Name: Sitometrisi ile Yüksek Verim kardiyomiyositlerde İnsan pluripotent kök hücrelerin Farklılaşma ve Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: Öğrenin, insan pluripotent kök hücrelerinden kardiyomiyosit üretmek ve sitometri ile karakterize etmek için Wnt yolunu küçük moleküllerle modüle etme yöntemini. Bu protokol yüksek saflıkta hücre kültürleri sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma NIH 4R00HL094708-03 tarafından desteklenen, AİG&#39;nin Araştırma İşler Komitesi Yeni Fakülte Ödülü, ve Wisconsin Medical College (RLG) de Kern vakıf (başlangıç ​​fonları); Hong Kong Tema tabanlı Araştırma Şema T13-706 / 11 (KRB) Araştırma Hibeler Konseyi; U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM DR2A-05394, ve AHA Araştırmacı Ödülü (JCW) Kuruldu; AHA Doktora Sonrası Araştırma Bursu 12POST12050254 (PWB). Biz veri toplama ve yazının dikkatli inceleme ile yardım için Wisconsin Kan Araştırma Enstitüsü Sitometrisi Çekirdeği Umut Campbell teşekkür ederim.

1. Çözüm ve Medya Hazırlık <ol><li> HESC Nitelikli Matrix Kaplama Stok Çözüm <ol><li> Yavaşça bir gece boyunca 4 ° C&#39;de HESC buz üzerinde nitelikli matrisi (5 mi) eritin. 1.5 ml steril, önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpler içine hacimde dağıtın ve hemen -20 ° C&#39;de saklayın. Not: tüm bölenin hacmi çok dayanmaktadır ve tipik haliyle 270-350 ul aralığında değişir. İmalatçı Adım 2.1 &#39;de tarif edildiği gibi 25 ml seyrelmesi üzerine 1x konsantrasyon elde etmek için gerekli olan tüm bölenin hacmi ile ilgili bilgi sağlar. </li></ol></li><li> hPSC Medya Hazır Çözümler <ol><li> Aksi belirtilmedikçe, bir seyreltici olarak ultra saf su kullanın. 0.22 mikron filtre kullanılarak tüm bileşenleri sterilize. 4 ° C&#39;de toplu çözeltiler gibi, aşağıdaki muhafaza edin: sodyum bikarbonat (75 mg / ml); sitrik asit (10 mM, pH = 3). </li><li> 0.2 mikron şırınga filtre kullanarak tüm bileşenleri sterilize ve -20 ° C&#39;de hacimde olarak her saklamak: Rho kinaz (ROCK) inhibitörü Y-27632 (10DPBS mM, 100 ul tümbölen); L-askorbik asit 2-fosfat (64 mg / ml 500 ul tümbölen); sodyum selenit (70 ug / ml, 100 ul tümbölen); transferin (50 mg / ml 107 ul tümbölen); fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2 200 ng / DPBS ul, 250 ul tümbölen); büyüme faktörü beta 1 transforme (soğuk 10 mM sitrik asit içinde TGFβ1, 100 ng / ml, 10 ul tümbölen). </li></ol></li><li> hPSC Medya E8 Çözüm Kompozisyon <ol><li> , L-askorbik asit 2-fosfat (500 ul; nihai; (: 500 ml L-glutamin ve HEPES), sodyum bikarbonat (543 mg / ml 3.62 ml nihai), DMEM / F12: Aşama 1.2 &#39;de elde alikot ile ortam hazırlayın : 64 ug / ml), sodyum selenit (100 ul, nihai 140 ng / ml), transferin (107 ul; nihai: 10.7 ug / ml), insülin (1 mi; son 20 ug / ml), FGF2 (250 ul, nihai 100 ng / ml), TGFβ1 (10 ul, nihai: 2 ng / ml). </li><li> Kadar 2 hafta boyunca 4 ° C&#39;de tüm bileşenleri, filtre sterilize ve mağaza birleştirin. </li></ol></li><li> KAYA inhibitörü ile hPSC Ortam E8 <ol><li> Yukarıda anlatıldığı gibi hazırlanmış E8 ortam, 12 ml, 15 ul ROCK inhibitörü ekleyin ve iyice karıştırın. Nihai konsantrasyon adım 3.7 / ortam hücreleri ilave edildikten sonra 10 uM olduğundan emin olun. </li></ol></li><li> Wnt Modülatörlü stok Çözümleri <ol><li> -20 ° C&#39;de aşağıdaki alikotları saklayın. CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5​-methyl-1 H -imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethy​l]amino]-3-pyridinecarbonitrile; DMSO içinde 10 mM, 15 ul tümbölen). IWR-1 (4-(1,3,3a, 4,7,7a-Heksahidro-1,3-diokso-4,7-metano-2H-izoindol-2-il)-N-8-kinolinil-benzamid; DMSO içinde 10 mM 6 ul tümbölen). </li></ol></li><li> Farklılaşma Medya <ol><li> % 2 B27 eksi insülin takviyesi ile (L-glutamin ile) RPMI 1640 farklılaşma medya # 1 hazırlayın. </li><li> % 2 B27 artı insülin takviyesi ve% 2 FBS ile (L-glutamin ile) RPMI 1640 ortamı ile farklılaşma 2. hazırlayın. </li></ol></li><li> Hücre Yıkama Çözeltisi fveya Hücre Kültürü <ol><li> Kalsiyum ve magnezyum içermeyen Dulbecco fosfat tamponlu salin (DPBS) içinde kullanın. </li></ol></li><li> Akış Sitometrinin Hücre Yıkama Çözeltisi <ol><li> % 1 FBS (kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS) fosfat tamponlu tuzlu su kullanın. 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> Akış Sitometrinin Hücre Bakım Çözüm <ol><li> % 5 FBS (kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS) Hank Dengeli Tuz Çözeltisi kullanın. 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> Akış Sitometrinin için tespit Çözümler <ol><li> TNNI3 ve Irx4 antikorlar için sabitleme çözeltisi olarak Cytofix tampon kullanabilir. </li><li> TNNT2 ve MLC2a antikorlar için sabitleme çözeltisi olarak 1 x PBS içinde% 4 paraformaldehid (taze olun) kullanınız. </li><li> MLC2v antikor için sabitleme çözeltisi olarak% 70 metanol /% 30 aseton kullanılabilir. </li><li> 4 ° C&#39;de tüm çözümleri saklayın. </li></ol></li><li> Akış Sitometrinin için Permeabilizasyon Çözümler <ol><li> Geçirgenleştirme çözeltisi f olarak Phosflow Perm Tampon KULLANILMASIveya TNNI3 ve Irx4 antikorlar yer alır. Oda sıcaklığında (25 ° C) saklayınız. </li><li> TNNT2, MLC2v ve MLC2a antikorlar için özellikle geçirgenleştirme çözeltisi olarak 1 x PBS içinde% 0.2 Triton X-100 kullanarak. 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> Bloklama çözeltisini <ol><li> 1x PBS içinde% 10 keçi serumu kullanın. Taze yapmak ve kullanılıncaya kadar 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li></ol> 2. Plakası Kaplama <ol><li> Yavaşça, 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de HESC kalifiye matris 1 kısım Çözülme soğutulmuş DMEM / F12, 25 ml eklenir ve hemen 6 oyuklu tabaklar önce steril doku kültürü kaputu iyice karıştırın. </li><li> Steril doku kültürü başlık altında 6-çukurlu levha başına 1 ml ilave edilir (HESC kalifiye matrisin 1 kısım kat dört 6-yuvalı plakalar için yeterlidir). </li><li> HESC kalifiye matris başlık altında oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ayarlamak için olanak sağlar. Aşırı HESC nitelikli matrisi aspire ve her iyi ROCK inhibitörü ile E8 medyanın 2 ml ekleyin. Kullanım plakaları hemen varsa veya desIRED, 4 ° C&#39;de saklama hemen sonra en fazla 1 hafta kaplama ve kullanılmadan önce 30 dakika süre ile oda sıcaklığına kadar dengeye C. </li></ol> 3. Pasajlanması ve Tek tabakalı Kültür ayrım hPSCs Bakım <ol><li> 6-yuvalı plakalar içinde tek tabakalı bir kültür olarak muhafaza hPSCs ve steril doku kültürü başlık altında tüm adımları gerçekleştirmek. </li><li> HPSC iyi kurulmuş hatları (&gt; p20) kullanın