Yama Kelepçesi Elektrofizyolojisi
Yama klemp kaydı, nöronal aktivasyonu kontrol eden iyon kanallarının biyofiziksel özelliklerini araştırmak için son derece yararlı bir tekniktir.
Prosedür, bir veya daha fazla iyon kanalı içeren küçük bir zar "yamasını" izole etmek için bir hücreye karşı bir cam mikropipetin bastırılmasını içerir.
Deney düzeneği ayrıca, bilim adamlarının, mevcut iyon kanallarına bağlı olarak, iyonların zardan akışını etkileyen ve bu kanalların karmaşık çalışmasına izin veren hücre zarı boyunca voltajı hassas bir şekilde kontrol ederek yamalı alanın elektriksel ortamını "kelepçelemelerine" olanak tanır.
Bu video, yama kelepçesi tekniğinin arkasındaki ilkelere genel bir bakış, bir deneyi çalıştırmak için gerekli adımların bir açıklaması ve son olarak bu yöntemin bazı uygulamalarını sunar.
İlk olarak, yama kelepçesi kaydının arkasındaki ilkeleri gözden geçirelim.
Bir nöronun içindeki pozitif ve negatif yüklü iyonların sayısı, dışarıda bulunan sayıdan farklıdır.
Bu dengesizlik, yaklaşık -70 mV'luk bir voltaj farkı veya membran potansiyeli üretir, bu da iç kısmın dışarıdan daha negatif olduğu anlamına gelir.
İyon kanalları, esasen elektrik akımları olan iyonların hücre zarı boyunca hareketini kontrol ederek gradyanın korunmasına yardımcı olur.
Bilim adamları, yama kelepçesi tekniğini kullanarak potansiyelin ve akımın doğası hakkında sorular sorarlar.
Yama kelepçesi teçhizatı, voltajları ve akımları ölçmek için hem iyonik bir çözelti hem de klorlu bir gümüş elektrot içeren bir cam mikropipet içerir.
Mikropipetin ucu, küçük bir zar alanını çevreleyen cilalı, bir mikronluk bir açıklığa sahiptir.
Banyo çözeltisi içindeki iyonlardan kaynaklanan arka plan gürültüsünü ortadan kaldırmak için, pipet ve membran yaması arasında yüksek dirençli bir sızdırmazlık oluşturulur. Contanın direnci gigaohm aralığında olduğu için gigaohm conta olarak bilinir.
Pipet içindeki elektrot, iyonların plazma zarındaki kanallar boyunca hareketinin sonucu olan akım ve voltaj dalgalanmalarını yükseltebilen bir amplifikatöre bağlanır.
Amplifikatör ile bilim adamları, membran potansiyelini belirli voltajlarda sıkıştırabilir veya yapay olarak ayarlayabilir.
Amplifikatör, voltajı sabit tutmak için gümüş elektrottan ne kadar akım eklenmesi gerektiğini düzenler.
Farklı gerilim kapılı iyon kanalları belirli gerilimlerde açıldığından, açılma olayları ölçülen akımların profillerindeki değişikliklerle temsil edilir.
Alternatif olarak, bilim adamları elektrot boyunca belirli bir akımı zorlayabilir ve sonuçta ortaya çıkan potansiyel değişiklikleri kaydedebilir. Bu "akım kelepçesi" konfigürasyonunda eylem potansiyelleri kaydedilebilir.
Şimdi beş ana yama kelepçesi konfigürasyonu türüne bakalım.
Birincisi, mikropipetin sağlam bir hücrenin zarına basitçe kapatıldığı hücreye bağlı konfigürasyondur.
İkincisi, hücrenin iç kısmına erişim sağlamak için mikropipet içindeki zarın yırtıldığı tüm hücre konfigürasyonudur.
Üçüncüsü, delikli yama konfigürasyonudur. Burada, sitozole erişim sağlayan zarda küçük delikler açmak için mikropipete antibiyotik gibi kimyasallar eklenir.
Dördüncü yapılandırma, içten dışa yamadır. Bunu başarmak için, mikropipet önce hücre ile bir sızdırmazlık oluşturur, daha sonra hızlı bir şekilde geri çekilir, zarın bir parçasını koparır ve iç yüzeyi banyo solüsyonuna maruz bırakır.
Bu, kanalların sitoplazmik tarafının banyoya uygulanan farklı kimyasallara maruz kalmasına izin verir.
Son olarak, içten dışa benzer şekilde, dıştan dışa yama tüm hücre konfigürasyonu olarak başlar. Mikropipet, bir zar parçası uç boyunca dışbükey bir conta oluşturana kadar yavaşça geri çekilir.
Bu kurulumda, kanalın hücre dışı yüzü deneysel tedavilere maruz bırakılabilir.
Artık ilkeleri gözden geçirdiğimize göre, bir yama kelepçesi kaydı gerçekleştirmek için gereken adımları gözden geçirelim.
Bir pipet çektirme kullanarak bir borosilikat cam tüpü mikropipetlere çekerek başlayın.
Ardından, uygun çap ve direnci elde etmek için ucu ateşle parlatın.
Parlatma işleminden sonra, mikropipeti iyonik bir çözelti ile doldurun ve hava kabarcıklarını çıkarmak için hafifçe vurun.
Ardından mikropipeti bir tutucuya bağlı elektrotun üzerine kaydırın.
Takıldıktan sonra, pipete pozitif basınç uygulamak için bir şırınga kullanın, bu da diğer solüsyonların uca girmesini önler.
Şimdi, hücrelerinizi veya ilgilendiğiniz dokuyu mikroskop sahnesine yerleştirin ve mikropipeti bir hücreye doğru hareket ettirin.
Test voltajı darbeleri üreten amplifikatör ile, uç hücreye temas ettiğinde artacak olan direnci kaydedin.
Gigaohm contasını oluşturmak için, şırıngayı kullanarak yavaşça pozitiften negatif basınca geçin. Contanın oluşumu, direncin 1 gigaohm'dan daha büyük bir seviyeye hızlı bir şekilde artmasına neden olacaktır.
Artık hücreye bağlı bir konfigürasyon oluşturulduğuna göre, tam hücre konfigürasyonuna geçelim ve bir deney yapalım!
Tüm hücre konfigürasyonunun, zarın yırtıldığı zaman olduğunu hatırlayın.
Yırtılma, mikropipete negatif basınç eklenerek gerçekleştirilir.
Zar kırıldığında, hücre zarı artık test darbesi tarafından yüklenen bir kapasitör görevi gördüğünden, test darbesi şekli büyük akım geçişlerine sahip olacaktır.
Herhangi bir nörondaki tek bir iyon kanalı tipinin özellikleri, farmakolojik olarak diğer kanal tiplerinin aktivitesini bloke ederek araştırılabilir.
Voltajın bir dizi farklı tutma potansiyeline kademelendirilmesiyle uyandırılan iyon kanalı akımlarını incelemek için bir voltaj adımı protokolü kullanılır.
Akım-voltaj veya IV eğrisi, bir iyon kanalından geçen akımın voltaj bağımlılıklarını gösterir ve kanalın hangi voltajlarda açık veya kapalı olduğuna dair fikir verir.
Şimdi sinirbilimcilerin bu teknikle neler yapabileceğini keşfetmek için birkaç uygulamaya bakalım.
Bazen, nöronlarda bulunan iyon kanalları hücresel olmayan bir ortamda incelenebilir.
Burada bilim adamları, bu kanalları izole bir şekilde incelemek için yapay bir lipit zarına iyon kanalı proteinleri eklediler.
Bu kanallar daha sonra kanal aktivitesi üzerindeki etkilerini incelemek için acı biberden türetilmiş kapsaisin gibi deneysel moleküllere maruz bırakılabilir.
Hücre dışı ortama maruz kaldıkları ve hücresel işlevi önemli ölçüde etkiledikleri için, iyon kanalları mükemmel ilaç hedefleri oluşturur. Mikropipet veya banyo çözeltilerine test bileşikleri eklendiğinde, nikotin gibi ilaçların nöral aktivite üzerindeki etkisini doğrudan test etmek için yama kelepçesi kayıtları kullanılabilir. Yüksek dirençli bir sızdırmazlık oluşturmak için negatif basınç uygulama prensibi, ilaç tarama uygulamaları için aynı anda çok sayıda hücreden kayıt yapabilen yüksek verimli cihazlar oluşturmak için bile uygulanmıştır.
Tüm hücre yama kelepçesi, tek hücrelerin uyaranlara tepkisini ölçmek için değerli bir araçtır.
Ayrıca, eşleştirilmiş kayıtlar, nöron ateşlemesinin kas gibi uyarılabilir hedef hücreler üzerindeki etkisini araştırmak için kullanılabilir. Bu örnekte, bir motor nöronun ateşlenmesini uyarmak için tüm hücre yama kelepçesi kullanılırken, aynı anda kontrol ettiği kas lifinden kayıtlar alınır. Nöronal uyarılma ve kas aktivitesi arasında açık ilişkiler gözlenmiştir.
JoVE'nin, tekniğin arkasındaki ilkelerin ve bir deneyi çalıştırmanın adımlarının gözden geçirildiği yama kelepçesi kaydına girişini izlediniz.
Voltaj ve akımlardaki değişikliklere karşı mükemmel zamansal duyarlılığı ile yama kelepçe kaydı, kanalların ve nöronların biyofiziğini anlamada etkili olmaya devam edecektir.
İzlediğiniz için teşekkürler!
Nöron hücre zarları, yükün hücre içine ve dışına hareketini kontrol eden ve böylece nöron ateşlemesini düzenleyen iyon kanalları ile doldurulur. Bu ka…
Yama klemp kaydı, nöronal aktivasyonu kontrol eden iyon kanallarının biyofiziksel özelliklerini araştırmak için son derece yararlı bir tekniktir.
Prosedür, bir veya daha fazla iyon kanalı içeren küçük bir zar "yamasını" izole etmek için bir hücreye karşı bir cam mikropipetin bastırılmasını içerir.
Deney düzeneği ayrıca, bilim adamlarının, mevcut iyon kanallarına bağlı olarak, iyonların zardan akışını etkileyen ve bu kanalların karmaşık çalışmasına izin veren hücre zarı boyunca voltajı hassas bir şekilde kontrol ederek yamalı alanın elektriksel ortamını "kelepçelemelerine" olanak tanır.
Bu video, yama kelepçesi tekniğinin arkasındaki ilkelere genel bir bakış, bir deneyi çalıştırmak için gerekli adımların bir açıklaması ve son olarak bu yöntemin bazı uygulamalarını sunar.
İlk olarak, yama kelepçesi kaydının arkasındaki ilkeleri gözden geçirelim.
Bir nöronun içindeki pozitif ve negatif yüklü iyonların sayısı, dışarıda bulunan sayıdan farklıdır.
Bu dengesizlik, yaklaşık -70 mV'luk bir voltaj farkı veya membran potansiyeli üretir, bu da iç kısmın dışarıdan daha negatif olduğu anlamına gelir.
İyon kanalları, esasen elektrik akımları olan iyonların hücre zarı boyunca hareketini kontrol ederek gradyanın korunmasına yardımcı olur.
Bilim adamları, yama kelepçesi tekniğini kullanarak potansiyelin ve akımın doğası hakkında sorular sorarlar.
Yama kelepçesi teçhizatı, voltajları ve akımları ölçmek için hem iyonik bir çözelti hem de klorlu bir gümüş elektrot içeren bir cam mikropipet içerir.
Mikropipetin ucu, küçük bir zar alanını çevreleyen cilalı, bir mikronluk bir açıklığa sahiptir.
Banyo çözeltisi içindeki iyonlardan kaynaklanan arka plan gürültüsünü ortadan kaldırmak için, pipet ve membran yaması arasında yüksek dirençli bir sızdırmazlık oluşturulur. Contanın direnci gigaohm aralığında olduğu için gigaohm conta olarak bilinir.
Pipet içindeki elektrot, iyonların plazma zarındaki kanallar boyunca hareketinin sonucu olan akım ve voltaj dalgalanmalarını yükseltebilen bir amplifikatöre bağlanır.
Amplifikatör ile bilim adamları, membran potansiyelini belirli voltajlarda sıkıştırabilir veya yapay olarak ayarlayabilir.
Amplifikatör, voltajı sabit tutmak için gümüş elektrottan ne kadar akım eklenmesi gerektiğini düzenler.
Farklı gerilim kapılı iyon kanalları belirli gerilimlerde açıldığından, açılma olayları ölçülen akımların profillerindeki değişikliklerle temsil edilir.
Alternatif olarak, bilim adamları elektrot boyunca belirli bir akımı zorlayabilir ve sonuçta ortaya çıkan potansiyel değişiklikleri kaydedebilir. Bu "akım kelepçesi" konfigürasyonunda eylem potansiyelleri kaydedilebilir.
Şimdi beş ana yama kelepçesi konfigürasyonu türüne bakalım.
Birincisi, mikropipetin sağlam bir hücrenin zarına basitçe kapatıldığı hücreye bağlı konfigürasyondur.
İkincisi, hücrenin iç kısmına erişim sağlamak için mikropipet içindeki zarın yırtıldığı tüm hücre konfigürasyonudur.
Üçüncüsü, delikli yama konfigürasyonudur. Burada, sitozole erişim sağlayan zarda küçük delikler açmak için mikropipete antibiyotik gibi kimyasallar eklenir.
Dördüncü yapılandırma, içten dışa yamadır. Bunu başarmak için, mikropipet önce hücre ile bir sızdırmazlık oluşturur, daha sonra hızlı bir şekilde geri çekilir, zarın bir parçasını koparır ve iç yüzeyi banyo solüsyonuna maruz bırakır.
Bu, kanalların sitoplazmik tarafının banyoya uygulanan farklı kimyasallara maruz kalmasına izin verir.
Son olarak, içten dışa benzer şekilde, dıştan dışa yama tüm hücre konfigürasyonu olarak başlar. Mikropipet, bir zar parçası uç boyunca dışbükey bir conta oluşturana kadar yavaşça geri çekilir.
Bu kurulumda, kanalın hücre dışı yüzü deneysel tedavilere maruz bırakılabilir.
Artık ilkeleri gözden geçirdiğimize göre, bir yama kelepçesi kaydı gerçekleştirmek için gereken adımları gözden geçirelim.
Bir pipet çektirme kullanarak bir borosilikat cam tüpü mikropipetlere çekerek başlayın.
Ardından, uygun çap ve direnci elde etmek için ucu ateşle parlatın.
Parlatma işleminden sonra, mikropipeti iyonik bir çözelti ile doldurun ve hava kabarcıklarını çıkarmak için hafifçe vurun.
Ardından mikropipeti bir tutucuya bağlı elektrotun üzerine kaydırın.
Takıldıktan sonra, pipete pozitif basınç uygulamak için bir şırınga kullanın, bu da diğer solüsyonların uca girmesini önler.
Şimdi, hücrelerinizi veya ilgilendiğiniz dokuyu mikroskop sahnesine yerleştirin ve mikropipeti bir hücreye doğru hareket ettirin.
Test voltajı darbeleri üreten amplifikatör ile, uç hücreye temas ettiğinde artacak olan direnci kaydedin.
Gigaohm contasını oluşturmak için, şırıngayı kullanarak yavaşça pozitiften negatif basınca geçin. Contanın oluşumu, direncin 1 gigaohm'dan daha büyük bir seviyeye hızlı bir şekilde artmasına neden olacaktır.
Artık hücreye bağlı bir konfigürasyon oluşturulduğuna göre, tam hücre konfigürasyonuna geçelim ve bir deney yapalım!
Tüm hücre konfigürasyonunun, zarın yırtıldığı zaman olduğunu hatırlayın.
Yırtılma, mikropipete negatif basınç eklenerek gerçekleştirilir.
Zar kırıldığında, hücre zarı artık test darbesi tarafından yüklenen bir kapasitör görevi gördüğünden, test darbesi şekli büyük akım geçişlerine sahip olacaktır.
Herhangi bir nörondaki tek bir iyon kanalı tipinin özellikleri, farmakolojik olarak diğer kanal tiplerinin aktivitesini bloke ederek araştırılabilir.
Voltajın bir dizi farklı tutma potansiyeline kademelendirilmesiyle uyandırılan iyon kanalı akımlarını incelemek için bir voltaj adımı protokolü kullanılır.
Akım-voltaj veya IV eğrisi, bir iyon kanalından geçen akımın voltaj bağımlılıklarını gösterir ve kanalın hangi voltajlarda açık veya kapalı olduğuna dair fikir verir.
Şimdi sinirbilimcilerin bu teknikle neler yapabileceğini keşfetmek için birkaç uygulamaya bakalım.
Bazen, nöronlarda bulunan iyon kanalları hücresel olmayan bir ortamda incelenebilir.
Burada bilim adamları, bu kanalları izole bir şekilde incelemek için yapay bir lipit zarına iyon kanalı proteinleri eklediler.
Bu kanallar daha sonra kanal aktivitesi üzerindeki etkilerini incelemek için acı biberden türetilmiş kapsaisin gibi deneysel moleküllere maruz bırakılabilir.
Hücre dışı ortama maruz kaldıkları ve hücresel işlevi önemli ölçüde etkiledikleri için, iyon kanalları mükemmel ilaç hedefleri oluşturur. Mikropipet veya banyo çözeltilerine test bileşikleri eklendiğinde, nikotin gibi ilaçların nöral aktivite üzerindeki etkisini doğrudan test etmek için yama kelepçesi kayıtları kullanılabilir. Yüksek dirençli bir sızdırmazlık oluşturmak için negatif basınç uygulama prensibi, ilaç tarama uygulamaları için aynı anda çok sayıda hücreden kayıt yapabilen yüksek verimli cihazlar oluşturmak için bile uygulanmıştır.
Tüm hücre yama kelepçesi, tek hücrelerin uyaranlara tepkisini ölçmek için değerli bir araçtır.
Ayrıca, eşleştirilmiş kayıtlar, nöron ateşlemesinin kas gibi uyarılabilir hedef hücreler üzerindeki etkisini araştırmak için kullanılabilir. Bu örnekte, bir motor nöronun ateşlenmesini uyarmak için tüm hücre yama kelepçesi kullanılırken, aynı anda kontrol ettiği kas lifinden kayıtlar alınır. Nöronal uyarılma ve kas aktivitesi arasında açık ilişkiler gözlenmiştir.
JoVE'nin, tekniğin arkasındaki ilkelerin ve bir deneyi çalıştırmanın adımlarının gözden geçirildiği yama kelepçesi kaydına girişini izlediniz.
Voltaj ve akımlardaki değişikliklere karşı mükemmel zamansal duyarlılığı ile yama kelepçe kaydı, kanalların ve nöronların biyofiziğini anlamada etkili olmaya devam edecektir.
İzlediğiniz için teşekkürler!
Yama klemp kaydı, nöronal aktivasyonu kontrol eden iyon kanallarının biyofiziksel özelliklerini araştırmak için son derece yararlı bir tekniktir.
Prosedür, bir veya daha fazla iyon kanalı içeren küçük bir zar "yamasını" izole etmek için bir hücreye karşı bir cam mikropipetin bastırılmasını içerir.
Deney düzeneği ayrıca, bilim adamlarının, mevcut iyon kanallarına bağlı olarak, iyonların zardan akışını etkileyen ve bu kanalların karmaşık çalışmasına izin veren hücre zarı boyunca voltajı hassas bir şekilde kontrol ederek yamalı alanın elektriksel ortamını "kelepçelemelerine" olanak tanır.
Bu video, yama kelepçesi tekniğinin arkasındaki ilkelere genel bir bakış, bir deneyi çalıştırmak için gerekli adımların bir açıklaması ve son olarak bu yöntemin bazı uygulamalarını sunar.
İlk olarak, yama kelepçesi kaydının arkasındaki ilkeleri gözden geçirelim.
Bir nöronun içindeki pozitif ve negatif yüklü iyonların sayısı, dışarıda bulunan sayıdan farklıdır.
Bu dengesizlik, yaklaşık -70 mV'luk bir voltaj farkı veya membran potansiyeli üretir, bu da iç kısmın dışarıdan daha negatif olduğu anlamına gelir.
İyon kanalları, esasen elektrik akımları olan iyonların hücre zarı boyunca hareketini kontrol ederek gradyanın korunmasına yardımcı olur.
Bilim adamları, yama kelepçesi tekniğini kullanarak potansiyelin ve akımın doğası hakkında sorular sorarlar.
Yama kelepçesi teçhizatı, voltajları ve akımları ölçmek için hem iyonik bir çözelti hem de klorlu bir gümüş elektrot içeren bir cam mikropipet içerir.
Mikropipetin ucu, küçük bir zar alanını çevreleyen cilalı, bir mikronluk bir açıklığa sahiptir.
Banyo çözeltisi içindeki iyonlardan kaynaklanan arka plan gürültüsünü ortadan kaldırmak için, pipet ve membran yaması arasında yüksek dirençli bir sızdırmazlık oluşturulur. Contanın direnci gigaohm aralığında olduğu için gigaohm conta olarak bilinir.
Pipet içindeki elektrot, iyonların plazma zarındaki kanallar boyunca hareketinin sonucu olan akım ve voltaj dalgalanmalarını yükseltebilen bir amplifikatöre bağlanır.
Amplifikatör ile bilim adamları, membran potansiyelini belirli voltajlarda sıkıştırabilir veya yapay olarak ayarlayabilir.
Amplifikatör, voltajı sabit tutmak için gümüş elektrottan ne kadar akım eklenmesi gerektiğini düzenler.
Farklı gerilim kapılı iyon kanalları belirli gerilimlerde açıldığından, açılma olayları ölçülen akımların profillerindeki değişikliklerle temsil edilir.
Alternatif olarak, bilim adamları elektrot boyunca belirli bir akımı zorlayabilir ve sonuçta ortaya çıkan potansiyel değişiklikleri kaydedebilir. Bu "akım kelepçesi" konfigürasyonunda eylem potansiyelleri kaydedilebilir.
Şimdi beş ana yama kelepçesi konfigürasyonu türüne bakalım.
Birincisi, mikropipetin sağlam bir hücrenin zarına basitçe kapatıldığı hücreye bağlı konfigürasyondur.
İkincisi, hücrenin iç kısmına erişim sağlamak için mikropipet içindeki zarın yırtıldığı tüm hücre konfigürasyonudur.
Üçüncüsü, delikli yama konfigürasyonudur. Burada, sitozole erişim sağlayan zarda küçük delikler açmak için mikropipete antibiyotik gibi kimyasallar eklenir.
Dördüncü yapılandırma, içten dışa yamadır. Bunu başarmak için, mikropipet önce hücre ile bir sızdırmazlık oluşturur, daha sonra hızlı bir şekilde geri çekilir, zarın bir parçasını koparır ve iç yüzeyi banyo solüsyonuna maruz bırakır.
Bu, kanalların sitoplazmik tarafının banyoya uygulanan farklı kimyasallara maruz kalmasına izin verir.
Son olarak, içten dışa benzer şekilde, dıştan dışa yama tüm hücre konfigürasyonu olarak başlar. Mikropipet, bir zar parçası uç boyunca dışbükey bir conta oluşturana kadar yavaşça geri çekilir.
Bu kurulumda, kanalın hücre dışı yüzü deneysel tedavilere maruz bırakılabilir.
Artık ilkeleri gözden geçirdiğimize göre, bir yama kelepçesi kaydı gerçekleştirmek için gereken adımları gözden geçirelim.
Bir pipet çektirme kullanarak bir borosilikat cam tüpü mikropipetlere çekerek başlayın.
Ardından, uygun çap ve direnci elde etmek için ucu ateşle parlatın.
Parlatma işleminden sonra, mikropipeti iyonik bir çözelti ile doldurun ve hava kabarcıklarını çıkarmak için hafifçe vurun.
Ardından mikropipeti bir tutucuya bağlı elektrotun üzerine kaydırın.
Takıldıktan sonra, pipete pozitif basınç uygulamak için bir şırınga kullanın, bu da diğer solüsyonların uca girmesini önler.
Şimdi, hücrelerinizi veya ilgilendiğiniz dokuyu mikroskop sahnesine yerleştirin ve mikropipeti bir hücreye doğru hareket ettirin.
Test voltajı darbeleri üreten amplifikatör ile, uç hücreye temas ettiğinde artacak olan direnci kaydedin.
Gigaohm contasını oluşturmak için, şırıngayı kullanarak yavaşça pozitiften negatif basınca geçin. Contanın oluşumu, direncin 1 gigaohm'dan daha büyük bir seviyeye hızlı bir şekilde artmasına neden olacaktır.
Artık hücreye bağlı bir konfigürasyon oluşturulduğuna göre, tam hücre konfigürasyonuna geçelim ve bir deney yapalım!
Tüm hücre konfigürasyonunun, zarın yırtıldığı zaman olduğunu hatırlayın.
Yırtılma, mikropipete negatif basınç eklenerek gerçekleştirilir.
Zar kırıldığında, hücre zarı artık test darbesi tarafından yüklenen bir kapasitör görevi gördüğünden, test darbesi şekli büyük akım geçişlerine sahip olacaktır.
Herhangi bir nörondaki tek bir iyon kanalı tipinin özellikleri, farmakolojik olarak diğer kanal tiplerinin aktivitesini bloke ederek araştırılabilir.
Voltajın bir dizi farklı tutma potansiyeline kademelendirilmesiyle uyandırılan iyon kanalı akımlarını incelemek için bir voltaj adımı protokolü kullanılır.
Akım-voltaj veya IV eğrisi, bir iyon kanalından geçen akımın voltaj bağımlılıklarını gösterir ve kanalın hangi voltajlarda açık veya kapalı olduğuna dair fikir verir.
Şimdi sinirbilimcilerin bu teknikle neler yapabileceğini keşfetmek için birkaç uygulamaya bakalım.
Bazen, nöronlarda bulunan iyon kanalları hücresel olmayan bir ortamda incelenebilir.
Burada bilim adamları, bu kanalları izole bir şekilde incelemek için yapay bir lipit zarına iyon kanalı proteinleri eklediler.
Bu kanallar daha sonra kanal aktivitesi üzerindeki etkilerini incelemek için acı biberden türetilmiş kapsaisin gibi deneysel moleküllere maruz bırakılabilir.
Hücre dışı ortama maruz kaldıkları ve hücresel işlevi önemli ölçüde etkiledikleri için, iyon kanalları mükemmel ilaç hedefleri oluşturur. Mikropipet veya banyo çözeltilerine test bileşikleri eklendiğinde, nikotin gibi ilaçların nöral aktivite üzerindeki etkisini doğrudan test etmek için yama kelepçesi kayıtları kullanılabilir. Yüksek dirençli bir sızdırmazlık oluşturmak için negatif basınç uygulama prensibi, ilaç tarama uygulamaları için aynı anda çok sayıda hücreden kayıt yapabilen yüksek verimli cihazlar oluşturmak için bile uygulanmıştır.
Tüm hücre yama kelepçesi, tek hücrelerin uyaranlara tepkisini ölçmek için değerli bir araçtır.
Ayrıca, eşleştirilmiş kayıtlar, nöron ateşlemesinin kas gibi uyarılabilir hedef hücreler üzerindeki etkisini araştırmak için kullanılabilir. Bu örnekte, bir motor nöronun ateşlenmesini uyarmak için tüm hücre yama kelepçesi kullanılırken, aynı anda kontrol ettiği kas lifinden kayıtlar alınır. Nöronal uyarılma ve kas aktivitesi arasında açık ilişkiler gözlenmiştir.
JoVE'nin, tekniğin arkasındaki ilkelerin ve bir deneyi çalıştırmanın adımlarının gözden geçirildiği yama kelepçesi kaydına girişini izlediniz.
Voltaj ve akımlardaki değişikliklere karşı mükemmel zamansal duyarlılığı ile yama kelepçe kaydı, kanalların ve nöronların biyofiziğini anlamada etkili olmaya devam edecektir.
İzlediğiniz için teşekkürler!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the basic principle behind patch clamp recording?
Patch clamp recording isolates a small membrane patch containing ion channels by pressing a glass micropipette against a cell and forming a high-resistance seal. Scientists then use an electrode to clamp or control the electrical environment of the patched area, allowing precise measurement of how voltage changes affect ion flow through channels. This technique reveals the biophysical properties of ion channels that regulate neuronal activation.
Q2: How does a gigaohm seal form in patch clamp experiments?
A gigaohm seal forms when negative pressure is applied through a syringe to the micropipette, creating a high-resistance seal between the pipette tip and the cell membrane. The resistance increases rapidly to greater than 1 gigaohm, effectively isolating the membrane patch from background noise in the bath solution. This seal is critical for detecting small electrical currents from individual ion channels.
Q3: What are the main differences between whole-cell and cell-attached patch configurations?
In cell-attached configuration, the micropipette simply seals to an intact cell membrane, allowing study of channels in their native state. Whole-cell configuration ruptures the membrane within the micropipette to access the cell's interior, enabling measurement of total cellular currents. Whole-cell recording provides broader access to intracellular mechanisms and is commonly used for voltage-step protocols and current-voltage curve generation.
Q4: How does inside-out patch configuration expose the cytoplasmic side of ion channels?
Inside-out patch begins with a cell-attached seal, then the micropipette is pulled back quickly, ripping a piece of membrane away from the cell. This exposes the cytoplasmic surface of the channels to the bath solution, allowing researchers to apply experimental chemicals directly to the intracellular face of ion channels. This configuration is valuable for studying how cytoplasmic factors regulate channel activity.
Q5: What does a current-voltage curve reveal about ion channel function?
A current-voltage (IV) curve shows the voltage-dependence of current flowing through an ion channel, revealing at which voltages the channel opens or closes. Generated using a voltage-step protocol that steps the membrane potential through a series of different holding potentials, the IV curve provides insight into channel kinetics and selectivity. This data is essential for understanding how voltage-gated ion channels control neuronal excitability.
Q6: How is patch clamp recording used for drug screening and testing?
Test compounds can be added to the micropipette or bath solutions during patch clamp recording to directly measure drug effects on neural activity. For example, nicotine or other neuroactive compounds are applied while recording channel currents, revealing how drugs alter ion channel function. High-throughput devices based on the gigaohm seal principle now enable simultaneous recording from numerous cells for rapid drug screening applications.
Q7: What can paired whole-cell patch clamp recordings demonstrate about neuron-muscle interactions?
Paired recordings simultaneously stimulate firing of a motor neuron while recording responses from the muscle fiber it controls, revealing direct relationships between neuronal excitation and muscle activity. This approach, using primary neuronal cultures and electrophysiology techniques, demonstrates how action potentials in neurons translate into functional responses in target cells. Such experiments are crucial for understanding synaptic transmission and neuromuscular function.
Bu videodaki bölümler
0:00
Overview
1:04
Principles Behind Patch Clamping
3:20
Patch Clamp Configurations
4:43
Preparing Micropipettes and Forming a Seal
6:05
Whole-cell Patch Clamp Procedure
7:15
Applications
9:11
Summary