Name: Kemirgen Embriyonik retroviral Enfeksiyon Hematopoetik Farklılaşma Analizi için Hücre Türetilmiş embriyoidlerin Vücut Kök Hücreler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: Öğrenin, embriyonik kök hücrelerde retroviral enfeksiyon ve akış sitometrisi kullanarak hematopoietik farklılaşmayı nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, gen ekspresyonunun zamansal etkilerini hızlıca incelemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Indiana Üniversitesi Tıp Fakültesi Moleküler Hematolojide Mükemmeliyet Merkezi'nden (IUSM, NIDDK, 5P30DK090948) bir Pilot ve Fizibilite Hibeleri ile desteklenmiştir. IUSM'den bir Biyomedikal Geliştirme Hibesi ile ek finansman sağlandı. El yazması hakkında yorum yaptığı için Dr. Karen Cowden Dahl'a teşekkür ederiz.

1. embriyoidlerin Vücut (EB) Oluşumu <ol><li> Fare embriyo fibroblast (MEF&#39;ler) üzerinde muhafaza edilmiştir EKH jelatin adapte. Geçiş EKH MEFS çıkarmak için% 0.1 jelatin ile kaplanmış 6 gözlü doku kültür plakası üzerine 3 kez. <ol><li> (Tablo 1) farklılaşmamış hücreleri korumak için LİF ile ESC muhafaza ortamında hücrelerin büyümesine. Emin hücreler asla 80% izdiham aşan olun. Farklılaşması için hücrelerinden (MEF&#39;lerden çıkardıktan sonra 10 veya daha az pasajlar) düşük geçişini kullanın. </li></ol></li><li> EKH EB farklılaşması için kültürlenir önceki gün, hücreler, geçit böylece yaklaşık% 50-70 oranında konfluent ertesi gün olacaktır. Hücre pluripotensini korumak ESC bakım ortamı içinde kültürlenmesi devam edin. </li><li> 6-çukurlu levha başına: farklılaşması, aspirat ESC bakım ortamına ve günde 1 ml fosfat tamponlu salin (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, ve 11.9 mM fosfat tamponu, pH 7.4 PBS) ile yıkayın. <ol><li> 0.25% tryps 200 ul ekleyin/ her EDTA de ve 3 dakika süreyle 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Farklılaşma medya 800 ul tripsin / EDTA inaktive. Pipet yukarı ve aşağı P200 ucu ile 2 ml serolojik pipet yıkmak kadar hücreleri tek bir hücre süspansiyonu içine. Medya pipet ve uç arayüzü arasında yukarı gitmez yüzden P200 ucu ucuna rahatça oturduğundan emin olun. </li><li> Pipet yukarı ve aşağı yaklaşık 5-10 kez. Pipetle sırasında baloncuklar oluşturmak için özen gösterin. </li></ol></li><li> 15 ml konik tüp hücreleri aktarın. PBS ile 10 ml sesini getirin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 315 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı. Lif içeren Kalan ortamı çıkarmak için 5 ml PBS ile iki kez yıkayın. Her yıkamadan için adım 1.4 olarak santrifüj. <ol><li> Farklılaşma medya (Tablo 2), 2 ml nihai hücre topağı tekrar. </li></ol></li><li> Bir hemasitometre veya hücre sayacı ile hücrelerin sayısı ve 10 cm&#39;lik bir petri plakasında 6,000-10,000 hücre / ml plaka(Non-doku kültürü tedavi). <ol><li> Her ESC hattı için ampirik tam hücre / ml belirleyin. Normalde bakteri iş veya düşük yapışma plakaları için kullanılan steril Petri tabak kullanın. NOT: En iyi sonuçlar için farklılaşma, EBS plaka takmadan süspansiyon kalır küre oluşturmalıdır. Az bağlılıkla olanları bulmak için plakaların çeşitli markaları test edin. </li><li> % 5 CO2 içeren bir 37 ° C&#39;de doku kültürü inkübatörü içinde, ayırt EKH inkübe edin. </li></ol></li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col /><col span="2" /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Stok </td><td> Final Konsantrasyon </td><td> Cilt </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 1x </td><td></td><td> 410 ml </td><td> S<html> IGMA / Aldrich </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> FBS (ES Ekranlı) </td><td> 100% </td><td> % 15 </td><td> 75 mi </td><td> Hycione </td><td> SH30070.03E </td></tr><tr><td> Gerekli olmayan Amino Asitler </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 mi </td><td> Life Technologies </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 mi </td><td> Life Technologies </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> Penncillin / Streptomisin </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 mi </td><td> Life Technologies </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> β-mersaptoetanol </td><td> 14.3 M </td><td> 114 iM </td><td> 4 ul </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> M3148 </td></tr><tr><td> , Lösemi önleyici faktörü (LİF) </td><td> 10 7 ünite / ml </td><td> 1.000 adet / ml </td><td> 50 ul </td><td> Millipore </td><td> ESG1107 </td></tr></tbody></table>&quot;ontent&gt; Tablo 1: ESC Bakım Medya. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col /><col span="2" /><col /><col span="2" /></colgroup><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Stok </td><td> Final Konsantrasyon </td><td> Cilt </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 1x </td><td></td><td> 410 ml </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> FBS (Kullanıcı optimum farklılaşması için Ekranlı) </td><td> 100% </td><td> % 15 </td><td> 75 mi </td><td> Hycione </td><td> SH30070.03E </td></tr><tr><td> Gerekli olmayan Amino Asitler </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 mi </td><td> Life Technologies </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 mi </td><td> Yaşam Technolonolojiler </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> Penncillin / Streptomisin </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 mi </td><td> Life Technologies </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> β-mersaptoetanol </td><td> 14.3 M </td><td> 114 iM </td><td> 4 ul </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> M3148 </td></tr></tbody></table> Tablo 2: Farklılaşma Medya. Virüs Enfeksiyonu 2. hazırlanması EB Hücreler <ol><li> Arzu edilen gelişme aşamasında (2. gün ve 3. gün arasında), 15 ml konik bir tüp için 10 cm Petri için ikinci EBS aktarın. 5 ml PBS ile plaka yıkayın ve konik tüp yıkama ekleyin. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 315 xg&#39;de EBS Pelet. 5 ml PBS ile EB hücreleri yıkayın. </li><li> Çözülen hücre ayırma çözeltisi (kolajenolitik içeren proteolitik ve enzimlerin) 1 ml ilave edilir ve OCC ile 30 dakika bir 37 ° C su banyosunda tüpleri (veya inkübatör) yerleştirmek(flicking veya hafif vorteks itibaren) asional ajitasyon. </li><li> Farklılaşma medya 1 ml ilave edilir. Pipet yukarı ve aşağı P200 pipet ucu ile 2 ml pipetle. 30-60 dakika boyunca daha 37 ° C su banyosu içinde tüp yerleştirin. </li><li> 5 dakika boyunca 315 xg&#39;de hücreleri aşağı Spin ve PBS ile hücreleri yıkayın. </li></ol> 3. Virüs Enfeksiyonu <ol><li> Farklılaşma medya 1.5 ml süspansiyon hücreleri. 6 çukurlu bir doku kültür olmayan tedavi plaka hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> Vaktinden önce standart teknikler ile retrovirüsü hazırlayın. Viral titreye bağlı olarak hücrelere, viral süpernatanın 5-100 ul ekleyin. Bu EBS sonraki reform engeller gibi enfeksiyon geliştirmek için polybrene katmayın. </li><li> Oda sıcaklığında 90 dakika boyunca 2120 x g&#39;de santrifüj ile virüs hücreleri Spinoculate. </li></ol> 4. Asma Damlalar Viral Enfekte EB Hücreleri Farklılaşan <ol><li> I her çukuruna farklılaşma medya 2 ml ekleyinnfected EB hücre süspansiyonu. </li><li> Pipet multipipettors için steril bir tepkin madde rezervuarına enfekte İT hücre süspansiyonu, 3.5 ml. Sekiz 20 ul, 15-20 satırlar 15 cm&#39;lik Petri plakanın ters kapak üzerine damla Pipeti için multipipettor kullanın. </li><li> Petri levhasının alt yarısına steril PBS veya su ve 10 ml ilave edilir. Sonra Petri plaka üzerine düşer ve yeri ile kapağı ters çevirin. Damla odası nemlendirilmiş tutmak için baş aşağı PBS veya altında su ile kapak asılı emin olun. </li><li> % 5.0 CO2 ile 37 ° C doku kültürü inkübatörü içinde, yemekler yerleştirin. </li><li> 2 gün sonra, farklılaşma medya 4.5 ml, kapak ve yıkama üst edilerek damla asılı oluşan EBS toplar. <ol><li> Yeni bir 10 cm olmayan doku kültürü Petri plaka Transferi medya ve EBS. Farklılaşma medya ve 10 cm plaka transfer 3 ml ile bir kez daha kapağı yıkayın. </li></ol></li><li> Sitometrisi 8 olarak toplam akışı analizi için hücreler hasatfarklılaşma medya (-LIF) hücrelerin ilk transferi itibaren gün kültür. </li></ol> Akış Sitometresi Analizi 5. hazırlanması Hücreler <ol><li> 10 ml&#39;lik bir pipet ile 15 ml konik tüp hücreleri aktarın. 5 ml PBS ile plaka yıkayın ve aynı konik tüp transfer. </li><li> 315 x g Pelet hücreleri. 