ve bir sinir, epithelial- veya fibroblast-benzeri morfolojisi olan hücrelerin varlığı olmadan homojen bir morfoloji. Kuyu başına 0,75 x 10 6 tohumlandıklarında hücreleri% 75 izdiham her üç gün sağlam çoğalırlar ve ortalama, geçit üzerinde emin olun. </li><li> Tek hücre düzeyinde ayrışma ile Passage hPSCs en az 5x önce maksimum farklılaşma verimliliği sağlamak için farklılaşma başlatın. Geçit hPSCs için, aspirat E8 ortam ve 1x DPBS (oda sıcaklığına kadar önceden ısıtılmış) 4 ml ile iki kez yıkama hücreleri. Hücre kopmakta 1 ml ekleyinment her bir oyuğa çözeltisi (oda sıcaklığına kadar önceden ısıtılmış) ve hücre sınırları boyunca-up başlayana kadar, 3-7 dakika için de rahatsız bırakın. </li><li> Hücreleri çıkarmak ve DMEM / F12 ortam 1 ml içeren 15 ml&#39;lik konik bir tüp içine transfer etmek için bir ampul ile pamuk takılı cam pipet kullanın (ki bu hücre ayırma çözeltisi inaktive etmek için). </li><li> Hücre çözeltisi, 10 ul bir kısım çıkarın ve bir mikrosantrifüj tüpü içinde, tripan mavisi 10 ul ile karıştırılır. Hücrelerin geri kalanı, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 130 x g&#39;de santrifüj ile toplanır sırasında hücreler (örneğin, otomatik ya da elle hemositometre) sayılır. Bu protokolü kullanarak,% 70-80 canlılığı otomatik Hemasitometre kullanarak ve toplam hücre sayımı baz tüm cep numaraları, ileriye bekliyoruz. </li><li> Ortam aspire 500 ul, 0.75 x 10 6 hücre nihai bir konsantrasyona kadar DMEM / F12 hücre pelletini ve. </li><li> 6 oyuklu plakanın her bir oyuğuna, hücre süspansiyonu 500 ul her bir göze burada contaiROCK inhibitörü ile ns 2 ml E8 medya, adım 2.3 hazırladı. Tezgahı üzerinde plaka bırakarak, yavaşça arasında genel bir önden arkaya ve yandan yana bir hareket homojen bir şekilde dağılmalıdır hücre hareket eder. % 5 CO 2, 37 ° C&#39;ye kadar inkübatör hücreleri dönün. </li><li> Pasajlayarak 24 saat sonra başlayan, günlük ROCK inhibitörü olmadan 2 ml / da E8 kullanarak ortamı değiştirin. Farklılaşma başlatmak için önce% 100 izdiham ulaşmak için ekim yoğunluğunu optimize eder. 0.75 x 10 6 hücre Tohum / de dört gün farklılaşma başlar, ama gerektiğinde her hücre hattı için optimize önce. </li></ol> Wnt yola¤ Seçici Modülasyon tarafından hPSCs 4. kardiyomiyosit İndüksiyon <ol><li> Gün 0-7 süresince günlük (2 ml / da) medya Refresh, ve 8. günde sonra her gün. </li><li> Gün 0, farklılaşma medya # 1 ile E8 medya değiştirerek farklılaşma süreci başlar. Her iyi 1.2 ul CHIR (6 mcM final) ekleyin. 1. günde tekrarlayın. </li><li> Günlerde 2-3, taze ayırıcı ile değiştirinbarındırdığı medya # 1. </li><li> 4. günde, taze farklılaşma medya # 1 ile değiştirin. Her bir oyuğa, 1 ul IWR-1 (nihai 5 uM) eklenir. Günde 5 tekrarlayın. </li><li> Günlerde 6-7, taze farklılaşma medya # 1 ile değiştirin. </li><li> 8. günde, taze ortam farklılaşma # 2 ile değiştirin. </li><li> Farklılaşma medya # 2 kültürünün arzu edilen süre boyunca her gün değiştirin devam edin. </li><li> İstenirse, 3,3-3,6 özetlenen adımları izleyerek, ama farklılaşma medya # 2 ile medyayı ikame hücre dekolmanı çözüm kullanarak geçit kardiyomiyositler. Pasajlayarak sırasında, ~ 3-10 hücrelerin küçük kümeler halinde kardiyomiyositlerin ayırmak. Iyi kullanarak HESC nitelikli matris kaplı çukurlara ve farklılaşma medya # 2 başına ~ 6 x 10 5 hücre Tohum. </li></ol> Akış Sitometrinin için Hücrelerin 5. Koleksiyonu <ol><li> Laboratuar tezgahının (steril değildir) 5-9 adımları kalan tüm yönlerini gerçekleştirir. </li><li> Aspire büyüme ortamı ve 1x PBS ile iki kez hücreleri yıkayın.Hücre sınırları boyunca-up başlayana kadar (oda sıcaklığına kadar önceden ısıtılmış), her bir hücre ayırma çözeltisi 1 ml de ilave edin ve 3-7 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın. Hücreleri çıkarmak ve buz üzerinde bir 15 ml konik tüp içine aktarmak için ampul ile bir pamuk takılı borosilikat cam atılabilir 9 &quot;pipet kullanın. </li><li> Protokol kalanı boyunca buz üzerinde hücreleri korumak ve 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrüfüj yapar. </li><li> Santrifüj ve aspirasyon çözeltisi hücreler toplanır. Hücre kümeleri sağlamak için tekrar tekrar toz haline getirilir ve 10 ml&#39;lik bir pipet kullanılarak serolojik 10 ml hücre yıkama çözeltisi içinde süspanse hücreler tek hücreler içine dağıtılır. Hücreler santrifüjleme ile toplanmış geri kalan ise adım 3.5 olarak hücre sayımı. </li><li> Hücre yıkama çözeltisi özen göstererek yeniden süspanse hücreler tamamen hücre pelet ve kısım yuvarlak dipli tüp başına 1 x 10 6 hücre parçalamak için. Santrifüj ve aspirasyon çözeltisi hücreler toplanır. </li></ol> 6. Tespit veHücre içi antijen boyanması için Hücrelerin geçirgenliği <ol><li> Hücre pelletine 100 ul sabitleme çözeltisi ekleyin. Çözeltisi damla damla sürekli Yumuşak bir girdaplamadan ile ve daha sonra 15 dakika boyunca buz üzerinde bekletilir ekleyin. </li><li> 3 ml hücre yıkama solüsyonu ekleyin. Santrifüj ve aspirasyon çözeltisi hücreler toplanır. </li><li> Hücre pelletine 100 ul permeabilizasyon solüsyonu ekleyin. Çözeltisi damla damla, daha sonra 30 dakika boyunca buz üzerinde bekletilir sürekli Yumuşak bir girdaplamadan ile ekleyin. Tablo 1 &#39;de her bir antikor için belirtildiği gibi tespit ve geçirgenliği arttıran koşullar kullanın. </li><li> 3 ml hücre yıkama solüsyonu ekleyin. Santrifüj ve aspirasyon çözeltisi hücreler toplanır. Geçirgenleştirmeden sonra iki yıkama arasında bir toplam için tekrarlayın. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Birincil antikoru (klon) </td><td rowspan="2"> İmmunogen / Epitop Tanınan </td><td rowspan="2"> Kontrol Istotype </td><td colspan= &quot;2&quot;&gt; 100 ul içinde 1 x 10 6 hücre başına birincil antikor miktarı </td><td rowspan="2"> Sabitleme Çözüm </td><td rowspan="2"> Geçirgenliği arttıran çözeltiyi </td><td rowspan="2"> İkincil antikor </td><td rowspan="2"> 100 ul ikincil antikor miktarı / 1 x 10 6 hücre </td></tr><tr><td> Pozitif yüzde ölçümleri için </td><td> Antijen kantitasyonu için </td></tr><tr><td> TNNI3 (284 (19C7) </td><td> ISASRKLQL (insan) </td><td> Fare IgG2b </td><td> 1,0 mikrogram </td><td> 3.0 ug </td><td> BD Cytofix </td><td> BD Phosflow perma III </td><td> Keçi anti-fare IgG2b-Alexa488 </td><td> 600 ng </td></tr><tr><td> TNNT2 (1C11) </td><td> Tam boy saflaştırılmış doğal insan troponin T proteini. </td><td> Fare IgG1 </td><td> 1,0 mikrogram </td><td> 2.0 ug </td><td> % 4 PFA% 1 PBS </td><td> % 1 PBS içinde% 0.2 Triton X-100 </td><td> Keçi anti-fare IgG1 - Alexa 488 </td><td> 600 ng </td></tr><tr><td> MLC2v (330G5) </td><td> FDPEGKG </td><td> Fare IgG2a </td><td> 2.0 ug </td><td> 3.0 ug </td><td> % 70 metanol /% 30 aseton </td><td> % 1 PBS içinde% 0.2 Triton X-100 </td><td> Keçi anti-fare IgG2a - Alexa 647 </td><td> 600 ng </td></tr><tr><td> MLC2a (4E7) </td><td> E. üretilmiş, insana ait MYL7 tam uzunlukta insan yeniden birleştirici proteinin coli </td><td> Fare IgG1 </td><td> 0.5 ug </td><td> 3.0 ug </td><td> % 1 PBS içinde% 4 PFA </td><td> % 1 PBS içinde% 0.2 Triton X-100 </td><td> Keçi anti-fare IgG1 - Alexa 488 </td><td> 600 ng </td></tr><tr><td> Irx4 </td><td> LQEHRKNP YPTKGEKI MLAIITKM TLTQVST </td><td> Tavşan IgG </td><td> 0.5 ug </td><td> 0.5 ug </td><td> BD Cytofix </td><td> BD Phosflow perma III </td><td> Keçi anti-raIgG PE BBIT </td><td> 600 ng </td></tr></tbody></table> Her birincil ve ikincil antikor için optimize konsantrasyonları ve fiksasyon ve permeabilizasyon koşulları akışı için kullanılan (monoklonal varsa) Table 1. Antikor konsantrasyonlar. Listelenen birincil antikor olan, klon sitometri analizleri. Antikor stok konsantrasyonları aynı klonun sağlayıcıları arasında değişebilir olarak, son sabit bir tahlil hacmi içinde 1 x 10 6 hücre başına her antikor konsantrasyonu, seyreltme yerine sağlanmıştır. İmmünojen, antikorun üretilmesi için kullanılan, ya da imalatçı tarafından temin edildiği gibi epitop, antikor tarafından tanınan, listede ancak deneysel burada doğrulanmadı. 7. Antikor Boyama <ol><li> Her deney için, bir sabitleme / permeabilizasyon durumuna göre kontrol ve boyanmamış kullanılan her bir primer antikor için uygun izotip kontrolü içerir. (Negatif kontroller gibi non-kardiyomyosit hücre türlerini içerirörneğin, pluripotent kök hücreleri ya da fibroblastları). Primer antikor tekabül eden aynı konsantrasyonda izotip kontrolleri kullanarak (Tablo 1 e bakınız). </li><li> Hücreleri parçalamak için P200 pipet kullanarak çözümü engelleme 100 ul süspanse hücreler. Hafif sallama ile 25 dakika boyunca buz üzerinde bekletilir örnekleri. </li><li> Engelleme çözümü çıkarmadan,. Birincil antikor veya Tablo 1&#39;de kurallarımıza göre izotop kontrolü eklemek hafif hafif sallanarak buz üzerinde 45 dakika inkübe edin. </li><li> 3 ml hücre yıkama solüsyonu ekleyin. Santrifüj ve aspirasyon çözeltisi hücreler toplanır. Primer Antikor etiketleme işleminden sonra, iki yıkama toplam tekrarlayın. </li><li> Bir florofor ile konjüge edilmiş birincil antikor kullanıldığında, 8.1 &#39;e geçin. Bir konjüge edilmemiş birincil antikor (örneğin, burada tarif edilen tüm belirteçleri için olduğu gibi) kullanıldığında, aşağıdaki gibi bir florofor konjuge edilmiş ikincil antikor ile etiketlenmesi. </li><li> DISA bir P200 pipet kullanarak çözümü engelleme 100 ul süspanse hücrelerggregate hücreleri. </li><li> . Tablo 1&#39;de ilkelerine uygun olarak, ikincil antikor ekleyin hafif sallama ile buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. </li><li> 3 ml hücre yıkama solüsyonu ekleyin. Santrifüj ve aspirasyon çözeltisi hücreler toplanır. İkincil antikor etiketleme sonra iki yıkama arasında bir toplam için tekrarlayın. </li></ol> Akış Sitometrinin için Hücrelerin 8. hazırlanması <ol><li> Hücreleri parçalamak için P1000 pipet kullanarak 400 ul hücre bakım çözeltisi içinde süspanse hücreler. </li><li> 50 ul hücre bakım çözeltisi ile ön-ıslatma ile bir yuvarlak tabanlı tüp üzerindeki bir hücre süzgecinden kapağı hazırlayın. Buz üzerinde tüp ayarlayın. Sitometresi akışını tıkamasını hücre agrega önlemek için hücre süzgecinden kapağı kullanın. </li><li> Süzgeç kapağı hücre ve hücre süspansiyon yerçekimi boşalmasını sağlamak için hücre çözümü aktarın. Hücreler tüp içine toplandı ve mümkün olduğunca hızlı bir şekilde tekrar buz üzerinde bekletilir, böylece gerekli tezgah üstüne hafifçe tüpün alt dokunun. 250 ul hücre bakım böylece ile durulayın süzgeçdökülmesinden hücrelerinin maksimal iyileşme sağlamak için. </li><li> Hücreleri buz üzerinde muhafaza etmek ve akış sitometrisi ile analiz edilene kadar ışıktan koruyunuz. </li></ol> 9. Sitometrisi Analizi Ayrıntılı kazanım ayarlarını araçların arasında değişmektedir. Optimal veri toplama dikkate temel parametreler aşağıda açıklanmıştır. <ol><li> Optimal akışı istikrar için, meme boyutu, hücrenin çapı analiz edilen 5-6x aşmasını sağlamak. NOT: Bu aletler arasında değişir ama analizörleri ve hücre sıralama için uygun meme boyutunu seçerek hem önemli bir husustur olabilir. Gün 10 kardiyomiyositlerin ortalama çapı (8-14 mikron arasında değişen) 11 mikron olduğu; Bu şekilde, bir analiz standart bir 150 um numune enjeksiyon borusu iyi çalışır. </li><li> Hemen önce veri analizi için, kısa bir süre için her bir tüp vorteks hücre agregatlarının dağıtılması. </li><li> Ileri Optimize ve her hücre tipi için yan dağılım gerilim ayarları dayalıilgilenilen popülasyonları ölçektedir ve (Şekil 2A) merkez şekilde Deneyde kullanılan her bir sabitleme / permeabilizasyon durumu için boyanmadan kontrolü. <ol><li> Anlamlı kaymalar sitometresiyle akış veya numune hazırlama ile olası sorunlara işaret edebilir gibi, tek bir deney boyunca bu ayarları korumak ve aynı cihaz üzerinde deney yapmak deneyden tutarlı olması. </li></ol></li><li> Her fluorofor için izotip kontrolü analiz etmek ve tepe sol ve sağ kenarları görüntüleyen bir fluoresans histogramının elde etmek için gerekli en düşük yoğunluğunu belirlemek için uygun bir lazer gerilimini ayarlamak. Antikor lekeli örnekleri gelen verileri satın alırken her bir izotop kontrol için lazer ayarları koruyun. NOT: Sinyal sık sık kayması aynı cihazda zamanla oluşur. Bu uygun bir izotip kontrolü ile ilgili olarak, her bir deneyin başlangıcında lazer ayarları için çok önemlidir. </li><li> En az toplayın10.000 olaylar. 50.000 olaylar tercih edilir. </li><li> İstatistiksel analizler için, kapı canlı hücre popülasyonu enkaz (Şekil 2A) dışlamak için. Şekil 2B&#39;de, C&#39;de gösterildiği gibi, ikinci bir izotip kontrolü ≤2% katkı sağlar işaretleyici yerleşimine göre kapı nüfus içinde yüzde pozitif hücrelerin belirlenmesi. </li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Farklılaşma protokolün başarısına için kritik farklılaşma başlamadan önce en az beş geçişler için tek hücre düzeyinde pasajlanmışlardır edilmiştir hPSCs kaliteli kültürlerinin kullanılmasıdır. Bunlar hücre hattı bağımsız farklılaşma başlangıcında% 100 konfluent, eğer benzer farklılaşma verimleri bilinen muhtelif hPSC hatlar arasında görülmektedir. Farklılaşma başlangıcında hücre kaynaşması ≤95 veya%&gt;% 100 ise, optimumun altında verimliliği görülmektedir. Bu yüzden, tohum yoğunluğu ve pasaj zamanlaması farklılaşma baş...

