Primer Hücre Kültürü Araştırmaları Chick retina Verimli Gen Transferi: Bir Eski-ovo Elektroporasyon Yaklaşımı
2 Kasım 2015
Embriyonik civciv retinal hücre kültürleri fotoreseptör biyoloji çalışma için değerli araçlar oluşturmaktadır. Biz kültür öncesinde retina plazmid elektroporasyon ovo ex dayalı etkin gen transferi tekniğini geliştirdi. Bu teknik önemli ölçüde bu sistem için uygun genetik manipülasyon yaparak, mevcut protokoller üzerinde transfeksiyon verimliliği artırır.
Bu prosedürün genel amacı, primer retina kültürlerinde fonksiyonel genetik çalışmaları mümkün kılmak için retina hücrelerinin yüksek verimlilik, plazmid, transfeksiyonunu elde etmektir. Bu, ilk olarak hamburger ve Hamilton sisteminin 27. aşamasında tavuk embriyolarının toplanmasıyla gerçekleştirilir. Optimum verimlilik elde etmek için uygun evreleme kritik öneme sahiptir.
İkinci adım, embriyonik gözleri incelemek ve nöral retinayı açığa çıkaran retina pigmentli epitelin çıkarılmasıdır. Daha sonra, retina kabı plazmit çözeltisi ile dolu bir odaya yerleştirilir. Daha sonra, kolayca inşa edilmiş özel yapım elektrotlar kullanılarak optimize edilmiş koşullar altında elektroporasyona tabi tutulur.
Son adımlar, vitreus gövdesini ve lensi çıkarmak ve düşük yoğunluklu primer kültür için nöral retinayı tek hücrelere ayırmaktır. Sonuç olarak, transfekte edilmiş hücreler, raportör genlerin ekspresyonu veya immünohistokimya ile görselleştirilebilir ve etkili genetik manipülasyon, aşağı akış genlerinin ekspresyonu ve/veya fenotipik hücre değişiklikleri değerlendirilerek değerlendirilebilir. Bu tekniğin lipofeksiyon veya kimyasal transfeksiyon gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, retina hücrelerinin transfeksiyon oranını beş kat arttırması ve toplam hücre popülasyonunun% 22 ila 25'i arasında verimlilik sağlamasıdır.
Bu yöntem, fotoreseptör biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, çünkü birincil retina kültürlerinde gen ekspresyonunun biyolojik olarak anlamlı içgörüler sağlayabilecek bir verimlilik düzeyinde manipüle edilmesine izin verir. Bu tekniğin etkileri, ilaç geliştirme için yüksek verimli teknolojilere kolayca uyarlanabildikleri için temel araştırmanın ötesine uzanır. Döllenmiş beyaz bacak boynuzlu tavuk yumurtalarını bir yumurta kuluçka makinesinde beş gün boyunca 37,5 santigrat derecede ve% 60 bağıl nemde kuluçkaya yatırarak başlayın.
Deneyden önce, normalde mikro pipet çekmelerinde kullanılan bir kutu filamenti edinin. Kare kutuyu geri almak için forseps kullanın ve filamenti uzun bir şerit halinde düzeltin. Daha sonra bir cetveli kılavuz olarak kullanarak, filamenti tabanda üç milimetre uzunluğunda ve diğer tarafla bir tarafta iki milimetre yüksekliğinde kare u şeklinde bükün, filamentin kalan uzunluğu elektrotu% 96 etanole batırmak için forseps kullanın ve sterilize etmek için elektrotu kısaca alevlendirin.
Ardından, elektrotun uzun koluna küçük bir timsah klipsi olan bir elektrik kablosu takın. Ardından, kalın altın uçlu elektrodu %70 etanol kullanarak temizleyin. Ardından, sterilize edilmiş bir makas kullanarak steril 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünün kapağını keserek ve düz tarafı aşağı bakacak şekilde bant kullanarak 100 milimetrelik bir Petri kabına yapıştırarak elektroporasyon odasını hazırlayın.
Ardından, alet uçlarını %96 etanole batırarak ve kısa bir süre ateşleyerek mikrodiseksiyon aletlerini sterilize edin. Ayrıca, diseksiyon kapsamını %70 etanol kullanarak silerek temizleyin. Bir şişe steril kalsiyum ve magnezyum içermeyen Hanks denge tuzu çözeltisini 37 derece santigrat su banyosunda ısıtın.
