Sitometrisi ile Yüksek Verim kardiyomiyositlerde İnsan pluripotent kök hücrelerin Farklılaşma ve Karakterizasyonu

Bu prosedürün genel amacı, pluripotent kök hücrelerden yüksek kaliteli kardiyomiyosit kültürleri oluşturmak ve akış sitometrisi kullanarak son ürünü uygun şekilde karakterize etmektir. Bunu başarmak için, farklılaşmamış pluripotent kök hücrelerin yüksek kaliteli tek tabakalı kültürleri üretilir. Kardiyo miyogenez daha sonra küçük moleküller kullanılarak rüzgar yolunun modüle edilmesiyle indüklenir.

Daha sonra, kardiyomiyositler, her bir antikor için özel olarak optimize edilmiş koşullar kullanılarak sabitlenir, nüfuz edilir ve boyanır. Son olarak, hücreler akış sitometrisi ile analiz edilir. Sonuç olarak, kardiyak belirteçler, TNNI üç ve IRX dört için oldukça pozitif kültürleri gösteren ve ventriküler benzeri aksiyon potansiyelleri gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, çalışan ve örgü vücutlarındakiler gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, uygulanmasının nispeten basit ve uygun maliyetli olmasıdır. Ayrıca, teknik, kardiyak troponin I'e göre oldukça pozitif olan hücre kültürlerini üretir.Diğer protokoller tarafından gözlemlenen iç altta yatan varyasyon ve verimlilik olmadan, yöntemin görsel gösterimi, ön farklılaşma hücre kalitesi farklılaşma verimliliğini önemli ölçüde etkileyeceği için kritik öneme sahiptir. Ayrıca, antikor boyamadan önce yanlış fiksasyon ve geçirgenlik, prosedürü gösteren suboptimal akış sitometrisi sonuçlarına yol açacaktır, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan shabo bachar olacaktır.

Aşağıdaki prosedürün en zorlu yönü, farklılaşmadan önce yüksek kaliteli farklılaşmamış pluripotent kök hücrelerin korunmasıdır. Optimal olmayan büyüme özelliklerine sahip hücrelerin kullanılması, farklılaşmanın verimliliğini önemli ölçüde etkileyecektir. Bu prosedüre, altı kuyu HESC nitelikli matris kaplı tabakta yetiştirilen köklü HPC'lerle başlayın.

Homojen bir morfoloji sergilediklerinden emin olmak için hücreleri mikroskop altında kontrol edin. Hücreler burada gösterildiği gibi nöral epitel veya fibroblast benzeri morfoloji sergiliyorsa, kullanılmamalıdır. Hücrelerin, kuyu geçişi başına 0.75 milyonda oturduğunda sağlam bir şekilde çoğaldığından emin olun, bunları yaklaşık üç günde bir% 75'te birleştirin, hücreleri, farklılaşmanın başlamasından önce en az beş kez tek hücre seviyesine ayrışma ile

Hücreler önce E sekiz büyüme ortamını aspire eder ve hücreleri oda sıcaklığına önceden ısıtılmış dört mililitre PBS ile iki kez yıkar. Daha sonra, her bir oyuğa bir mililitre oda sıcaklığında hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve hücre sınırları yuvarlanmaya başlayana kadar kuyuyu rahatsız etmeden bırakın. Bu tipik olarak üç ila yedi dakika sürer ve makroskopik olarak gözlemlenebilir ve bir mikroskop kullanılarak doğrulanabilir.

Daha sonra, bir ampul ile pamuk tıkalı bir cam pipet kullanarak hücreleri yerinden çıkarın ve bunları bir mililitre DM EMF 12 ortamı içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Bu, hücre ayrılma çözeltisini etkisiz hale getirecektir. Hücre çözeltisinin 10 mikrolitrelik bir alikotunu çıkarın ve bir mikro santrifüj tüpünde 10 mikrolitre trian mavisi ile karıştırın.