HESC ve hiPSC dahil hPSCs, ikinci kardiyomiyositlerde oluşmasından mekanik çalışmalar için başka şekilde erişilemez aşamalarında fikir veren çok erken insan kardiak gelişimsel süreçlerinin bir in vitro model olarak işlev görebilir. Bu model sistem kalp soy bağlılığı ve hücre kaderinin şartname kontrol moleküler yolları incelemek için eşsiz fırsatlar sunmaktadır. Son yıllarda, etkili hPSCs ikinci cardiomyogenic hücreleri üretmek için yeteneği büyük ölçüde 1-15 iyileşmiştir. Bununla birlikte, protokolleri arasında hücreler oda özgü belirteçleri (örneğin, ventrikül ve kulakçıklar) ifade eden hücreler de cardiomyogenic ve zamanlama üreten verimliliğine göre hücre çizgisi farklılıklar vardır. İdeal olarak, bu model sisteminin gelecek uygulamalar için, fonksiyonel olarak tanımlanmış hücrelerin daha homojen popülasyonları arzu edilir. Önceki yöntemlerin tersine, kardiyomiyosit farklılaşma protokolü ce gerektirmez, burada açıklananII toplanmasını ya da sağlam bir aktivin veya Kemik morfogenetik protein 4 (BMP4) ve ekleme gün TNNI3, TNNT2, Irx4, MLC2v ve MLC2a için kültürlerinden pozitif bugüne kadar test edilen bütün HESC ve hiPSC hatları üzerinden 10 hücreleri oluşturur. Bu strateji, özellikle üç boyutlu kültürler, kitle kültürü veya vücut embriyoit bazlı stratejilerin 4-9 ile karşılaştırıldığında, uygulamaya teknik olarak basittir ve son hPSCs seçici toksisite ile küçük bir molekülü tarif etmektedir bir çalışmada (Boheler ve ark tanımlandı. ) 65. Bu protokolün özellikleri, küçük molekülleri kullanarak tam olarak tanımlanmış bir ortam (fakat farklı 1,2,7,13, benzer bir şekilde,), Wnt sinyal modüle etmek üzere bir yetkili HESC matrisi (Matrigel) oluşan tek bir tabaka kullanılarak tek katmanlı kültürü içinde hPSCs farklılaşmasını içermektedir ve farklılaşma verimlilik ve hücre kimliğinin değerlendirilmesi için boyama yöntemleri sitometri optimize edilmiş akış. Önceki raporlar maliyet-etkiliğin dahil Özetle, bu protokolün avantajları karşılaştırıldıeness, tekrarlanabilirlik ve HESC ve hiPSC hatları dahil olmak üzere birden hPSC hatları arasında yer kardiyomiyositlerin üretmek için yüksek verimlilik. Flow sitometri kültür hücrelerin kalitesini değerlendirmek ve subpopülasyonu homojenlik belirlenmesi için güçlü bir analitik araçtır, ve uygun deneysel tasarım, kantitatif ölçümler sağlayabilir. Tüm antikor bazlı stratejiler gibi, deneysel sonuçların doğru yorumlanması alt-optimal koşulları belirgin antikor verimini etkileyen gibi antikor konsantrasyonunun ve tespit ve permeabilizasyon koşulları (hücre içi antijenler hedefleme dahil) tahlil tasarım unsurları dikkatle her antikor için test gerektirir , sonuçların yorumlanması bağlanması ve bu nedenle. Niceleme gerekli ise, poliklonal antikorlar, çok epitopu tanıyan ve partiden partiye değişkenlik eğilimli gibi Önemli olarak, monoklonal antikorlar, gereklidir. Şu anda, çeşitli antikorlar, (POlyclonal ve monoklonal) ve boyama protokolleri zor protokoller arasında 1,2,9,11 cardiomyogenesis verimliliğini karşılaştırmak çok in vitro farklılaşma değerlendirilmesi için tarif edilmiştir. Tüm akış sitometresi analizleri için kullanılabilir Bu nedenle monoklonal antikorlar kullanılır. İleriye, daha iyi farklılaşma stratejileri arasında karşılaştırma izin vermelidir, özellikle kantitatif getirmedi, bu boyama protokollerin standartlaştırılması bekleniyor. In vitro olarak cardiomyogenesis saflığını değerlendirmek için kullanılan belirteçler seçimi ve bunlara karşılık gelen antikorlar, raporlar arasında değişir. TNNT2 cardiomyogenic kaderine işlenen hücrelerin bir göstergesi olarak kabul edilmiş ve rutin olarak kalp farklılaşma protokolleri etkinliğini değerlendirmek için kullanılır. Bununla birlikte, aynı zamanda, erken TNNT2 piliç ve sıçan gelişim 16,17 sırasında iskelet kası olarak ifade edilir ve insan düz kas 18 içinde mevcut olmaktadır </sup&gt;. Böylece, TNNT2 zorunlu in vitro olarak insan cardiomyogenesis özel bir molekül değildir. MLC2v ve MLC2a rutin olarak, sırasıyla, ventriküler ve atriyal alt tiplerinin temsili gösterge olarak kullanılır. Bununla birlikte in vitro farklılaşma bağlamında kardiyomiyosit alt-tipini belirlemek ve MLC2v MLC2a güvenerek zorluklar bu gen ürünleri, yetişkin yoluyla kalp tüp, kalp gelişimi boyunca belirli bir bölmeye sınırlı olmayabilir gerçeğinden kaynaklanmaktadır. Kemirgen kalp döngüye yılında MLC2a mRNA atriyal / içeakımın alanda baskın ve MLC2v mRNA ventrikül / çıkış yolu bölgelerde yaygındır. Ilmekli kalbinde, MLC2a ve MLC2v mRNA&#39;larının birlikte ifadesi giriş yolu, atriyoventriküler kanal ve çıkış yoluna 19,20 görülmektedir. Doğumdan sonra 3 gün boyunca, MLC2v mRNA ventriküle sınırlıdır ve doğumdan sonra 10 gün, MLC2a neonatal sıçan kalbinde kulakçıklar 19 ile sınırlandırılmıştır. Bu nedenle, yorumlamacardiomyogenesis etkinlik ve alt-tipi kimlik sadece referans markeri seviyelerinin varlığını ve miktarını dikkate gerekir, ancak incelendiğinde farklılaşma edilen zaman noktalarından karşılık gelişimsel aşama (lar) dikkate almalıdır ilişkin verilerin. Bu hPSCs in vitro farklılaşma tarafından üretilen cardiomyogenic hücrelerin olgunlaşma aşaması en yakın, embriyonik / fetal gelişim 21-25 benzer olanlar göz önüne alındığında özellikle önemlidir. Bu nedenle, doğum sonrası kalp bir işaretin mekansal ifade dayanarak, en azından bazı durumlarda hPSC türetilen hücrelerin değerlendirilmesi için uygun olmayabilir. In vitro kardiyomyosit kimliklerini tanımlamak için daha spesifik kriterler geliştirilmesini kolaylaştırmak için bir çaba, TNNI3 o civciv ve Zebra balığı 15,20 embriyogenezis boyunca kalp kasının sınırlı olarak in vitro cardiomyogenesis değerlendirmek için değerli bir belirteç olarak kabul edilirve insan fetusu iskelet kası 26 yoktur. TNNI1 insan cenin kalbi mevcut iken, TNNI3 normal yetişkin kalp 27,28 tek TNNI izoformu mevcuttur. Kardiyomyosit alt tip kimliğine ilişkin, Irx4 29-31 ventriküler kaderi ile hücrelerin bilgilendirici bir belirtecidir. Protein düzeyinde, Irx4 son fare 32, neonatal aşamalardan doğrusal kalp tüpten ventriküle sınırlı olduğu gösterilmiştir. Bu duruma göre, akış sitometrisi ile analiz TNNI3 ve Irx4 için optimize boyama protokolleri açıklanmıştır. Bildiğimiz kadarıyla, bu akış sitometrisi ile etkin bir biçimde antikor bazlı boyama ve insan kardiyomiyositlerde Irx4 seviyesini ölçmek için bir yöntem, ilk tanımlamasıdır.