Farelerde Yerel Anafilaksi Ölçme

Bu prosedürün genel amacı, vasküler geçirgenlikteki değişiklikleri ölçmek, lokalize alerjik tepkileri ölçmektir. Bu, önce hayvanları O albümin gibi bir alerjene karşı duyarlı hale getirerek gerçekleştirilir. İkinci adım, alerjenin intradermal enjeksiyonu ile kulaklara meydan okumaktır.

Daha sonra Evan'ın mavi boyası kuyruk damarına enjekte edilir. Son adım, boyayı meydan okunan kulaklardan gece boyunca inkübe ederek çıkarmaktır. Formda, kulağa giren boya miktarını ölçmek için nihai olarak bir spektro fotometri olan amid kullanılır.

Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, boya ekstravazasyonunun spektrometri ile ölçülmesidir. Bu, tahlilin kolayca gözlemci yanlılığına maruz kalmadığı anlamına gelir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, intradermal ve kuyruk damar enjeksiyonları teknik olarak zorlayıcı olduğundan ve yeterlilik elde etmek için çok fazla pratik gerektirdiğinden mücadele edeceklerdir.

Kullanım için oda sıcaklığına bir dizi yumurta suyu çözeltisi getirerek başlayın. Oda sıcaklığındayken, ova stoğunu bir XPBS'de mililitre başına bir miligram konsantrasyona seyreltin. Beş mililitrelik polistiren yuvarlak tabanlı bir tüp kullanın.

Tüpü orta hızda girdaplayın ve dikkatlice eşit miktarda iyice homojenize edin. Şapı ova çözeltisine damla damla enjekte edin. Paralel olarak, aynı tekniği kullanarak bire bir oranında PBS'ye karıştırılmış şapın negatif bir kontrol solüsyonunu hazırlayın.

Ardından tüpleri kapatın ve girdaba sabitleyin. Tüpler takılıyken vorteksi yarım saat boyunca en düşük ayarda çalıştırın. Solüsyonlar hazır olduğunda, hemen BAB farelerini hassaslaştırmaya devam edin.

Ova şap karışımını bir mililitrelik şırıngaya yükleyin. Daha sonra 27 gauge iğne ile her farenin peritonuna 100 mikrolitre enjekte edin. Bunu, önümüzdeki üç hafta boyunca ovasız şap çözeltisini kullanan negatif kontrol fareleri için tekrarlayın.

Son enjeksiyondan sonra fare başına toplam üç enjeksiyon için bu işlemi tekrarlayın, donmuş yumurta stokundan lokal anafilaksi testini gerçekleştirmeden önce en az iki hafta bekleyin. PBS'de mililitre başına beş miligram çalışma çözeltisi yapmakla başlayın. % 5 ISO flor kullanarak kısa bir süre vorteksleyin.

Hassaslaştırılmış bir fareyi uyuşturun ve hareketsiz hale geldiğinde, iso florini% 3'e düşürün. Şimdi üç adet 10 insülin şırıngasını 10 mikrolitre yumurta preparatı ile yükleyin ve 31 gauge iğne ile kapatın ve 10 mikrolitre bir XPBS ile ikinci bir şırınga yükleyin. Daha sonra, 15 mililitrelik konik bir tüpü, diseksiyon mikroskobu altında yapışkan tarafı dışarı bakacak şekilde şeffaf yapışkan bantla sarın, anestezi uygulanmış bir farenin sol kulağının sırt tarafını tüpe sabitleyin. PBS şırınga şırıngasının eğimli tarafı yukarı bakacak şekilde kulağın iki yaprağı arasına sokun ve tam 10 mikrolitreyi yavaşça enjekte edin.

Kan damarlarına çarpmaktan kaçının. Başarılı bir enjeksiyon, belirgin bir intradermal bip ile sonuçlanacaktır. Tüm sesi kulağa enjekte etmek çok önemlidir.

Enjeksiyon bölgesinden herhangi bir sıvı sızarsa, hayvan analizde kullanılamaz. Ayrıca, iğne kulaktan tamamen geçerse veya kulağın yüzeyini çizerse, test geçersizdir çünkü bu travmalar sonuçları sağ kulağa karıştıracaktır. Üç dakikalık süre boyunca yumurtayı enjekte etmek için aynı yöntemi kullanın.

