><td>RS-8254</td><td>Tırtıklı; hafif eğri; 4.5" Uzunluk</td></tr><tr><td>Dumont cımbız 5/45</td><td>Roboz</td><td>RS-5058</td><td>Desen #5, 45 derece açı; .10 x .06mm uç boyutu; 109mm Uzunluk</td></tr><tr><td>Bonn mikro forseps, 1x2 diş</td><td>Roboz</td><td>RS-5172</td><td>Bağlama Platformu; 1x2 Diş, 0.12 mm Diş; 3.75 "Uzunluk; 0,3 mm Uç Genişliği</td></tr></tbody></table>

primer hücre kültürü araştırmaları chick retina verimli gen transferi: bir eski-ovo elektroporasyon yaklaşımı

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embriyonik civciv retina elde edilen koni fotoreseptör zenginleştirilmiş kültürler retinal nöronların, özellikle fotoreseptör biyoloji okuyan dünyadaki araştırmacılar için vazgeçilmez bir araç haline gelmiştir. Kolayca ilaç gelişimi için yüksek verimli teknolojileri için adapte edilebilir, bu sistemin uygulamalar temel araştırma ötesine geçmektedir. Bununla birlikte, bu kültürlerde retina fotoreseptörlerinin genetik manipülasyon sisteminin yararlılığını önemli bir sınırlandırma getirmeden, çok zor olduğu kanıtlanmıştır. Biz son zamanlarda geliştirilen ve diğer mevcut protokoller 1 ile karşılaştırıldığında beş kat bu kültürlerde retina hücrelerinin transfeksiyon hızını artırır plazmid elektroporasyon tekniği ovo bir eski valide. Bu yöntemde, civciv embriyosu gözler RPE çıkarılır, evre 27 de enükle edilir ve retina kap bir plasmid ihtiva eden bir çözeltiye yerleştirilmiş ve kolaylıkla inşa alışılagelmiş kullanılarak elektroporasyonayapılan elektrotlar. Retinalar sonra ayrışmış ve kültürlü standart prosedürleri kullanıyor. Bu teknik genel olarak, fotoreseptör nüfusunun% 25 transgen ekspresyonunu elde plazmit odaklı RNAi teknolojisinde kullanımı ile, örneğin, fazla sentezlenme çalışmaları yanı sıra, gen ekspresyonunda azalma uygulanabilir. Mevcut yayın video formatı primer retina kültürlerde gen fonksiyonu çalışma sağlayan, alanında araştırmacılara bu teknoloji kolayca erişilebilir hale getirecektir. Biz de başarılı bir sonuç ve tekrarlanabilirlik için bu prosedürün kritik adımlar ayrıntılı açıklamalar dahil ettik.

Burada daha sonraki ayrışmış hücre kültürü için çıkartılmış civciv retina bardak içine plazmid transfeksiyon için basit bir protokol mevcut. Transfeksiyon özel elektrotlar (- 2 Şekil 1) hazırlanması kolaydır kullanılarak elektroporasyon ile elde edilmektedir. Bu protokol açıklanan parametreler% 20 ila 27 (Şekil 3D) (% 22 ortalama ile) aralığında transfeksiyon verimliliği elde etmek için optimize edilmiştir. Yukarıda belirtilen nedenlerden dolayı, bu sonuçlar, kültür içinde 4 gün sonra n...

Embriyonik civciv retinal hücre kültürleri fotoreseptör biyoloji çalışma için değerli araçlar oluşturmaktadır. Biz kültür öncesinde retina plazmid elektroporasyon ovo ex dayalı etkin gen transferi tekniğini geliştirdi. Bu teknik önemli ölçüde bu sistem için uygun genetik manipülasyon yaparak, mevcut protokoller üzerinde transfeksiyon verimliliği artırır.

Primer Hücre Kültürü Araştırmaları Chick retina Verimli Gen Transferi: Bir Eski-ovo Elektroporasyon Yaklaşımı

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Bu prosedürün genel amacı, primer retina kültürlerinde fonksiyonel genetik çalışmaları mümkün kılmak için retina hücrelerinin yüksek verimlilik, plazmid, transfeksiyonunu elde etmektir. Bu, ilk olarak hamburger ve Hamilton sisteminin 27. aşamasında tavuk embriyolarının toplanmasıyla gerçekleştirilir. Optimum verimlilik elde etmek için uygun evreleme kritik öneme sahiptir.İkinci adım, embriyonik gözleri incelemek ve nöral retinayı açığa çıkaran retina pigmentli epitelin çıkarılmasıdır. Daha sonra, retina kabı plazmit çözeltisi ile dolu bir odaya yerleştirilir. Daha sonra, kolayca inşa edilmiş özel yapım elektrotlar kullanılarak optimize edilmiş koşullar altında elektroporasyona tabi tutulur.Son adımlar, vitreus gövdesini ve lensi çıkarmak ve düşük yoğunluklu primer kültür için nöral retinayı tek hücrelere ayırmaktır. Sonuç olarak, transfekte edilmiş hücreler, raportör genlerin ekspresyonu veya immünohistokimya ile görselleştirilebilir ve etkili genetik manipülasyon, aşağı akış genlerinin ekspresyonu ve/veya fenotipik hücre değişiklikleri değerlendirilerek değerlendirilebilir. Bu tekniğin lipofeksiyon veya kimyasal transfeksiyon gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, retina hücrel