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Cell Culture</td></tr><tr><td>BD Matrigel, hESC nitelikli matris</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Accutase hücre dekolmanı çözümü</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS), kalsiyum yok, magnezyum yok</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO, Hybri-Max, steril filtreli)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>53817</td><td></td></tr><tr><td>Sitrik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2404-100G</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dihidroklorür seçici p160ROCK inhibitörü</td><td>R& D Systems</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>L-Askorbik asit-2-fosfat seskimagnezyum tuzu hidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum selenit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261-10G</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin (Optiferrin &ndash; Tanımlı, Hayvansız, Rekombinant İnsan)</td><td>Invitria</td><td>777TRF029</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2)</td><td>R& D Systems</td><td>4144-TC-01M</td><td></td></tr><tr><td>Dönüştürücü büyüme faktörü beta 1 (TGF ve beta; 1)</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12, L-Glutamin ve 15 mM HEPES</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>ile 11330-032</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021 HCl</td><td>Sellekchem</td><td>S2924</td><td></td></tr><tr><td>IWR-1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I0161</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, L-Glutamin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>ile 11875-093</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Takviyesi Eksi İnsülin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Takviyesi (İnsülinli)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>Akış Sitometrisi Reaktifleri</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (10x)</td><td>Quality Biological Inc.</td><td>119-069-151</td><td></td></tr><tr><td>Hank'in Ca2+ ve Mg2+Life Technologies içermeyen dengeli tuz çözeltisi</td><td></td> <td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix</td><td>BD Biosciences</td><td>554655</td><td></td></tr><tr><td>BD Fosflow perma tamponu III</td><td>BD Biosciences</td><td>558050</td><td></td></tr><tr><td>%16 Paraformaldehit</td><td>Thermo Scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>179957-4L</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Mallenckrodt Kimyasalları&nbsp;</td><td>2440-16</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>M236-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Keçi serumu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi çözeltisi, %0.4Yaşam</td> <td>Teknolojileri</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materials</strong</td></tr><tr><td>>5 ml Yuvarlak tabanlı polistiren tüp (kapaksız)</td><td>Corning</td><td>352008</td><td>Hazırlanması için akış sitometrisi için hücreler</td></tr><tr><td>5 ml Yuvarlak tabanlı polistiren tüp (35 & M hücre süzgeci geçmeli kapak)</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>Akış sitometrisi için hücrelerin hazırlanması için</td></tr><tr><td>2 ml kauçuk ampuller</td><td>Fischer Scientific</td><td>03-448-24</td><td></td></tr><tr><td>9" borosilikat fişe takılmamış cam Pasteur pipetleri</td><td>BioExpress</td><td>P-2904-2</td><td></td></tr><tr><td>0,65 ml Mikrosantrifüj tüpleri, dereceli, yeşil</td><td>GeneMate</td><td>C-3259-G</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Mikrosantrifüj tüpleri, dereceli, kırmızı</td><td>GeneMate</td><td>C-3260-R</td><td></td></tr><tr><td>TC20 otomatik hücre sayacı</td><td>BioRad</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>TC20 için sayma slaytları</td><td>BioRad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu Düz tabanlı doku kültürü ile muamele edilmiş plaka</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Şırıngalar</td><td>BD Plastipak</td><td>300613</td><td>Alikotların</td></tr> <tr><td>filtre sterilizasyonu içinSteril şırınga filtreleri, 0.2 & m polietersülfon</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>Alikotların filtre sterilizasyonu için</td></tr><tr><td>250 ml Filtre sistemi, 0.22 &mikro; m polietersülfon, sterilizasyon, düşük bağlayıcı</td><td>Corning</td><td>431096</td><td>Dökme ortamların filtre sterilizasyonu için&nbsp;</td></tr><tr><td>500 ml filtre sistemi, 0.22 & m polietersülfon, sterilizasyon, düşük bağlayıcı</td><td></td><td>Dökme ortamın</td><td></td></tr><tr> filtre sterilizasyonu için Corning 431097<td colspan="4">Antikorlar ve İzotip Kontrolleri</td></tr><tr><td>Anti-TNNI3 (klon: 284 (19C7))Abcam</td><td></td> <td>ab19615</td><td>Primer antikor</td></tr><tr><td>Anti-TNNT2 (klon: 1C11)</td><td>Thermo Scientific</td><td>MA1-16687</td><td>Primer antikor</td></tr><tr><td>Anti-MYL2 (MLC2v, klon: 330G5)</td><td>Sinaptik Sistemler</td><td>310111</td><td>Primer antikor</td></tr><tr><td>Anti-MYL7 (MLC2a, klon: 4E7)</td><td>Abcam</td><td>AB131661</td><td>Primer antikor</td></tr><tr><td>Anti-IRX4&nbsp; &nbsp;</td><td>Bioss</td><td>BS-9464R</td><td>Birincil antikor</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Keçi anti-fare IgG1&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A21121</td><td>İkincil antikor</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Keçi anti-fare IgG2a</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A21241</td><td>İkincil antikor</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Keçi anti-fare IgG2b</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A21141</td><td>İkincil antikor</td></tr><tr><td>Fikoeritrin (PE) Keçi anti-tavşan IgG R</td><td>& D Sistemleri</td><td>F0110</td><td>İkincil antikor</td></tr><tr><td>Fare IgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>557273</td><td>İzotip Kontrol</td></tr><tr><td>Faresi IgG2a</td><td>eBiosciences</td><td>16-4724-81</td><td>İzotip</td></tr><tr><td>Kontrolü Tavşan IgG-PE</td><td>R& D Systems</td><td>IC105P</td><td>İzotip Kontrolü</td></tr><tr><td colspan="4">< >ACTB Yaşam Teknolojileri için TaqMan Probları</td></tr> <tr><td></td><td></td><td>Hs01060665</td><td></td></tr><tr><td>Brachyury T</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Hs00610080</td><td></td></tr><tr><td>CASQ2</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Hs00154286</td><td></td></tr><tr><td>IRX4</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Hs01100809</td><td></td></tr><tr><td>ISL1</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Hs00158126</td><td></td></tr><tr><td>MESP1</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Hs01001283</td><td></td></tr><tr><td>MYH11 (SMMHC)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Hs00224610</td><td></td></tr><tr><td>MYH6</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Hs01101425</td><td></td></tr><tr><td>MYL2 (MLC2v)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Hs00166405</td><td></td></tr><tr><td>MYL7 (MLC2a)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>HS01085598</td><td></td></tr><tr><td>MYOG</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>HS01072232</td><td></td></tr><tr><td>NKX2.5</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>HS00231763</td><td></td></tr><tr><td>NPPA</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>HS01081097</td><td></td></tr><tr><td>POU5F1</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>HS04260367</td><td></td></tr><tr><td>SOX17</td><td>Yaşam</td><td>Teknolojileri HS00751752</td><td></td></tr><tr><td>TNNI1</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>HS00913333</td><td></td></tr><tr><td>TNNI2</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>HS00268536</td><td></td></tr><tr><td>TNNI3</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>HS00165957</td><td></td></tr><tr><td>TNNT2</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>HS00165960</td><td></td></tr></tbody></table>