Isındıktan sonra, 100 milimetrelik steril bir Petri kabının dörtte üçünü doldurmak için kullanın. Daha sonra elektroporasyon odasını temiz bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Daha sonra elektrotları elektroporasyon aparatına bağlayın, özel yapım elektrotun negatif kutba bağlı olduğundan ve altın uçlu elektrotun makinenin pozitif kutbuna bağlı olduğundan emin olun.
Kabukların dışını %70 etanol ile silerek yumurtaları temizleyin. Dikkatli olun ve protokolün geri kalanı boyunca steriliteyi koruyun. Büyük kavisli Maloney forsepsleri kullanarak kültürlere kontaminasyon taşımaktan kaçınmak için, bir yumurtanın yuvarlak ucuna doğrudan hava odasının üzerine hafifçe vurarak yumurta kabuğunda dikkatlice bir delik açın.
Tüm kabuk parçalarını başka bir forseps ile dışarı çekin. Zarları çıkarın ve embriyoyu yumurtadan dikkatlice çıkararak toplayın. Embriyoyu önceden ısıtılmış kalsiyum ve magnezyum içermeyen Hanks Balance tuz çözeltisi ile bir Petri kabına yerleştirin.
Uygun sayıda embriyo toplandığında, hepsinin doğru aşamada olduğundan emin olun. Hamburger ve Hamilton evreleme sistemine göre optimum verim için embriyoların 27. evrede olması gerekmektedir. Maloney forseps kullanarak dekapitasyon yoluyla embriyoları ötenazi yapın ve ardından gözleri dikkatlice ve çekirdeklerini çıkarmak için dumont cımbız kullanın.
Gözleri kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS içeren yeni bir Petri kabına aktarın. Optik sinir kafasına yakın her bir gözün arka kısmından başlayın ve ardından nöral retina ile retina pigmentli epitel arasına her bir dumont cımbız çiftinin bir ucunu sokun. Gözün arka kısmından öne doğru çalışarak, retina pigmentli epiteli dikkatlice incelemek için cımbız kullanın.
Nöral retinaya zarar vermemek için dikkatli olmak. Elektro perteri, 50 milisaniye süre ve 950 milisaniye aralıklarla 15 voltluk beş kare darbe verecek şekilde ayarlayın. Daha sonra, elektroporasyon odasını PBS'de mikrolitre başına 1.5 mikrogram konsantrasyonda 120 mikrolitre plazmit çözeltisi ile doldurun.
Ardından U şeklindeki negatif elektrodu mikro santrifüj kapağı elektroporasyon odasına yerleştirin. Bir çift kavisli dumont cımbız kullanarak. Bir retina kabını elektroporasyon odasına aktarın ve U şeklindeki elektrotun içine yerleştirin.
Retinayı, arka kısmı elektrotun altına doğru ve lens yukarı bakacak şekilde konumlandırın. Ardından, anodu merceğin yanındaki gözün ön kısmına değecek şekilde yerleştirin. Ardından, beş elektrik darbesi vermek için elektro akıncının ayak pedalını kullanın.
Bittiğinde, elektroporasyonlu retina kabını kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS ile doldurulmuş yeni bir Petri kabına aktarın. Elektroporasyon prosedürünü her ek retina kabı ile tekrarlayın. Transfeksiyon verimliliğinde önemli bir azalma olmaksızın aynı plazmit çözeltisi ile altı adede kadar retina kabı elektroporasyon yapılabilir.
Daha sonra, çıkarıldıktan sonra kavisli dumont cımbızının arkası ile gözü yerinde tutarken, her elektroporasyonlu numuneden lensi ve vitreus gövdesini nazikçe çıkarmak için bağ dişli forseps kullanın, standart teknikler kullanarak elektroporasyonlu retina hücrelerinin ayrışmasına ve kültürüne devam edin. Burada gösterilen retina hücreleri, bir GFP ekspresyonu, plazmid ile elektropore edildi, ayrıştı ve dört gün boyunca kültürlendi. Floresan mikrograflar, zarif leke çekirdekleri ve retina hücrelerini ifade eden GFP'yi gösterdi.