Fareyi bir süzgeçe aktarın ve bir ısı lambasının altına yerleştirin. Daha sonra 200 mikrolitre %0,5 Evans mavi boyasını kuyruk damarına yavaşça enjekte edin. 27 gauge iğne kullanarak, tüm boya enjekte edilmeden önce damar tahrip olursa hızlı enjeksiyon zarar verebilir.

Kuyruğun karşı tarafına enjekte etmeye devam edin. Şimdi 10 dakika bekleyin ve ardından fareyi karbondioksit ile ötenazi yapın, ardından servikal çıkık yapın. Hayvana ötenazi yapıldıktan sonra, kulakları çıkarmak için forseps ve makas kullanın.

Enjeksiyon bölgesine baskı yapmadan kulak kenarını forseps ile kavrayın. Daha sonra kulak tabanındaki kıkırdak sırtına yakın kesin, ancak kesmeyin. Mümkün olduğu kadar çok doku toplayın.

Şimdi uygun önlemleri alarak, her kulak için 700 mikrolitre form amid'i bir mikro santrifüj tüpüne boşaltın. Her tüpe bir kulak aktarın ve gece boyunca kuru bir ısı bloğunda 63 santigrat derecede inkübe edin, ertesi gün boyanın çoğu çıkarılacaktır, ancak kulaklar hafif mavi görünebilir. Her numuneden 300 mikrolitreyi iki kez 96 oyuklu bir plakaya ekleyin.

Herhangi bir kürkü aktarmaktan kaçının ve boşluklar için herhangi bir kabarcık oluşturmayın. 300 mikrolitre form amid ile iki kuyu yükleyin. Ardından absorbansı 620 nanometrede ölçün.

Değerleri arka plandan çıkarın ve sonuçları analiz edin. PBS duyarlı hayvanlar, ova meydan okumasına veya PBS meydan okumasına tepki vermedi. Beklendiği gibi, her iki kulak da beyaz kaldı.

OVA'lara duyarlı hayvanlarda PBS tehmasını alan yıl ya tamamen beyaz ya da açık maviydi, boya uygulandıktan sonra 10 dakika boyunca ova meydan okumasını alan kulaklarının giderek koyulaştığı enjeksiyon bölgesine lokalize oldu, PBS'ye duyarlı hayvanların IDE ile tedavi edilen kulak dokusu, hem PBS hem de OVA meydan okumasından sonra ihmal edilebilir absorbans okumalarına sahipti. Ova duyarlı hayvanlar için, PBS enjeksiyonu genellikle 0.13'lük bir ortalama absorbans okuması ile sonuçlanmıştır. Tersine, 50 mikrogramlık bir ova meydan okuması, 0.58'lik bir ortalama absorbans okuması ile sonuçlandı.

Meydan okuma için kullanılan yumurta miktarı limitler dahilinde ayarlanabilir. Örneğin, 20 mikrogramlık bir zorluk, ortalama 0.30'luk bir emilim ile sonuçlandı. Bununla birlikte, 20 mikrogramdan daha az bir zorluk güvenilir sonuçlar vermedi.

Bir kişi intradermal ve intravenöz enjeksiyonlarda yetkin olduğunda zor olsa da, bu teknik bir hayvanda yaklaşık 15 dakika içinde gerçekleştirilebilir. İki kişi birlikte çalışarak, biri kulak enjeksiyonlarını ve diğeri kuyruk damarı enjeksiyonlarını gerçekleştirir. İşlem yaklaşık bir saat içinde 10 hayvan üzerinde gerçekleştirilebilir. Bu test, hem aktif hem de pasif kutanöz anafilaksi için kullanılabildiğinden çok yönlüdür.

Çok çeşitli alerjenler için de kullanılabilir. Flor is'in insan üreme sistemi üzerinde olumsuz etkileri olabileceğini unutmayın. Sadece iyi havalandırılan bir odada kullanın ve hamileyseniz atık gazı nötralize etmek için indüksiyon odasına bağlı bir süpürme kabı bulundurun.

Flor izolatını kullanırken, maruziyeti en aza indirmek için bir karbon filtreli maske takın.