sitometrisi ile yüksek verim kardiyomiyositlerde İnsan pluripotent kök hücrelerin farklılaşma ve karakterizasyonu

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

, Hasarlı kalp tamir kalp üzerinde toksik etkileri yoktur yeni tedavi ilaçlar keşfetmek ve doğru kalp hastalığı modellemek için stratejiler geliştirmek için yaklaşımlar geliştirmek için acil bir ihtiyaç vardır. Bu uygulamalar için &quot;bir tabak içinde&quot; kalp kası oluşturmak amacıyla insan uyarılmış pluripotent kök hücre (hiPSC) teknolojisini istismar potansiyeli yüksek coşku oluşturmak için devam ediyor. Son yıllarda, verimli insan pluripotent kök hücreleri (hPSCs) den cardiomyogenic hücreleri üretmek için yeteneği büyük ölçüde aksi erişilebilir değil, insan kardiyak gelişiminin çok erken aşamalarında modellemek için bize yeni fırsatlar sunan geliştirdi. Birçok önceki yöntemlerin tersine, kardiyomiyosit farklılaşma protokolü hücresi toplanmasını ya da A ya da aktivin BMP4 eklenmesini gerektirmeyen, burada açıklanan ve güçlü bir kardiyak troponin için yüksek seviyede pozitif olan hücre kültürleri üretir I ve T (TNNI3, TNNT2), iroquois- sınıf Homeodomain proteiniIRX-4 (Irx4), miyozin düzenleyici hafif zincir 2, ventriküler / kalp kası izoformu (MLC2v) ve miyozin düzenleyici hafif zincir 2, tüm insan embriyonik kök hücre (HESC) ve hiPSC hatları üzerinden 10 günde atriyal izoformu (MLC2a) için test tarihi. Hücreler geçirildi ve kültür içinde en fazla 90 gün muhafaza edilebilir. Strateji teknik uygulamak için basit ve maliyet-etkin. Pluripotent hücreler türetilen kardiyomiyositlerin karakterizasyonu genellikle mRNA ve protein seviyesinde, her ikisi de referans işaretlerinin analizini içermektedir. Protein analizi için, akış sitometrisi, kültürdeki hücre kalitesinin ve alt popülasyonu homojenliğinin saptanması için güçlü bir analitik araç olduğunu. Ancak, numune hazırlama teknik varyasyon anlamlı veri akış sitometri kalitesini etkileyebilir. Böylece, boyama protokolleri standardizasyon çeşitli farklılaşma stratejileri arasında karşılaştırmalar kolaylaştırmalıdır. Bu duruma göre, Irx4, MLC2v, MLC2a, TNNI3 ve TNN analizi için boyama protokolleri optimizeAkış sitometri T2 açıklanmıştır.

0. günde, hücreler, kompakt morfolojisi ve hücre döküntüleri en az% 100 birleşik bulunmaktadır. Günlerde 1-2, anlamlı hücre ölümünü (% 40-50) gözlemlemek için ortak, ancak ekli hücreleri kompakt morfoloji (Şekil 1A) muhafaza edecektir. Bu süre boyunca, medya portakal ve bulanıktır. Pembe ortam aşırı hücre ölümünü göstermektedir ve bu durumda, tripan mavisi ile teyit Hücre ölümü ve% 70 aşarsa bırakmaktadır. Hücreler gün 3-4 esnasında kurtarmak ve yoğunluk artacak. 5-6 gün boyunca, en az sayıda hücre ölüm...

Makale verimli seçici referans belirteçlerinin analizi nüfusun homojenliği ve kimliğini değerlendirmek için flow sitometri ile takip Wnt yolu, modüle göre kardiyomiyositlere insan pluripotent kök hücreleri ayırt etmek için ayrıntılı yöntem anlatılmaktadır.

Sitometrisi ile Yüksek Verim kardiyomiyositlerde İnsan pluripotent kök hücrelerin Farklılaşma ve Karakterizasyonu