Hücreleri sayın ve daha sonra santrifüj etmek için, 130 GS'de 15 mililitrelik konik tüpü beş dakika boyunca toplayın. Santrifüjleme sırasında oda sıcaklığında, otomatik bir hemo sitometre kullanarak hücreleri sayın. İleriye dönük olarak %70 ila %80 uygulanabilirlik bekleyin.

Tüm hücre sayılarını, geçerli hücre sayılarının aksine toplam hücre sayılarına dayandırın. Sıkma işleminden sonra, ortamı aspire edin ve hücre peletini D-M-E-M-F 12'de, 500 mikrolitre başına altı hücreye 0.75 kez 10'luk bir nihai konsantrasyona yeniden süspanse ettikten sonra, her bir oyuğun her bir oyuğuna 0.5 mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. Kaya inhibitörü ile, hücreleri kuyu boyunca eşit şekilde dağıtmak için plakayı önden arkaya ve yan yana hafifçe sallayın.

Hücreleri inkübatöre% 5 karbondioksit ve 37 santigrat derecede geri koyun. Paketlemeden 24 saat sonra. Kaya inhibitörü olmadan E sekizlik kuyu başına iki mililitre kullanarak ortamı günlük olarak değiştirmeye başlayın.

Farklılaşma başlamadan önce %100 birleşme elde etmek için tohumlama yoğunluğunu optimize edin. Sıfırıncı günde, hücreler kompakt morfoloji ve minimum hücre kalıntısı ile %100 birleşir. E sekiz ortamını iki mililitre farklılaşma ile değiştirerek farklılaşma işlemine başlayın. Orta.

Birincisi, her birine 1.2 mikrolitre CHIR ekleyin. Birinci ve ikinci günlerde, önemli %40 ila 50 hücre ölümü gözlemlemek yaygındır. Bununla birlikte, bağlı hücreler kompakt morfolojiyi koruyacaktır.

Bu süre zarfında, ortam turuncu ve bulanık hale gelir. Aşırı hücre ölümünü gösteren pembe ortam gözlenirse, hücre canlılığını triam mavisi ile onaylayın ve hücre ölümü %70'i aşarsa durdurunAksi takdirde, birinci gün, ortamı iki mililitre taze farklılaşma ile değiştirme işlemini tekrarlayın. Orta. Birincisi, her bir kuyucuğa 1.2 mikrolitre CHIR ekleyin ve iki ila üç gün arasında taze farklılaşma ortamı ile değiştirin.

Birincisi, üç ila dört gün arasında hücreler iyileşecek ve dördüncü günde yoğunluk artacaktır. Her kuyucuğun içindeki ortamı yeni farklılaşma ile değiştirin. Orta bir numara ve bir mikrolitre IWR bir.

Beş ila altıncı günler arasında, minimal hücre ölümü meydana gelir ve beşinci günde yoğun lekeler ortaya çıkmaya başlayabilir, ortamı yeni farklılaşma ile değiştirebilir. Bir numaralı orta ve altı ila yedinci günlerde her bir kuyucuğa bir mikrolitre IWR ekleyin, ortamı taze farklılaşma ile değiştirin. Orta bir numara.

Yedi ila sekizinci günlerde, yoğun yamalar ile serpiştirilmiş kompakt morfoloji ile birleşik bir tek tabaka elde edilir. Sekizinci günde, hücreler kendiliğinden kasılmaya başlayacak ve ilk kasılmalar genellikle yoğun yamalarda görülecektir. Sekizinci günde, ortamı yeni farklılaşma ile değiştirin. Orta.

İki numara, kültür süresince her gün iki numaralı farklılaşma ile değiştirmeye devam edin. 10. güne kadar daha sağlam bir kasılma gözlenir ve sonraki günlerde kültür boyunca yayılmaya devam eder. Bu video 30. gündeki hücreleri gösteriyor ve burada hücreler 55. günde gösteriliyor.

Akış sitometrisi için hücreleri toplamak için, daha önce yapıldığı gibi hücre ayrışması toplama ve sayma işlemini gerçekleştirin. Bu noktada hücrelerin steril tutulmasına gerek olmadığını unutmayın. Hücre peletini nazikçe girdaplarken, hücre peletine damla damla 100 mikrolitre fiksasyon solüsyonu ekleyin.