Fotoreseptör hücreleri tanımlamak için anti visin antikor boyaması yapıldı. Bu protokolde açıklanan parametreler, dört gün sonra toplam popülasyonla karşılaştırıldığında ortalama %22'lik transfect verimlilikleri elde etmek için optimize edilmiştir. Kültürde, bu önlem ortalama %25'e çıkar verimlilik, yalnızca fotoreseptör popülasyonu kabul edildiğinde Bir kez ustalaştıktan sonra kabul edilir.
Embriyo toplamadan elektro operasyona kadar olan bu teknik, uygun şekilde uygulandığı takdirde altı göz için 30 dakikadan daha kısa bir sürede yapılabilmektedir. Bu prosedürü denerken, iyi kalitede bir kültür elde etmek için embriyoların toplanması ile ayrışmış hücre kaplaması arasında üç saatten fazla geçmemesi gerektiğini hatırlamak önemlidir. Bu teknik, örneğin bir RNAi sistemi kullanılarak gen aşırı ekspresyonu veya korelasyonu için uygulanabilir.
Ek olarak, bu işlemi takiben transfekte edilen retinalar organotipik retina kültürleri için kullanılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, fotoreseptör biyolojisi çalışmalarını geliştiren, embriyonik civciv retinal hücre kültürlerinde yüksek verimli gen transferi için yeni bir teknik sunmaktadır. Yöntem, mevcut protokollere kıyasla transfeksiyon oranlarını önemli ölçüde artıran ex ovo plazmid elektroporasyonunu içermektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Genetik Mühendisliği
Arka Plan
- Embriyonik piliç retinal hücre kültürleri, fotoreseptör araştırmaları için önemlidir.
- Gen transfer teknikleri, bu hücrelerdeki fonksiyonel çalışmalar için temel teşkil eder.
- Mevcut yöntemlerin transfeksiyon verimliliği konusunda sınırlamaları vardır.
- Evreleme ve elektroporasyon koşullarının optimize edilmesi sonuçları iyileştirebilir.
Çalışmanın Amacı
- Retinal hücreler için güvenilir bir gen aktarım yöntemi geliştirmek.
- Primer retinal kültürlerde fonksiyonel genetik çalışmalara olanak sağlamak.
- Transfeksiyon verimliliğini mevcut protokollerin üzerine çıkarmak.
Kullanılan Yöntemler
- Hamburger ve Hamilton sisteminin 27. evresindeki tavuk embriyolarının toplanması.
- Embriyonik gözlerin diseksiyonu ve retinal pigment epitelyumunun uzaklaştırılması.
- Retinal kubbenin bir plazmid çözelti haznesine yerleştirilmesi.
- Optimize edilmiş koşullar altında, özel yapım elektrotlar kullanılarak elektroporasyon uygulanması.
Ana Sonuçlar
- Yeni yöntemle yüksek transfeksiyon verimliliği elde edilmiştir.
- Retinal hücrelerin başarılı genetik manipülasyonu gösterilmiştir.
- Elektroporasyon için optimize edilmiş koşullar belirlenmiştir.
- Teknik, retinal biyolojideki çeşitli fonksiyonel çalışmalar için uygulanabilirdir.
Sonuçlar
- Geliştirilen gen transferi tekniği, retinal hücre biyolojisindeki araştırma kapasitesini önemli ölçüde artırmaktadır.
- Bu yöntem, fotoreseptör fonksiyonu üzerine yapılan ileri düzey çalışmaları kolaylaştırabilir.
- Gelecekteki uygulamalar, retinal hastalıklardaki genetik faktörlerin araştırılmasını içerebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önemi
Primer retina kültürlerinde etkili gen transferi, fotoreseptör hedef doğrulamadaki kritik bir darboğazı gidererek hastalıkla ilişkili genlerin fonksiyonel sorgulamasını mümkün kılar. Ex ovo elektroporasyon yöntemi %22-25 transfeksiyon verimliliği sağlayarak, retina terapötiklerinin yüksek kapasiteli taraması için ölçeklenebilir analiz geliştirmeyi destekler. Bu yaklaşım, hastalıkla ilişkili bir sistem içerisinde gen fonksiyonuna dair biyolojik olarak anlamlı bilgiler sağlayarak, öncü adayların belirlenmesindeki öngörü güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Primer fotoreseptör kültürlerinde plazmid kaynaklı aşırı ekspresyon veya RNAi aracılı nakavt yoluyla terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Fotoreseptör popülasyonunun %25'ine kadar ölçülebilir transgen ekspresyonu ile fonksiyonel hedef doğrulaması için tekrarlanabilir bir sistem sağlar.