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Bu prosedürün genel amacı, pluripotent kök hücrelerden yüksek kaliteli kardiyomiyosit kültürleri oluşturmak ve akış sitometrisi kullanarak son ürünü uygun şekilde karakterize etmektir. Bunu başarmak için, farklılaşmamış pluripotent kök hücrelerin yüksek kaliteli tek tabakalı kültürleri üretilir. Kardiyo miyogenez daha sonra küçük moleküller kullanılarak rüzgar yolunun modüle edilmesiyle indüklenir.Daha sonra, kardiyomiyositler, her bir antikor için özel olarak optimize edilmiş koşullar kullanılarak sabitlenir, nüfuz edilir ve boyanır. Son olarak, hücreler akış sitometrisi ile analiz edilir. Sonuç olarak, kardiyak belirteçler, TNNI üç ve IRX dört için oldukça pozitif kültürleri gösteren ve ventriküler benzeri aksiyon potansiyelleri gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu tekniğin, çalışan ve örgü vücutlarındakiler gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, uygulanmasının nispeten basit ve uygun maliyetli olmasıdır. Ayrıca, teknik, kardiyak troponin I'e göre oldukça pozitif olan hücre kültürlerini üretir.Diğer protokoller tarafından gözlemlenen iç altta yatan varyasyon ve verimlilik olmadan, yöntemin görsel gösterimi, ön farklılaşma hücre kalitesi farklılaşma verimliliğini önemli ölçüde etkileyeceği için kritik öneme sahiptir. Ayrıca, antikor boyamadan önce yanlış fiksasyon ve geçirgenlik, prosedürü gösteren suboptimal akış sitometrisi sonuçlarına yol açacaktır, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan shabo bachar olacaktır.Aşağıdaki prosedürün en zorlu yönü, farklılaşmadan önce yüksek kaliteli farklılaşmamış pluripotent kök hücrelerin korunmasıdır. Optimal olmayan büyüme özelliklerine sahip hücrelerin kullanılması, farklılaşmanın verimliliğini önemli ölçüde etkileyecektir. Bu prosedüre, altı kuyu HESC nitelikli matris kaplı tabakta yetiştirilen köklü HPC'lerle başlayın.Homojen bir morfoloji sergilediklerinden emin olmak için hücreleri mikroskop altında kontrol edin. Hücreler burada gösterildiği gibi nöral epitel veya fibroblast benzeri morfoloji sergiliyorsa, kullanılmamalıdır. Hücrelerin, kuyu geçişi başına 0.75 milyonda oturduğunda sağlam bir şekilde çoğaldığından emin olun, bunları yaklaşık üç günde bir% 75'te birleştirin, hücreleri, farklılaşmanın başlamasından önce en az beş kez tek hücre seviyesine ayrışma ile geçişe doğru ilerletin.Hücreler önce E sekiz büyüme ortamını aspire eder ve hücreleri oda sıcaklığına önceden ısıtılmış dört mililitre PBS ile iki kez yıkar. Daha sonra, her bir oyuğa bir mililitre oda sıcaklığında hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve hücre sınırları yuvarlanmaya başlayana kadar kuyuyu rahatsız etmeden bırakın. Bu tipik olarak üç ila yedi dakika sürer ve makroskopik olarak gözlemlenebilir ve bir mikroskop kullanılarak doğrulanabilir.Daha sonra, bir ampul ile pamuk tıkalı bir cam pipet kullanarak hücreleri yerinden çıkarın ve bunları bir mililitre DM EMF 12 ortamı içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Bu, hücre ayrılma çözeltisini etkisiz hale getirecektir. Hücre çözeltisinin 10 mikrolitrelik bir alikotunu çıkarın ve bir mikro santrifüj tüpünde 10 mikrolitre trian mavisi ile karıştırın.Hücreleri sayın ve daha sonra santrifüj etmek için, 130 GS'de 15 mililitrelik konik tüpü beş dakika boyunca toplayın. Santrifüjleme sırasında oda sıcaklığında, otomatik bir hemo sitometre kullanarak hücreleri sayın. İleriye dönük olarak %70 ila %80 uygulanabilirlik bekleyin.Tüm hücre sayılarını, geçerli hücre sayılarının aksine toplam hücre sayılarına dayandırın. Sıkma işleminden sonra, ortamı aspire edin ve hücre peletini D-M-E-M-F 12'de, 500 mikrolitre başına altı hücreye 0.75 kez 10'luk bir nihai konsantrasyona yeniden süspanse ettikten sonra, her bir oyuğun her bir oyuğuna 0.5 mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. Kaya inhibitörü ile, hücreleri kuyu boyunca eşit şekilde dağıtmak için plakayı önden arkaya ve yan yana hafifçe sallayın.Hücreleri inkübatöre% 5 karbondioksit ve 37 santigrat derecede geri koyun. Paketlemeden 24 saat sonra. Kaya inhibitörü olmadan E sekizlik kuyu başına iki mililitre kullanarak ortamı günlük olarak değiştirmeye başlayın.Farklılaşma başlamadan önce %100 birleşme elde etmek için tohumlama yoğunluğunu optimize edin. Sıfırıncı günde, hücreler kompakt morfoloji ve minimum hücre kalıntısı ile %100 birleşir. E sekiz ortamını iki mililitre farklılaşma ile değiştirerek farklılaşma işlemine başlayın. Orta.Birincisi, her birine 1.2 mikrolitre CHIR ekleyin. Birinci ve ikinci günlerde, önemli %40 ila 50 hücre ölümü gözlemlemek yaygındır. Bununla birlikte, bağlı hücreler kompakt morfolojiyi koruyacaktır.Bu süre zarfında, ortam turuncu ve bulanık hale gelir. Aşırı hücre ölümünü gösteren pembe ortam gözlenirse, hücre canlılığını triam mavisi ile onaylayın ve hücre ölümü %70'i aşarsa durdurunAksi takdirde, birinci gün, ortamı iki mililitre taze farklılaşma ile değiştirme işlemini tekrarlayın. Orta. Birincisi, her bir kuyucuğa 1.2 mikrolitre CHIR ekleyin ve iki ila üç gün arasında taze farklılaşma ortamı ile değiştirin.Birincisi, üç ila dört gün arasında hücreler iyileşecek ve dördüncü günde yoğunluk artacaktır. Her kuyucuğun içindeki ortamı yeni farklılaşma ile değiştirin. Orta bir numara ve bir mikrolitre IWR bir.Beş ila altıncı günler arasında, minimal hücre ölümü meydana gelir ve beşinci günde yoğun lekeler ortaya çıkmaya başlayabilir, ortamı yeni farklılaşma ile değiştirebilir. Bir numaralı orta ve altı ila yedinci günlerde her bir kuyucuğa bir mikrolitre IWR ekleyin, ortamı taze farklılaşma ile değiştirin. Orta bir numara.Yedi ila sekizinci günlerde, yoğun yamalar ile serpiştirilmiş kompakt morfoloji ile birleşik bir tek tabaka elde edilir. Sekizinci günde, hücreler kendiliğinden kasılmaya başlayacak ve ilk kasılmalar genellikle yoğun yamalarda görülecektir. Sekizinci günde, ortamı yeni farklılaşma ile değiştirin. Orta.İki numara, kültür süresince her gün iki numaralı farklılaşma ile değiştirmeye devam edin. 10. güne kadar daha sağlam bir kasılma gözlenir ve sonraki günlerde kültür boyunca yayılmaya devam eder. Bu video 30. gündeki hücreleri gösteriyor ve burada hücreler 55. günde gösteriliyor.Akış sitometrisi için hücreleri toplamak için, daha önce yapıldığı gibi hücre ayrışması toplama ve sayma işlemini gerçekleştirin. Bu noktada hücrelerin steril tutulmasına gerek olmadığını unutmayın. Hücre peletini nazikçe girdaplarken, hücre peletine damla damla 100 mikrolitre fiksasyon solüsyonu ekleyin.Daha sonra tüpü 15 dakika buz üzerinde inkübe edin. Üç mililitre hücre yıkama çözeltisi ekleyin, dönüşten sonra santrifüjleme ile hücreleri toplayın, girdap yaparken çözeltiyi aspire edin. Daha önce olduğu gibi hücre peletine damla damla 100 mikrolitre geçirgen çözelti ekleyin.Daha sonra tüpü 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Üç mililitre hücre yıkama çözeltisi ekleyin. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve çözeltiyi aspire edin.Geçirgenlikten sonra toplam iki yıkama için tekrarlayın. Hücrelere 400 mikrolitre hücre bakım solüsyonunda bir P 1000 pipet kullanarak ekteki belgede açıklandığı gibi antikor boyama yapın ve bunları yukarı ve aşağı pipetleyerek ayırın. Ardından, 50 mikrolitre hücre bakım solüsyonu ile yuvarlak tabanlı bir tüp üzerinde bir hücre süzgeci kapağını önceden ıslatın.Tüpü buzun üzerine yerleştirin. Hücre süzgeç kapağı, hücre agregalarının akış sitometresini tıkamasını önler. Daha sonra, hücre çözeltisini hücre süzgeç kapağına aktarın ve hücre süspansiyonunun yerçekimi ile boşalmasına izin verin.Hücrelerin bir tüpte toplanması için tüpün altını tezgahın üstüne hafifçe vurun. Tüpü mümkün olan en kısa sürede tekrar buzun üzerine yerleştirin. Hücrelerin maksimum düzeyde iyileşmesini sağlamak için süzgeci 250 mikrolitre hücre bakım solüsyonu ile durulayın.Hücreleri buz üzerinde tutun ve üretilen kardiyomiyositlerin kalitesini belirlemek için akış sitometrisi ile analiz edilene kadar ışıktan koruyun. Bu protokol kullanılarak, hücreler 10 gün boyunca farklılaştırıldı ve TNNI üç a, pan kardiyomiyosit belirteci, TNNT iki çizgili kas belirteci ve IRX dört A ventriküler kardiyomiyosit belirtecine karşı antikorlarla boyandı. Fiksasyon ve geçirgen koşulların, maksimum pozitif hücre yüzdesini elde etmek için her bir antikor için optimize edildiğini unutmayın.Histogramlar, kapılı hücrelerin %99'unun TNNI üç için pozitif olduğunu ve %96'sının IRX dört için pozitif olduğunu göstermektedir. Ek olarak, hücreler TNNT iki, MLC iki V ve MLC iki dahil olmak üzere diğer kardiyak farklılaşma belirteçleri için oldukça pozitifti. Kardiyomiyosit saflığı ve hücre kimliği ile ilgili iddianın TNNI üç ve IRX dördüne dayandığına dair bir not.Boyama MC iki V ve MC iki A gelişim sırasında odacıklı değildir ve TNNT iki de iskelet kasında bulunur. Burada gösterilen aksiyon potansiyeli, tüm hücre yaması klemplemesi kullanılarak farklılaşmanın 46. gününde kendiliğinden kasılan tek bir kardiyomiyositten kaydedildi. Aksiyon potansiyeli profili, ventriküler benzeri kardiyomiyositlerin elde edildiğini gösterir.Düğüm benzeri profillerin küçük bir yüzdesi de gözlendi. Bu videoyu izledikten sonra, pluripotent kök hücrelerden yüksek kaliteli kardiyomiyosit kültürlerinin nasıl oluşturulacağını ve bunların akış sitometrisi ile nasıl karakterize edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, farklılaşmanın başlamasından önce kök hücrelerin yüksek kaliteli tek tabakalar olarak korunmasında karşılaşılan ortak zorluklar nedeniyle mücadele edeceklerdir.Bir sabitleyici ile çalışmanın tehlikeli ve kişisel olabileceğini unutmayın. Bu prosedür uygulanırken her zaman laboratuvar önlüğü veya eldiven gibi koruyucu ekipman giyilmelidir.