Daha sonra tüpü 15 dakika buz üzerinde inkübe edin. Üç mililitre hücre yıkama çözeltisi ekleyin, dönüşten sonra santrifüjleme ile hücreleri toplayın, girdap yaparken çözeltiyi aspire edin. Daha önce olduğu gibi hücre peletine damla damla 100 mikrolitre geçirgen çözelti ekleyin.

Daha sonra tüpü 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Üç mililitre hücre yıkama çözeltisi ekleyin. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve çözeltiyi aspire edin.

Geçirgenlikten sonra toplam iki yıkama için tekrarlayın. Hücrelere 400 mikrolitre hücre bakım solüsyonunda bir P 1000 pipet kullanarak ekteki belgede açıklandığı gibi antikor boyama yapın ve bunları yukarı ve aşağı pipetleyerek ayırın. Ardından, 50 mikrolitre hücre bakım solüsyonu ile yuvarlak tabanlı bir tüp üzerinde bir hücre süzgeci kapağını önceden ıslatın.

Tüpü buzun üzerine yerleştirin. Hücre süzgeç kapağı, hücre agregalarının akış sitometresini tıkamasını önler. Daha sonra, hücre çözeltisini hücre süzgeç kapağına aktarın ve hücre süspansiyonunun yerçekimi ile boşalmasına izin verin.

Hücrelerin bir tüpte toplanması için tüpün altını tezgahın üstüne hafifçe vurun. Tüpü mümkün olan en kısa sürede tekrar buzun üzerine yerleştirin. Hücrelerin maksimum düzeyde iyileşmesini sağlamak için süzgeci 250 mikrolitre hücre bakım solüsyonu ile durulayın.

Hücreleri buz üzerinde tutun ve üretilen kardiyomiyositlerin kalitesini belirlemek için akış sitometrisi ile analiz edilene kadar ışıktan koruyun. Bu protokol kullanılarak, hücreler 10 gün boyunca farklılaştırıldı ve TNNI üç a, pan kardiyomiyosit belirteci, TNNT iki çizgili kas belirteci ve IRX dört A ventriküler kardiyomiyosit belirtecine karşı antikorlarla boyandı. Fiksasyon ve geçirgen koşulların, maksimum pozitif hücre yüzdesini elde etmek için her bir antikor için optimize edildiğini unutmayın.

Histogramlar, kapılı hücrelerin %99'unun TNNI üç için pozitif olduğunu ve %96'sının IRX dört için pozitif olduğunu göstermektedir. Ek olarak, hücreler TNNT iki, MLC iki V ve MLC iki dahil olmak üzere diğer kardiyak farklılaşma belirteçleri için oldukça pozitifti. Kardiyomiyosit saflığı ve hücre kimliği ile ilgili iddianın TNNI üç ve IRX dördüne dayandığına dair bir not.

Boyama MC iki V ve MC iki A gelişim sırasında odacıklı değildir ve TNNT iki de iskelet kasında bulunur. Burada gösterilen aksiyon potansiyeli, tüm hücre yaması klemplemesi kullanılarak farklılaşmanın 46. gününde kendiliğinden kasılan tek bir kardiyomiyositten kaydedildi. Aksiyon potansiyeli profili, ventriküler benzeri kardiyomiyositlerin elde edildiğini gösterir.

Düğüm benzeri profillerin küçük bir yüzdesi de gözlendi. Bu videoyu izledikten sonra, pluripotent kök hücrelerden yüksek kaliteli kardiyomiyosit kültürlerinin nasıl oluşturulacağını ve bunların akış sitometrisi ile nasıl karakterize edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, farklılaşmanın başlamasından önce kök hücrelerin yüksek kaliteli tek tabakalar olarak korunmasında karşılaşılan ortak zorluklar nedeniyle mücadele edeceklerdir.

Bir sabitleyici ile çalışmanın tehlikeli ve kişisel olabileceğini unutmayın. Bu prosedür uygulanırken her zaman laboratuvar önlüğü veya eldiven gibi koruyucu ekipman giyilmelidir.