efficient-gene-transfer-chick-retinas-for-primary-cell-culture

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Burada fare retina ganglion hücrelerinin (RGCs) gen ekspresyonu işlemek için iki teknik...

Fare Retina Ganglion Hücreleri Gen İfadesi utero ve ex vivo Elektroporasyon

Ince ucunu kullanarak, biz, tavuk Somitlerin veya sinir tüpleri alt etki alanlarını içine plazmid DNA enjekte mikropipetler. Plazmid konsantrasyonu tek transfekte hücreler oluşturmak için ayarlanır. Daha sonra hücreler klonal popülasyonları dönüşmesine izin verir.

Civciv Embriyolar Tek Hücreli Transfeksiyon

Kazanç ya da fonksiyon çalışmalar kaybı ya da yerine bir amaç için fare retina hücreleri içine plazmid DNA eklenmesi için bir...

Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak

Bu videonun genel amacı hedef retina enjeksiyon nasıl gerçekleştirileceği göstermek için...

Embriyonik Chick Retina Ovo Elektroporasyon

Işlevi ve orta beyin dopaminerjik nöron gelişimi sırasında genlerin düzenlenmesi değerlendirmek için, içeren bir yöntem...

Dopaminerjik Nöron Geliştirme Gen Fonksiyonunun Çalışılması için Chick orta beyin içinde ovo Elektroporasyon yılında

Daha sonra kuluçka dönemlerinde (Hamburger ve Hamilton evresi (SS) 22 yaşından büyük) az tavuk embriyosu gen transferi yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntem, dezavantajların...

Tarafından Eski Tavuk Embriyolar içine Gen Transferi<em&gt; Ex ovo</em&gt; Elektroporasyon

Bu protokol, teşrih deneysel işlemek ve tavuk embriyo kültür bütün retinal eksplantlar için bir yöntem tarif eder. Yüksek başarı oranı, etkinlik ve tekrarlanabilirlik elektroporasyon ve / veya reaktif maddelerin, örneğin, enzimatik inhibitörleri için plasmidlerin etkilerini test etmek için gerekli olduğunda eksplant kültürleri yararlıdır.

Elektroporasyon ve Kimyasal Reaktif tedaviler için Tavuk Embriyolar gelen bütün Retina Eksplantlarındaki

Biz floresan etiketlemeyi yüzeysel geçirme yöntemleri tarif Hücre çoğalmasıyla tarafından ve geçiş görselleştirmek için bir düz-mount kültür etiketli hücre hareketinin hızlandırılmış görüntüleme için hücre gelişmekte olan piliç optik tectum davranış .

Görselleştirme teğet hücre göç gelişmekte olan piliç optik Tectum içinde

İn ovo elektroporasyon ve Tol2 transpozon sistemini kullanarak yapay mikro-RNA dizilerinin civciv embriyolarına sokulmasını ve genomik entegrasyonunu içeren yeni bir fonksiyon kaybı yaklaşımı geliştirdik. Bu teknik, geliştirme sırasında gen fonksiyonu çalışmaları için sağlam ve kararlı bir gen yıkım metodolojisi sağlar.

Yapay mikroRNA'ların Tol2 Transpozon Aracılı Transgenik Ekspresyonu Kullanılarak Embriyonik Civciv Retinasında Fonksiyon Kaybı Yaklaşımı

Civciv, çeşitli çalışmalar için uygun maliyetli, erişilebilir ve yaygın olarak bulunan bir model organizmadır. Burada, kuş iç kulağı gelişimi ve yenilenmesinin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için bir dizi protokol detaylandırılmıştır.

Ovo ve Ex Ovo'da Kuş İç Kulak Gelişimini İnceleme Yöntemleri

Öğrenin, embriyonik tavuk retinasında yüksek verimli gen transferi için ex ovo elektroporasyon yöntemini. Bu teknik, primer hücre kültürlerinde fotoreseptör biyolojisi araştırmalarını kolaylaştırır.

Primer Hücre Kültürü Araştırmaları Chick retina Verimli Gen Transferi: Bir Eski-ovo Elektroporasyon Yaklaşımı

Daha fazla video keşfet