- Stratejik Değer: Genetik manipülasyonu fenotipik hücre değişiklikleri veya alt akış gen ekspresyonu ile ilişkilendirerek hedef seçimindeki öngörü güvenini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Bileşik tarama kampanyalarında nicel bağımlı değişken ölçümleri için uygun transfeksiyon verimlilikleri sağlar.
- Operasyonel Değer: Birden fazla retinal kup arasında assay tekrarlanabilirliğini sağlamak için standartlaştırılmış elektroporasyon koşulları ve özel yapım elektrotlar kullanır.
- Stratejik Değer: Transfekte edilmiş retinal kültürlerin organotipik veya düşük yoğunluklu primer kültür iş akışlarına entegre edilebilmesi sayesinde platformun yüksek kapasiteli adaptasyon için yeniden kullanımına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: İnsan retinal biyolojisini modelleyen ve hastalıkla ilişkili bir sistemde genetik manipülasyona izin vererek mekanizmaya dayalı risk azaltımını kolaylaştırır.
- Operasyonel Değer: Tutarlı kültür ve disosiyasyon prosedürleri kullanarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar translasyonel sürekliliği sağlar.
- Stratejik Değer: İn vivo çalışmalardan önce gen fonksiyonunun değerlendirilmesine olanak tanıyarak, riske göre ayarlanmış ilerleme kararlarına bilgi sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef doğrulamadan öncü bileşik tanımlamaya kadar olan keşif sürekliliğine entegre edilerek fotoreseptör biyolojisinde hipotez testlerini ve yolakların açıklığa kavuşturulmasını desteklemektedir.
- Keşif Biyolojisi: Birincil retinal kültürlerde hedef genlerin aşırı ekspresyonuna veya susturulmasına olanak tanıyarak hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Standartlaştırılmış plazmid çözelti konsantrasyonu (1.5 µg/µL) ve optimize edilmiş elektroporasyon parametreleri (5 pulse, 15V, 50ms) ile analiz hazırlığı sağlar.
- Analizler: Transfeksiyon verimliliğini farklı koşullar arasında karşılaştırmak için raporlayıcı gen ekspresyonu (örneğin GFP) veya immünohistokimya yoluyla kantitatif okumalar sunar.
- Translasyonel Araştırma: Elektropore edilmiş retinalardan türetilen organotipik retinal kültürlerdeki uygulanabilirliği aracılığıyla preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Aynı plazmid çözeltisi ile altı retinal kupa kadar electropore edilebildiği ve anlamlı bir verimlilik kaybı yaşanmadığı için yeniden kullanılabilir bir kapasite oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Lipofeksiyon veya kimyasal yöntemlere kıyasla beş kat daha yüksek transfeksiyon oranları elde ederek öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Detaylı elektrot yapımı ve %96 etanol ile yakma yöntemi kullanılarak gerçekleştirilen sterilizasyon protokolleri aracılığıyla standartlaştırmayı geliştirir.
- Stratejik Değer: Fonksiyonel çalışmalardaki biyolojik gürültüyü azaltarak sermaye verimliliğini artırır ve daha iyi devam/durdur kararları alınmasını sağlar.
- Portföy Etkisi: Fotoreseptör sağkalımı veya farklılaşmasında gen rolüne ilişkin fonksiyonel veriler sağlayarak riskle uyumlu önceliklendirmeyi destekler.
Uygulama Hususları
- Embriyonik civciv embriyosu evrelemesi (Hamburger ve Hamilton evre 27) ve mikrocerrahi diseksiyon teknikleri konusunda uzmanlık gerektirir.
- Beş kare darbe şeklinde elektroporasyon iletimi için gerekli cihazlandırmayı ve kutu filamanlardan özel U şeklinde elektrotların hazırlanmasını gerektirir.
- Plazmit çözeltisinin hazırlanmasında (PBS tabanlı, 1.5 µg/µL) ve modifiye edilmiş mikrocentrifüj tüpleri kullanılarak hazne kurulumunda ekipler arası standardizasyon gerektirir.
- Downregülasyon çalışmalarına ölçeklendirilirken, farklı plazmit konsantrasyonları veya RNAi konstrüktleri için adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Kültür kalitesini korumak amacıyla embriyo toplama ve hücre ekimi arasında üç saatlik bir pencere gibi pratik kısıtlamaları kapsar.