high-efficiency-differentiation-human-pluripotent-stem-cells-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz büyük bir tedarik kardiyovasküler onarım için insan kalp atalarıdır ve fonksiyonel kardiyomiyositlerde türetilmesi sağlayan küçük moleküller ile tanımlanmış koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan cardioblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

Pluripotent kök hücreler, embriyonik veya uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri ya, kardiyomiyositler dahil olmak üzere insan farklılaşmış hücrelerin, değerli bir kaynak oluşturmaktadır. Burada, bir embriyoid organları tabanlı protokol ile fonksiyonel insan kardiyomiyositlerin elde etmek için bunları nasıl kullanacağınızı gösteren, iPS hücrelerin kalp indüksiyon üzerinde durulacak.

İnsan kardiyomiyositleri Üretimi: Besleyici-ücretsiz İnsan Bağlı Pluripotent Kök Hücre A Farklılaşma Protokolü

Burada, kardiyovasküler hastalık modellemesi ve ilaç taraması amacıyla saflaştırılmış kardiyomiyositlerin üretimini sağlayan, küçük molekül modülasyonlu kardiyak farklılaşma ve glikoz yoksunluğu aracılı kardiyomiyosit saflaştırmasını birleştiren insan kardiyomiyosit türevi için sağlam bir protokol açıklıyoruz.

Küçük Molekül-modüle Farklılaşma ve sonraki Glikoz şiddetli açlık kullanma İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin yüksek oranda saf kardiyomiyositlerde türetilmesi

Burada, insan pluripotent kök hücreleri (hPSC'ler) için sağlam, hızlı ve ölçeklenebilir bir kardiyomiyosit farklılaşma protokolü sunuyoruz. Bu büyük ölçekli yöntem kullanılarak türetilen kardiyomiyositler, insan kardiyovasküler hastalık modellemesinde, yüksek verimli ilaç taramasında ve potansiyel olarak klinik uygulamalarda etkili kullanımları için yeterli hücre sayısı sağlayabilir.

Oldukça Tekrarlanabilir Küçük Molekül Tabanlı Farklılaşma Protokolü kullanarak insan pluripotent kök hücreleri gelen kardiyomiyositlerde Büyük Ölçekli Üretim

Biz kardiyomiyositlerde, endotel hücreleri ve düz kas hücreleri ve yama-aracılı sitokin teslimat hücre enjeksiyon birleştirerek nakledilen hücrelerin bütünleşmesini geliştiren bir dağıtım yöntemi, insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin ayırt etmek için, üç yeni ve daha etkin protokollere sunuyoruz.

Pluripotent Kök Hücre Miyokard Onarım Kardiyak Hücreleri Türetilmiş

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden (hPSC-CM) türeyen kardiyomiyositlerin elektrofizyolojik karakterizasyonu, kardiyak hastalık modellemesi ve ilaç yanıtlarının belirlenmesi için çok önemlidir. Bu protokol, hPSC-CM'lerin çok elektrotlu diziler üzerinde ayrılması ve plakalanması, alan potansiyelinin ölçülmesi ve QT ve RR aralıklarının analiz edilmesi için gerekli olan bilgileri sağlar.

Çok Elektrodlu Diziler (ÇÇA&#39;lar) Kullanan İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilmiş Kardiyomiyositlerin (hPSC-CM&#39;ler) Elektrofizyolojik Analizi

Burada, fonksiyonel, sözleşme, cardiomyocyte benzeri hücreler üretmek için kardiyak farklılaşma potansiyeli insan Mezenkimal kök hücrelerin genç kaynaklarının verimli koşum için bir yöntem mevcut tüp bebek.

Vitro İnsan Mezenkimal Kök hücre farklılaşma fonksiyonel Cardiomyocyte benzeri hücre içine

Burada ilk kalp alan benzeri kardiyak ataları ve ventrikül benzeri cardiomyocytes insan pluripotent kök hücre üretmek için aktivin A ve lentivirus-aracılı ID1-overexpression, basit bir birleşimini kullanarak ölçeklenebilir bir yöntem açıklanmaktadır.

İlk kalp alan benzeri kardiyak ataları ve ventrikül benzeri Cardiomyocytes insan Pluripotent kök hücrelerden nesil

Bu makale, insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyosit (hiPSC-CM) ağlarının gelişimi için bir dizi protokolün yanı sıra, hücre membranı hareket potansiyeli ölçümleri için ters şekilde electroporate etmek için multiwell MEA plakaları üzerinde kültürlü bir set içerir. Yüksek verimlilik kayıtları aynı hücre sitelerinden gün içinde tekrar tekrar elde edilir.

Tekrarlayan eylem potansiyel kayıtlar için Multiwell mikro elektrot diziler üzerinde insan iPSC-türetilen Kardiyomiyoksit ağları

Burada sürekli olarak sağlam insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler üretmek ve işlevlerini karakterize etmek için bir yöntem tanımlamak ve doğrulamak. Bu teknikler sinyal yolları içine mekanistik anlayış geliştirilmesinde yardımcı olabilir, büyük ölçekli ilaç tarama için bir platform sağlamak, ve güvenilir model kalp hastalıkları.

Ventriküler Benzeri HiPSC Türevi Kardiyomiyositlerin Ve Kalsiyum Kullanımı Karakterizasyonu için Yüksek Kaliteli Hücre Preparatlarının Üretimi

Burada, hasta periferik kan mononükleer hücrelerinden insan kardiyomiyositlerini sağlam bir şekilde üretmek ve genişletmek için bir protokol sunuyoruz.

Hasta Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinden İnsan Kardiyomiyositlerinin Üretimi ve Genişlemesi

Öğrenin, insan pluripotent kök hücrelerinden kardiyomiyosit üretmek ve sitometri ile karakterize etmek için Wnt yolunu küçük moleküllerle modüle etme yöntemini. Bu protokol yüksek saflıkta hücre kültürleri sağlar.

Sitometrisi ile Yüksek Verim kardiyomiyositlerde İnsan pluripotent kök hücrelerin Farklılaşma ve Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet