Patch Clamp Elektrofizyolojisi
Patch clamp kaydı, nöronal aktivasyonu kontrol eden iyon kanallarının biyofiziksel özelliklerini incelemek için son derece yararlı bir tekniktir.
Prosedür, bir veya daha fazla iyon kanalı içeren küçük bir membran "yamasını" (patch) izole etmek amacıyla bir cam mikropipetin bir hücreye bastırılmasını içerir.
Deneysel düzenek, bilim insanlarının hücre membranı boyunca voltajı hassas bir şekilde kontrol ederek yamalanmış bölgenin elektriksel ortamını "sabitlemesine" (clamp) olanak tanır; bu durum, mevcut iyon kanallarına bağlı olarak membran boyunca iyon akışını etkiler ve bu kanalların ayrıntılı bir şekilde incelenmesine imkan sağlar.
Bu video, patch clamp tekniğinin arkasındaki prensiplere genel bir bakış, bir deney yürütmek için gerekli adımların açıklamasını ve son olarak bu yöntemin bazı uygulamalarını sunmaktadır.
Öncelikle, yama (patch) yönteminin temelindeki ilkeleri inceleyelim. klemplleme kaydı.
Bir nöronun içindeki pozitif ve negatif yüklü iyonların sayısı, dışarıda bulunanların sayısından farklıdır.
Bu dengesizlik, yaklaşık -70 mV'lik bir voltaj farkı veya membran potansiyeli oluşturur; bu da hücre içinin dışına göre daha negatif olduğu anlamına gelir.
İyon kanalları, esasen elektriksel akımlar olan iyonların hücre membranı boyunca hareketini kontrol ederek gradyanın korunmasına yardımcı olur.
Bilim insanları, yama sıkıştırma (patch clamp) tekniğini kullanarak potansiyel ve akımın doğası hakkında sorular sormaktadırlar.
Patch clamp düzeneği, hem voltaj ve akımları ölçmek için iyonik bir çözelti hem de klorürlü gümüş elektrot içeren bir cam mikropipet içerir.
Mikropipetin ucu, küçük bir membran alanını çevreleyen, cilalanmış, bir mikronluk bir açıklığa sahiptir.
Banyo solüsyonu içindeki iyonlardan kaynaklanan arka plan gürültüsünü ortadan kaldırmak için, pipet ile membran yaması arasında yüksek dirençli bir sızdırmazlık oluşturulur. Sızdırmazlığın direnci gigaohm aralığında olduğu için buna gigaohm sızdırmazlığı denir.
Pipet içindeki elektrot, plazma membranındaki kanallardan geçen iyonların hareketinden kaynaklanan akım ve voltaj dalgalanmalarını yükseltebilen bir amplifikatöre bağlıdır.
Amplifikatör sayesinde bilim insanları, membran potansiyelini belirli voltajlarda sabitleyebilir veya yapay olarak ayarlayabilirler.
Amplifikatör, voltajı sabit tutmak için gümüş elektrot üzerinden ne kadar akım eklenmesi gerektiğini düzenler.
Farklı voltaj kapılı iyon kanalları belirli voltajlarda açıldığından, açılma olayları ölçülen profillerdeki varyasyonlarla temsil edilir¬ akımlar.
Alternatif olarak bilim insanları, elektrottan belirli bir akım geçmeye zorlayabilir ve bunun sonucunda meydana gelen potansiyel değişimlerini kaydedebilirler. Bu "akım kenetleme" konfigürasyonunda aksiyon potansiyelleri kaydedilebilir.
Şimdi beş ana yama kenetleme (patch clamp) konfigürasyonuna göz atalım.
Birincisi, mikropipetin bütün bir hücrenin membranına basitçe mühürlendiği hücre-bağlı (cell-attached) konfigürasyondur.
İkincisi, hücrenin içine erişim sağlamak için mikropipet içindeki membranın yırtıldığı tüm-hücre (whole-cell) konfigürasyondur.
Üçüncüsü, perfore yama (perforated patch) konfigürasyonudur. Burada, sitozole erişim sağlamak amacıyla membranda küçük delikler açmak için mikropipete antibiyotikler gibi kimyasallar eklenir.
Dördüncü konfigürasyon, iç-dış (inside-out) yamadır. Bunu gerçekleştirmek için mikropipet önce hücreyle bir mühür oluşturur, ardından hızla geri çekilerek membrandan bir parçayı koparır ve iç yüzeyi banyo solüsyonuna maruz bırakır.
Bu durum, kanalların sitoplazmik tarafının banyoya uygulanan farklı kimyasallara maruz kalmasını sağlar.
Son olarak, iç-dış konfigürasyonuna benzer şekilde, dış-dış (outside-out) yama bir tüm-hücre konfigürasyonu olarak başlar. Mikropipet, bir membran parçası uç boyunca konveks bir mühür oluşturana kadar yavaşça geri çekilir.
Bu düzenekte, kanalın hücre dışı yüzü deneysel işlemlere maruz bırakılabilir.
Prensipleri gözden geçirdiğimize göre, bir patch clamp kaydı gerçekleştirmek için gereken adımlara geçelim.
Bir pipet çekici kullanarak borosilikat cam tüpü mikropipetlere dönüştürerek başlayın.
Ardından, uygun çap ve direnci elde etmek için ucu alevle cilalayın.
Cilalama işleminden sonra mikropipeti iyonik bir çözeltiyle doldurun ve hava kabarcıklarını gidermek için hafifçe vurun.
Ardından mikropipeti, bir tutucuya bağlı olan elektrot üzerine kaydırın.
Bağlantı kurulduktan sonra, diğer çözeltilerin uca girmesini önlemek için bir şırınga yardımıyla pipete pozitif basınç uygulayın.
Şimdi, ilgilendiğiniz hücreleri veya dokuyu mikroskop tablasına yerleştirin ve mikropipeti bir hücreye doğru hareket ettirin.
Amplifikatör test voltaj darbeleri üretirken direnci kaydedin; uç hücreye değdiğinde direnç artacaktır.
Gigaohm sızdırmazlığını (seal) oluşturmak için şırıngayı kullanarak nazikçe pozitif basınçtan negatif basınca geçiş yapın. Sızdırmazlığın oluşması, direncin hızla 1 gigaohm değerinin üzerine çıkmasıyla sonuçlanacaktır.
Hücreye yapışık (cell-attached) konfigürasyon kurulduğuna göre, şimdi tüm hücre (whole-cell) konfigürasyonuna geçelim ve bir deney yapalım!
Tüm hücre konfigürasyonunun, membranın yırtıldığı durum olduğunu hatırlayalım.
Yırtma işlemi, mikropipete negatif basınç uygulanarak gerçekleştirilir.
Membran yırtıldığında, hücre membranı artık test palsi tarafından şarj edilen bir kapasitör gibi davranacağından, test palsi şeklinde büyük akım geçişleri (transientler) görülecektir.
Herhangi bir nöründeki tek bir iyon kanalı tipinin özellikleri, diğer kanal tiplerinin aktivitesi farmakolojik olarak bloke edilerek incelenebilir.
Voltajın bir dizi farklı tutma potansiyeline (holding potential) basamaklandırılmasıyla uyarılan iyon kanalı akımlarını incelemek için bir voltaj basamak (voltage-step) protokolü kullanılır.
Akım-voltaj veya IV eğrisi, bir iyon kanalından geçen akımın voltaja bağımlılığını gösterir ve kanalın hangi voltajlarda açık veya kapalı olduğuna dair bilgi sağlar.
Şimdi, nörobilimcilerin bu teknikle neler yapabileceğini keşfetmek için birkaç uygulamaya göz atalım.
Bazen, nöronlarda bulunan iyon kanalları hücresel olmayan bir ortamda incelenebilir.
Burada bilim insanları, söz konusu kanalları izole bir şekilde çalışmak amacıyla yapay bir lipid membrana iyon kanalı proteinleri eklemişlerdir.
Ardından bu kanallar, kanal aktivitesi üzerindeki etkilerini incelemek için acı biber türevli kapsaisin gibi deneysel moleküllere maruz bırakılabilir.
Ekstraselüler ortama açık oldukları ve hücresel fonksiyonu önemli ölçüde etkiledikleri için iyon kanalları mükemmel ilaç hedefleridir. Test bileşikleri mikropipete veya banyo çözeltilerine eklendiğinde, nikotin gibi ilaçların nöral aktivite üzerindeki etkisini doğrudan test etmek için patch clamp kayıtları kullanılabilir. Yüksek dirençli bir sızdırmazlık oluşturmak için negatif basınç uygulama prensibi, ilaç tarama uygulamaları için aynı anda çok sayıda hücreden kayıt alabilen yüksek verimli cihazların geliştirilmesinde bile kullanılmıştır.
Whole-cell patch clamp, tek hücrelerin uyarılara verdiği yanıtı ölçmek için değerli bir araçtır.
Ayrıca, nöron ateşlemesinin kas gibi uyarılabilir hedef hücreler üzerindeki etkisini araştırmak için eşli kayıtlar (paired recordings) kullanılabilir. Bu örnekte, bir motor nöronun ateşlenmesini uyarmak için whole-cell patch clamp kullanılırken, aynı anda kontrol ettiği kas lifinden kayıtlar alınmaktadır. Nöral eksitasyon ile kas aktivitesi arasında net ilişkiler gözlemlenmektedir.
Tekniğin temel ilkelerinin ve bir deneyin yürütülme basamaklarının gözden geçirildiği JoVE'nin patch clamp kaydına giriş videosunu izlediniz.
Voltaj ve akım değişikliklerine karşı sahip olduğu üstün zamansal hassasiyet ile patch clamp kaydı, kanalların ve nöronların biyofiziğinin anlaşılmasında etkili bir araç olmaya devam edecektir.
İzlediğiniz için teşekkürler!
Nöron hücre membranları, hücreye giren ve hücreden çıkan yük hareketini kontrol eden ve böylece nöron ateşlemesini düzenleyen iyon kanalları ile donat…
Patch clamp kaydı, nöronal aktivasyonu kontrol eden iyon kanallarının biyofiziksel özelliklerini incelemek için son derece yararlı bir tekniktir.
Prosedür, bir veya daha fazla iyon kanalı içeren küçük bir membran "yamasını" (patch) izole etmek amacıyla bir cam mikropipetin bir hücreye bastırılmasını içerir.
Deneysel düzenek, bilim insanlarının hücre membranı boyunca voltajı hassas bir şekilde kontrol ederek yamalanmış bölgenin elektriksel ortamını "sabitlemesine" (clamp) olanak tanır; bu durum, mevcut iyon kanallarına bağlı olarak membran boyunca iyon akışını etkiler ve bu kanalların ayrıntılı bir şekilde incelenmesine imkan sağlar.
Bu video, patchclamp tekniğinin arkasındaki prensiplere genel bir bakış, bir deney yürütmek için gerekli adımların açıklamasını ve son olarak bu yöntemin bazı uygulamalarını sunmaktadır.
Öncelikle, yama (patch) yönteminin temelindeki ilkeleri inceleyelim.klemplleme kaydı.
Bir nöronun içindeki pozitif ve negatif yüklü iyonların sayısı, dışarıda bulunanların sayısından farklıdır.
Bu dengesizlik, yaklaşık -70 mV'lik bir voltaj farkı veya membran potansiyeli oluşturur; bu da hücre içinin dışına göre daha negatif olduğu anlamına gelir.
İyon kanalları, esasen elektriksel akımlar olan iyonların hücre membranı boyunca hareketini kontrol ederek gradyanın korunmasına yardımcı olur.
Bilim insanları, yama sıkıştırma (patch clamp) tekniğini kullanarak potansiyel ve akımın doğası hakkında sorular sormaktadırlar.
Patch clamp düzeneği, hem voltaj ve akımları ölçmek için iyonik bir çözelti hem de klorürlü gümüş elektrot içeren bir cam mikropipet içerir.
Mikropipetin ucu, küçük bir membran alanını çevreleyen, cilalanmış, bir mikronluk bir açıklığa sahiptir.
Banyo solüsyonu içindeki iyonlardan kaynaklanan arka plan gürültüsünü ortadan kaldırmak için, pipet ile membran yaması arasında yüksek dirençli bir sızdırmazlık oluşturulur. Sızdırmazlığın direnci gigaohm aralığında olduğu için buna gigaohm sızdırmazlığı denir.
Pipet içindeki elektrot, plazma membranındaki kanallardan geçen iyonların hareketinden kaynaklanan akım ve voltaj dalgalanmalarını yükseltebilen bir amplifikatöre bağlıdır.
Amplifikatör sayesinde bilim insanları, membran potansiyelini belirli voltajlarda sabitleyebilir veya yapay olarak ayarlayabilirler.
Amplifikatör, voltajı sabit tutmak için gümüş elektrot üzerinden ne kadar akım eklenmesi gerektiğini düzenler.
Farklı voltaj kapılı iyon kanalları belirli voltajlarda açıldığından, açılma olayları ölçülen profillerdeki varyasyonlarla temsil edilir¬ akımlar.
Alternatif olarak bilim insanları, elektrottan belirli bir akım geçmeye zorlayabilir ve bunun sonucunda meydana gelen potansiyel değişimlerini kaydedebilirler.Bu "akım kenetleme" konfigürasyonunda aksiyon potansiyelleri kaydedilebilir.
Şimdi beş ana yama kenetleme (patch clamp) konfigürasyonuna göz atalım.
Birincisi, mikropipetin bütün bir hücrenin membranına basitçe mühürlendiği hücre-bağlı (cell-attached) konfigürasyondur.
İkincisi, hücrenin içine erişim sağlamak için mikropipet içindeki membranın yırtıldığı tüm-hücre (whole-cell) konfigürasyondur.
Üçüncüsü, perfore yama (perforated patch) konfigürasyonudur. Burada, sitozole erişim sağlamak amacıyla membranda küçük delikler açmak için mikropipete antibiyotikler gibi kimyasallar eklenir.
Dördüncü konfigürasyon, iç-dış (inside-out) yamadır. Bunu gerçekleştirmek için mikropipet önce hücreyle bir mühür oluşturur, ardından hızla geri çekilerek membrandan bir parçayı koparır ve iç yüzeyi banyo solüsyonuna maruz bırakır.
Bu durum, kanalların sitoplazmik tarafının banyoya uygulanan farklı kimyasallara maruz kalmasını sağlar.
Son olarak, iç-dış konfigürasyonuna benzer şekilde, dış-dış (outside-out) yama bir tüm-hücre konfigürasyonu olarak başlar. Mikropipet, bir membran parçası uç boyunca konveks bir mühür oluşturana kadar yavaşça geri çekilir.
Bu düzenekte, kanalın hücre dışı yüzü deneysel işlemlere maruz bırakılabilir.
Prensipleri gözden geçirdiğimize göre, bir patch clamp kaydı gerçekleştirmek için gereken adımlara geçelim.
Bir pipet çekici kullanarak borosilikat cam tüpü mikropipetlere dönüştürerek başlayın.
Ardından, uygun çap ve direnci elde etmek için ucu alevle cilalayın.
Cilalama işleminden sonra mikropipeti iyonik bir çözeltiyle doldurun ve hava kabarcıklarını gidermek için hafifçe vurun.
Ardından mikropipeti, bir tutucuya bağlı olan elektrot üzerine kaydırın.
Bağlantı kurulduktan sonra, diğer çözeltilerin uca girmesini önlemek için bir şırınga yardımıyla pipete pozitif basınç uygulayın.
Şimdi, ilgilendiğiniz hücreleri veya dokuyu mikroskop tablasına yerleştirin ve mikropipeti bir hücreye doğru hareket ettirin.
Amplifikatör test voltaj darbeleri üretirken direnci kaydedin; uç hücreye değdiğinde direnç artacaktır.
Gigaohm sızdırmazlığını (seal) oluşturmak için şırıngayı kullanarak nazikçe pozitif basınçtan negatif basınca geçiş yapın.Sızdırmazlığın oluşması, direncin hızla 1 gigaohm değerinin üzerine çıkmasıyla sonuçlanacaktır.
Hücreye yapışık (cell-attached) konfigürasyon kurulduğuna göre, şimdi tüm hücre (whole-cell) konfigürasyonuna geçelim ve bir deney yapalım!
Tüm hücre konfigürasyonunun, membranın yırtıldığı durum olduğunu hatırlayalım.
Yırtma işlemi, mikropipete negatif basınç uygulanarak gerçekleştirilir.
Membran yırtıldığında, hücre membranı artık test palsi tarafından şarj edilen bir kapasitör gibi davranacağından, test palsi şeklinde büyük akım geçişleri (transientler) görülecektir.
Herhangi bir nöründeki tek bir iyon kanalı tipinin özellikleri, diğer kanal tiplerinin aktivitesi farmakolojik olarak bloke edilerek incelenebilir.
Voltajın bir dizi farklı tutma potansiyeline (holding potential) basamaklandırılmasıyla uyarılan iyon kanalı akımlarını incelemek için bir voltaj basamak (voltage-step) protokolü kullanılır.
Akım-voltaj veya IV eğrisi, bir iyon kanalından geçen akımın voltaja bağımlılığını gösterir ve kanalın hangi voltajlarda açık veya kapalı olduğuna dair bilgi sağlar.
Şimdi, nörobilimcilerin bu teknikle neler yapabileceğini keşfetmek için birkaç uygulamaya göz atalım.
Bazen, nöronlarda bulunan iyon kanalları hücresel olmayan bir ortamda incelenebilir.
Burada bilim insanları, söz konusu kanalları izole bir şekilde çalışmak amacıyla yapay bir lipid membrana iyon kanalı proteinleri eklemişlerdir.
Ardından bu kanallar, kanal aktivitesi üzerindeki etkilerini incelemek için acı biber türevli kapsaisin gibi deneysel moleküllere maruz bırakılabilir.
Ekstraselüler ortama açık oldukları ve hücresel fonksiyonu önemli ölçüde etkiledikleri için iyon kanalları mükemmel ilaç hedefleridir. Test bileşikleri mikropipete veya banyo çözeltilerine eklendiğinde, nikotin gibi ilaçların nöral aktivite üzerindeki etkisini doğrudan test etmek için patch clamp kayıtları kullanılabilir. Yüksek dirençli bir sızdırmazlık oluşturmak için negatif basınç uygulama prensibi, ilaç tarama uygulamaları için aynı anda çok sayıda hücreden kayıt alabilen yüksek verimli cihazların geliştirilmesinde bile kullanılmıştır.
Whole-cell patch clamp, tek hücrelerin uyarılara verdiği yanıtı ölçmek için değerli bir araçtır.
Ayrıca, nöron ateşlemesinin kas gibi uyarılabilir hedef hücreler üzerindeki etkisini araştırmak için eşli kayıtlar (paired recordings) kullanılabilir. Bu örnekte, bir motor nöronun ateşlenmesini uyarmak için whole-cell patch clamp kullanılırken, aynı anda kontrol ettiği kas lifinden kayıtlar alınmaktadır. Nöral eksitasyon ile kas aktivitesi arasında net ilişkiler gözlemlenmektedir.
Tekniğin temel ilkelerinin ve bir deneyin yürütülme basamaklarının gözden geçirildiği JoVE'nin patch clamp kaydına giriş videosunu izlediniz.
Voltaj ve akım değişikliklerine karşı sahip olduğu üstün zamansal hassasiyet ile patch clamp kaydı, kanalların ve nöronların biyofiziğinin anlaşılmasında etkili bir araç olmaya devam edecektir.
İzlediğiniz için teşekkürler!
Patch clamp kaydı, nöronal aktivasyonu kontrol eden iyon kanallarının biyofiziksel özelliklerini incelemek için son derece yararlı bir tekniktir.
Prosedür, bir veya daha fazla iyon kanalı içeren küçük bir membran "yamasını" (patch) izole etmek amacıyla bir cam mikropipetin bir hücreye bastırılmasını içerir.
Deneysel düzenek, bilim insanlarının hücre membranı boyunca voltajı hassas bir şekilde kontrol ederek yamalanmış bölgenin elektriksel ortamını "sabitlemesine" (clamp) olanak tanır; bu durum, mevcut iyon kanallarına bağlı olarak membran boyunca iyon akışını etkiler ve bu kanalların ayrıntılı bir şekilde incelenmesine imkan sağlar.
Bu video, patch clamp tekniğinin arkasındaki prensiplere genel bir bakış, bir deney yürütmek için gerekli adımların açıklamasını ve son olarak bu yöntemin bazı uygulamalarını sunmaktadır.
Öncelikle, yama (patch) yönteminin temelindeki ilkeleri inceleyelim. klemplleme kaydı.
Bir nöronun içindeki pozitif ve negatif yüklü iyonların sayısı, dışarıda bulunanların sayısından farklıdır.
Bu dengesizlik, yaklaşık -70 mV'lik bir voltaj farkı veya membran potansiyeli oluşturur; bu da hücre içinin dışına göre daha negatif olduğu anlamına gelir.
İyon kanalları, esasen elektriksel akımlar olan iyonların hücre membranı boyunca hareketini kontrol ederek gradyanın korunmasına yardımcı olur.
Bilim insanları, yama sıkıştırma (patch clamp) tekniğini kullanarak potansiyel ve akımın doğası hakkında sorular sormaktadırlar.
Patch clamp düzeneği, hem voltaj ve akımları ölçmek için iyonik bir çözelti hem de klorürlü gümüş elektrot içeren bir cam mikropipet içerir.
Mikropipetin ucu, küçük bir membran alanını çevreleyen, cilalanmış, bir mikronluk bir açıklığa sahiptir.
Banyo solüsyonu içindeki iyonlardan kaynaklanan arka plan gürültüsünü ortadan kaldırmak için, pipet ile membran yaması arasında yüksek dirençli bir sızdırmazlık oluşturulur. Sızdırmazlığın direnci gigaohm aralığında olduğu için buna gigaohm sızdırmazlığı denir.
Pipet içindeki elektrot, plazma membranındaki kanallardan geçen iyonların hareketinden kaynaklanan akım ve voltaj dalgalanmalarını yükseltebilen bir amplifikatöre bağlıdır.
Amplifikatör sayesinde bilim insanları, membran potansiyelini belirli voltajlarda sabitleyebilir veya yapay olarak ayarlayabilirler.
Amplifikatör, voltajı sabit tutmak için gümüş elektrot üzerinden ne kadar akım eklenmesi gerektiğini düzenler.
Farklı voltaj kapılı iyon kanalları belirli voltajlarda açıldığından, açılma olayları ölçülen profillerdeki varyasyonlarla temsil edilir¬ akımlar.
Alternatif olarak bilim insanları, elektrottan belirli bir akım geçmeye zorlayabilir ve bunun sonucunda meydana gelen potansiyel değişimlerini kaydedebilirler. Bu "akım kenetleme" konfigürasyonunda aksiyon potansiyelleri kaydedilebilir.
Şimdi beş ana yama kenetleme (patch clamp) konfigürasyonuna göz atalım.
Birincisi, mikropipetin bütün bir hücrenin membranına basitçe mühürlendiği hücre-bağlı (cell-attached) konfigürasyondur.
İkincisi, hücrenin içine erişim sağlamak için mikropipet içindeki membranın yırtıldığı tüm-hücre (whole-cell) konfigürasyondur.
Üçüncüsü, perfore yama (perforated patch) konfigürasyonudur. Burada, sitozole erişim sağlamak amacıyla membranda küçük delikler açmak için mikropipete antibiyotikler gibi kimyasallar eklenir.
Dördüncü konfigürasyon, iç-dış (inside-out) yamadır. Bunu gerçekleştirmek için mikropipet önce hücreyle bir mühür oluşturur, ardından hızla geri çekilerek membrandan bir parçayı koparır ve iç yüzeyi banyo solüsyonuna maruz bırakır.
Bu durum, kanalların sitoplazmik tarafının banyoya uygulanan farklı kimyasallara maruz kalmasını sağlar.
Son olarak, iç-dış konfigürasyonuna benzer şekilde, dış-dış (outside-out) yama bir tüm-hücre konfigürasyonu olarak başlar. Mikropipet, bir membran parçası uç boyunca konveks bir mühür oluşturana kadar yavaşça geri çekilir.
Bu düzenekte, kanalın hücre dışı yüzü deneysel işlemlere maruz bırakılabilir.
Prensipleri gözden geçirdiğimize göre, bir patch clamp kaydı gerçekleştirmek için gereken adımlara geçelim.
Bir pipet çekici kullanarak borosilikat cam tüpü mikropipetlere dönüştürerek başlayın.
Ardından, uygun çap ve direnci elde etmek için ucu alevle cilalayın.
Cilalama işleminden sonra mikropipeti iyonik bir çözeltiyle doldurun ve hava kabarcıklarını gidermek için hafifçe vurun.
Ardından mikropipeti, bir tutucuya bağlı olan elektrot üzerine kaydırın.
Bağlantı kurulduktan sonra, diğer çözeltilerin uca girmesini önlemek için bir şırınga yardımıyla pipete pozitif basınç uygulayın.
Şimdi, ilgilendiğiniz hücreleri veya dokuyu mikroskop tablasına yerleştirin ve mikropipeti bir hücreye doğru hareket ettirin.
Amplifikatör test voltaj darbeleri üretirken direnci kaydedin; uç hücreye değdiğinde direnç artacaktır.
Gigaohm sızdırmazlığını (seal) oluşturmak için şırıngayı kullanarak nazikçe pozitif basınçtan negatif basınca geçiş yapın. Sızdırmazlığın oluşması, direncin hızla 1 gigaohm değerinin üzerine çıkmasıyla sonuçlanacaktır.
Hücreye yapışık (cell-attached) konfigürasyon kurulduğuna göre, şimdi tüm hücre (whole-cell) konfigürasyonuna geçelim ve bir deney yapalım!
Tüm hücre konfigürasyonunun, membranın yırtıldığı durum olduğunu hatırlayalım.
Yırtma işlemi, mikropipete negatif basınç uygulanarak gerçekleştirilir.
Membran yırtıldığında, hücre membranı artık test palsi tarafından şarj edilen bir kapasitör gibi davranacağından, test palsi şeklinde büyük akım geçişleri (transientler) görülecektir.
Herhangi bir nöründeki tek bir iyon kanalı tipinin özellikleri, diğer kanal tiplerinin aktivitesi farmakolojik olarak bloke edilerek incelenebilir.
Voltajın bir dizi farklı tutma potansiyeline (holding potential) basamaklandırılmasıyla uyarılan iyon kanalı akımlarını incelemek için bir voltaj basamak (voltage-step) protokolü kullanılır.
Akım-voltaj veya IV eğrisi, bir iyon kanalından geçen akımın voltaja bağımlılığını gösterir ve kanalın hangi voltajlarda açık veya kapalı olduğuna dair bilgi sağlar.
Şimdi, nörobilimcilerin bu teknikle neler yapabileceğini keşfetmek için birkaç uygulamaya göz atalım.
Bazen, nöronlarda bulunan iyon kanalları hücresel olmayan bir ortamda incelenebilir.
Burada bilim insanları, söz konusu kanalları izole bir şekilde çalışmak amacıyla yapay bir lipid membrana iyon kanalı proteinleri eklemişlerdir.
Ardından bu kanallar, kanal aktivitesi üzerindeki etkilerini incelemek için acı biber türevli kapsaisin gibi deneysel moleküllere maruz bırakılabilir.
Ekstraselüler ortama açık oldukları ve hücresel fonksiyonu önemli ölçüde etkiledikleri için iyon kanalları mükemmel ilaç hedefleridir. Test bileşikleri mikropipete veya banyo çözeltilerine eklendiğinde, nikotin gibi ilaçların nöral aktivite üzerindeki etkisini doğrudan test etmek için patch clamp kayıtları kullanılabilir. Yüksek dirençli bir sızdırmazlık oluşturmak için negatif basınç uygulama prensibi, ilaç tarama uygulamaları için aynı anda çok sayıda hücreden kayıt alabilen yüksek verimli cihazların geliştirilmesinde bile kullanılmıştır.
Whole-cell patch clamp, tek hücrelerin uyarılara verdiği yanıtı ölçmek için değerli bir araçtır.
Ayrıca, nöron ateşlemesinin kas gibi uyarılabilir hedef hücreler üzerindeki etkisini araştırmak için eşli kayıtlar (paired recordings) kullanılabilir. Bu örnekte, bir motor nöronun ateşlenmesini uyarmak için whole-cell patch clamp kullanılırken, aynı anda kontrol ettiği kas lifinden kayıtlar alınmaktadır. Nöral eksitasyon ile kas aktivitesi arasında net ilişkiler gözlemlenmektedir.
Tekniğin temel ilkelerinin ve bir deneyin yürütülme basamaklarının gözden geçirildiği JoVE'nin patch clamp kaydına giriş videosunu izlediniz.
Voltaj ve akım değişikliklerine karşı sahip olduğu üstün zamansal hassasiyet ile patch clamp kaydı, kanalların ve nöronların biyofiziğinin anlaşılmasında etkili bir araç olmaya devam edecektir.
İzlediğiniz için teşekkürler!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the basic principle behind patch clamp recording?
Patch clamp recording isolates a small membrane patch containing ion channels by pressing a glass micropipette against a cell and forming a high-resistance seal. Scientists then use an electrode to clamp or control the electrical environment of the patched area, allowing precise measurement of how voltage changes affect ion flow through channels. This technique reveals the biophysical properties of ion channels that regulate neuronal activation.
Q2: How does a gigaohm seal form in patch clamp experiments?
A gigaohm seal forms when negative pressure is applied through a syringe to the micropipette, creating a high-resistance seal between the pipette tip and the cell membrane. The resistance increases rapidly to greater than 1 gigaohm, effectively isolating the membrane patch from background noise in the bath solution. This seal is critical for detecting small electrical currents from individual ion channels.
Q3: What are the main differences between whole-cell and cell-attached patch configurations?
In cell-attached configuration, the micropipette simply seals to an intact cell membrane, allowing study of channels in their native state. Whole-cell configuration ruptures the membrane within the micropipette to access the cell's interior, enabling measurement of total cellular currents. Whole-cell recording provides broader access to intracellular mechanisms and is commonly used for voltage-step protocols and current-voltage curve generation.
Q4: How does inside-out patch configuration expose the cytoplasmic side of ion channels?
Inside-out patch begins with a cell-attached seal, then the micropipette is pulled back quickly, ripping a piece of membrane away from the cell. This exposes the cytoplasmic surface of the channels to the bath solution, allowing researchers to apply experimental chemicals directly to the intracellular face of ion channels. This configuration is valuable for studying how cytoplasmic factors regulate channel activity.
Q5: What does a current-voltage curve reveal about ion channel function?
A current-voltage (IV) curve shows the voltage-dependence of current flowing through an ion channel, revealing at which voltages the channel opens or closes. Generated using a voltage-step protocol that steps the membrane potential through a series of different holding potentials, the IV curve provides insight into channel kinetics and selectivity. This data is essential for understanding how voltage-gated ion channels control neuronal excitability.
Q6: How is patch clamp recording used for drug screening and testing?
Test compounds can be added to the micropipette or bath solutions during patch clamp recording to directly measure drug effects on neural activity. For example, nicotine or other neuroactive compounds are applied while recording channel currents, revealing how drugs alter ion channel function. High-throughput devices based on the gigaohm seal principle now enable simultaneous recording from numerous cells for rapid drug screening applications.
Q7: What can paired whole-cell patch clamp recordings demonstrate about neuron-muscle interactions?
Paired recordings simultaneously stimulate firing of a motor neuron while recording responses from the muscle fiber it controls, revealing direct relationships between neuronal excitation and muscle activity. This approach, using primary neuronal cultures and electrophysiology techniques, demonstrates how action potentials in neurons translate into functional responses in target cells. Such experiments are crucial for understanding synaptic transmission and neuromuscular function.
Bu videodaki bölümler
0:00
Overview
1:04
Principles Behind Patch Clamping
3:20
Patch Clamp Configurations
4:43
Preparing Micropipettes and Forming a Seal
6:05
Whole-cell Patch Clamp Procedure
7:15
Applications
9:11
Summary