10 ml PBS ile pelet yıkayın. </li><li> Çözülen hücre ayırma çözeltisi 1 ml ilave edilir ve ara sıra çalkalanarak 30 dakika boyunca 37 ° C su banyosunda tüpleri. Bazı hücre yüzey antijenlerinin tespit edilmesi için, tripsin, bunun yerine kullanılabilir. </li><li> 1 ml farklılaşma medya ekleyin ve pipetlemeyin yukarı ve 2 ml pipet aşağı. Yardımcı olmak için pipet ucuna P200 ucu kullanın kırılma tek bir hücre süspansiyonu içine EB dijeste edilmiştir. <ol><li> Integral zar proteinleri, hücre yüzeyine geri dönüşüm için sırayla, 60 dakika boyunca daha 37 ° C su banyosu içinde tüp yerleştirin. </li></ol></li><li> 5 dakika boyunca 315 xg&#39;de hücrelerini pellet haline getirmek. </li><li> Hücreler, wi yıkayıninci% 0.1 Sığır Serum Albumin Fraksiyon PBS (IX PBS / BSA) içinde hazırlanmıştır V (BSA) ve belirli ile hücrelerin inkübe floresan etiketli antikorlar. </li></ol> Hematopoetik progenitörlerin 6. Sitometrisi Analizi <ol><li> 5 ml, 12 x 75 mm yuvarlak alt tüp içinde 10 6 EB türetilen hücreler yerleştirin. Tazminat sitometre ayarlarını akışını ayarlamak için, üretici talimatlarına göre tazminat boncuk kullanmayın. </li><li> 315 x g Pelet hücreleri. Tüp içinde kalan PBS / BSA çözeltisi içinde süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet kapalı dökün. </li><li> ÇIK HPC algılamak için, flüoresan etiketli antikorlar ile hücrelerin inkübe: anti-fare CD41-PE (R Phycoerytherin) ve anti-fare CD117 (cKit) -APC / Cy7 (alofikosiyanin Siyanin 7). <ol><li> 1 antikorları seyreltin PBS / BSA içinde 100. Her bir örnek için seyreltilmiş 100 ul antikor ekleyin. Her bir satıcı, klonlama ve çok ya da antikor için antikorun doğru seyreltme belirler. Hücreleri tek tek etiketlenmesi için optimal seyreltme belirleyin. </li&gt; </ol></li><li> 30 dakika daha karanlıkta buz üzerinde örnekleri inkübe edin. </li><li> 5 dakika boyunca 315 x g&#39;de 2 ml PBS / BSA ve topak hücrelere ilave edin. </li><li> Aspire yüzenler ve 300 ul PBS veya başka bir izotonik tampon içinde tekrar süspansiyon pelet. </li><li> Bir hücre süzgeç kapağı (0.35 mcM) aracılığıyla filtre süspanse edilen hücreler, büyük hücreli agrega kaldırmak için. </li><li> Bir akış sitometresindeki hücreleri analiz. </li></ol>

<ol><li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336, 684-687 (1988).</li>
<li>Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryoid+bodies%3A+an+in+vitro+model+of+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+physiology%22%5BJournal%5D)">Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis.</a> Experimental physiology. 85, 645-651 (2000).</li>
<li>Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiating+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies.</a> Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).</li>
<li>Tian, X., Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+towards+hematopoietic+cells%3A+progress+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells towards hematopoietic cells: progress and pitfalls.</a> Curr Opin Hematol. 15, 312-318 (2008).</li>
<li>Thomas, K. R., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+by+gene+targeting+in+mouse+embryo-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells.</a> Cell. 51, 503-512 (1987).</li>
<li>Mansour, S. L., Thomas, K. R., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+proto-oncogene+int-2+in+mouse+embryo-derived+stem+cells%3A+a+general+strategy+for+targeting+mutations+to+non-selectable+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes.</a> Nature. 336, 348-352 (1988).</li>
<li>Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-line+transmission+of+genes+introduced+into+cultured+pluripotential+cells+by+retroviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector.</a> Nature. 323, 445-448 (1986).</li>
<li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+expression+in+embryonic+stem+cells+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).</li>
<li>Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+by+lentiviral+vectors%3A+lack+of+gene+silencing+in+mammalian+embryonic+stem+cells+and+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 2140-2145 (2002).</li>
<li>Smith-Arica, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+efficiency+of+human+and+mouse+embryonic+stem+cells+using+adenoviral+and+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+and+stem+cells%22%5BJournal%5D)">Infection efficiency of human and mouse embryonic stem cells using adenoviral and adeno-associated viral vectors.</a> Cloning and stem cells. 5, 51-62 (2003).</li>
<li>Lakshmipathy, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transfection+of+embryonic+and+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Efficient transfection of embryonic and adult stem cells.</a> Stem Cells. 22, 531-543 (2004).</li>
<li>Cook, B. D., Liu, S., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad1+signaling+restricts+hematopoietic+potential+after+promoting+hemangioblast+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Smad1 signaling restricts hematopoietic potential after promoting hemangioblast commitment.</a> Blood. 117, 6489-6497 (2011).</li>
<li>Zafonte, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad1+expands+the+hemangioblast+population+within+a+limited+developmental+window%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Smad1 expands the hemangioblast population within a limited developmental window.</a> Blood. 109, 516-523 (2007).</li>
<li>Kyba, M., Perlingeiro, R. C., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HoxB4+confers+definitive+lymphoid-myeloid+engraftment+potential+on+embryonic+stem+cell+and+yolk+sac+hematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HoxB4 confers definitive lymphoid-myeloid engraftment potential on embryonic stem cell and yolk sac hematopoietic progenitors.</a> Cell. 109, 29-37 (2002).</li>
<li>Galvin, K. E., Travis, E. D., Yee, D., Magnuson, T., Vivian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+signaling+regulates+the+bone+morphogenic+protein+pluripotency+pathway+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nodal signaling regulates the bone morphogenic protein pluripotency pathway in mouse embryonic stem cells.</a> J Biol Chem. 285, 19747-19756 (2010).</li>
<li>Ismailoglu, I., Yeamans, G., Daley, G. Q., Perlingeiro, R. C., Kyba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesodermal+patterning+activity+of+SCL%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Mesodermal patterning activity of SCL.</a> Exp Hematol. 36, 1593-1603 (2008).</li>
<li>Kyba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+hematopoietic+differentiation+of+embryonic+stem+cells+conditionally+expressing+Stat5%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Enhanced hematopoietic differentiation of embryonic stem cells conditionally expressing Stat5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 11904-11910 (2003).</li>
<li>Cao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-23a+regulates+TGF-beta-induced+epithelial-mesenchymal+transition+by+targeting+E-cadherin+in+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">MiR-23a regulates TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transition by targeting E-cadherin in lung cancer cells.</a> Int J Oncol. 41, 869-875 (2012).</li>
<li>Chan, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+antagonism+between+PDGF+and+the+TGFbeta+family+of+signalling+pathways+by+control+of+miR-24+expression%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for antagonism between PDGF and the TGFbeta family of signalling pathways by control of miR-24 expression.</a> EMBO J. 29, 559-573 (2010).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+miR-23a+approximately+27a+approximately+24+decreases+transforming+growth+factor-beta-induced+tumor-suppressive+activities+in+human+hepatocellular+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Upregulation of miR-23a approximately 27a approximately 24 decreases transforming growth factor-beta-induced tumor-suppressive activities in human hepatocellular carcinoma cells.</a> Int J Cancer. 123, (2008).</li>
<li>Min, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-associated+miR-27a+inhibits+dendritic+cell-mediated+differentiation+of+Th1+and+Th17+cells+by+TAB3%2C+p38+MAPK%2C+MAP2K4+and+MAP2K7%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Immun%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-associated miR-27a inhibits dendritic cell-mediated differentiation of Th1 and Th17 cells by TAB3, p38 MAPK, MAP2K4 and MAP2K7.</a> Genes Immun. 13, 621-631 (2012).</li>
<li>Mikkola, H. K., Fujiwara, Y., Schlaeger, T. M., Traver, D., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+CD41+marks+the+initiation+of+definitive+hematopoiesis+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Expression of CD41 marks the initiation of definitive hematopoiesis in the mouse embryo.</a> Blood. 101, 508-516 (2003).</li>
<li>Mitjavila-Garcia, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+CD41+on+hematopoietic+progenitors+derived+from+embryonic+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression of CD41 on hematopoietic progenitors derived from embryonic hematopoietic cells.</a> Development. 129, 2003-2013 (2002).</li>
<li>Warr, M. R., Pietras, E. M., Passegue, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+controlling+hematopoietic+stem+cell+functions+during+normal+hematopoiesis+and+hematological+malignancies.+Wiley+interdisciplinary+reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Systems+biology+and+medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanisms controlling hematopoietic stem cell functions during normal hematopoiesis and hematological malignancies. Wiley interdisciplinary reviews.</a> Systems biology and medicine. 3, 681-701 (2011).</li>
<li>Dahl, R., Ramirez-Bergeron, D. L., Rao, S., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spi-B+can+functionally+replace+PU.1+in+myeloid+but+not+lymphoid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Spi-B can functionally replace PU.1 in myeloid but not lymphoid development.</a> Embo J. 21, 2220-2230 (2002).</li>
<li>Dahl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+macrophage+and+neutrophil+cell+fates+by+the+PU.1%3AC%2FEBPalpha+ratio+and+granulocyte+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of macrophage and neutrophil cell fates by the PU.1:C/EBPalpha ratio and granulocyte colony-stimulating factor.</a> Nat Immunol. 4, 1029-1036 (2003).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa rakip mali çıkarlarını hiçbir var.

Yukarıda ele alındığı gibi, ilgi konusu bir indüklenebilir gen ifade ÇIK klon doksisiklin sistemler kullanılarak elde edilebilir, bununla birlikte, bu satırların kuşak zaman alıcı ve emek yoğundur. Bu protokolde tarif EBS türetilmiş ESC hazırlanan tek hücre süspansiyonu ilgi konusu bir geni ifade etmek için bir yöntemdir. Bu enfekte olmuş hücreler, daha sonra, sonraki farklılaşma incelemek asılı damla ile EBS olarak yenilenmiş. Örnekte (Şekil 3), bu farklılaşma 3. günde sentezlendiklerinde mirn23a</...

Murin embriyonik kök hücreleri (ESC'ler) pluripotenttir, sitokin Lösemi İnhibitör Faktörü (LIF) varlığında farklılaşmamış ve kendini yeniler1. LIF çekildikten sonra, kendiliğinden embriyoid cisimler (EB'ler) adı verilen 3 boyutlu (3D) yapılara farklılaşırlar2. 3D mimari, ektoderm, endoderm ve mezoderm olmak üzere üç germ katmanının geliştirilmesine izin verir ve bunlar daha sonra olgun doku tipleri3'e yol açar. ESC'ler, özellikle erken hematopoietik progenitör hücrelerin (HPC'ler) gelişiminin araştırılması olmak üzere, hücresel farklılaşmanın moleküler mekanizmalarını aydınlatmak için istisnai bir modeldir4. 
ESC'lerdeki gen ekspresyonu, gelişimdeki tek tek moleküller için bir rolün belirlenmesine izin veren çeşitli tekniklerle manipüle edilebilir. En yaygın tekniklerden biri, ilgilenilen bir geni olmayan ESC hatları oluşturmak için homolog rekombinasyon kullanmaktır5,6. Genleri aşırı eksprese etmek için kullanılan bir dizi teknik de vardır. ESC'lerde gen ekspresyonunu değiştirmek için kullanılan ilk teknik, onları rekombinant retrovirüsler7,8 ile enfekte etmekti. Bununla birlikte, ilgilenilen gen, ESC'ler progenitör ve olgun hücre tiplerine farklılaştıkça sıklıkla susturulur. Lentivirüslerin kullanımı, viral olarak eksprese edilen genlerin susturulmasını sınırlamada başarılı olmuştur9. Aşırı ekspresyon için kullanılan diğer viral vektörler arasında adenovirüs ve adeno-ilişkili virüs10 bulunur. Ek olarak, ekspresyon plazmitlerini stabil bir şekilde tanıtmak için standart transfeksiyon teknikleri, ESC transgen ekspresyonu11 için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu sistemlerle ilgili bir zorluk, genellikle belirli bir genin ifadesinin, zamansal ifadesine bağlı olarak farklı etkilere sahip olmasıdır. Örneğin, Smad1 proteini, EB gelişiminin farklı aşamalarında hematopoietik hücrelerin gelişimini farklı şekilde etkiler12,13. 
Bu sorun, ilgilenilen bir geni indüklenebilir şekilde ifade eden ESC'lerin üretilmesiyle aşılabilir. ESC'lerde transgenleri indüklenebilir şekilde ifade etmek için en yaygın sistem, E. Coli'den (Escherichia coli) tetrasiklin direnç operonunu kullanır. Birkaç farklı tetrasiklin sistemi geliştirilmiştir. En popüler stratejilerden biri Kyba ve meslektaşları14 tarafından geliştirildi. Yapısal olarak aktif ROSA26 lokusuna yerleştirilmiş ters tetrasiklin transaktivatör genine sahip bir ESC hattı (Ainv15) ürettiler. X kromozomu üzerindeki HPRT (Hipoksantin-guanin fosforibosiltransferaz) lokusuna bir tetrasiklin yanıt elemanı (TRE), bir aşağı akış LoxP bölgesi (bakteriyofaj P1'den X-over P1 lokusu) ve bir promotörsüz neomisin kaseti sokuldu. Bir CRE rekombinasyon yaklaşımı kullanılarak, neomisin direnç geninin ekspresyonunu yönlendirmek için ökaryotik bir promotör ile birlikte ilgilenilen bir gen LoxP bölgesine yerleştirilebilir. Doğru hedeflenen ESC'ler G418 seçimi ile izole edilir. Bu hedeflenen klonlar daha sonra transgenin doksisiklin (veya tetrasiklin) ile indüklenebilir ekspresyonu için test edilmelidir. Bu yaklaşım, HoxB4, Stat5, SCL ve Smad714-17'yi indüklenebilir şekilde ifade eden ESC hatlarını başarıyla oluşturmuştur. Bununla birlikte, bu indüklenebilir hücre hatlarının oluşturulması zaman alıcıdır. Burada tarif edilen, ESC'den türetilmiş embriyoid cisimciklerini (EB'ler) tek hücreli süspansiyonlara ayırmak, hücre süspansiyonlarını farklı gelişim günlerinde retroviral olarak enfekte etmek ve daha sonra EB'leri damla asarak yeniden şekillendirmek için bir yöntemdir. Aşağı akış farklılaşması daha sonra akış sitometrisi ile değerlendirilir. Bu makalede, EB'den türetilmiş hücrelerde miRNA ekspresyonunun hematopoietik farklılaşmayı nasıl etkilediğine dair bir örnek gösterilmiştir. Bu yöntem, spesifik germ tabakası dokusu türetildikten sonra genlerin rolünü araştırmak için yararlıdır.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma / Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr> <tr><td>& # 946; -merkaptoetanol</td><td>Sigma / Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>FBS (ES Ekranlı)</td> <td>Hyclone</td><td>SH30070.03E</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Tanımlı)</td> <td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel Olmayan Amino Asitler</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Hayat Teknolojiler</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin/EDTA</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>LIF ESGRO</td><td>Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>ACCUMAX</td><td>Millipore</td><td>SCR006</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin/EDTA</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Doku Kültürü Plakaları 6- kuyu</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Falcon İşlenmemiş Plakalar 6 kuyulu</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-49</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Petri kabı 10 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Petri kabı 15 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-148</td><td></td></tr><tr><td>Şahin Tüpü 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-11A</td><td></td></tr><tr><td>Şahin Tüpü 5 Hücre Süzgeç Kapaklı ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-23</td><td></td></tr><tr><td>Beyaz steril resevoirs</td><td>U.S.A. Scientific</td><td>111-0700</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan anti-fare CD41 PE konjuge</td><td>Biolegend</td><td>133906</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan anti-fare CD117 APC / CY7-konjuge</td><td>Biolegend</td><td>105826</td><td></td></tr><tr><td>RW4 ESC'ler</td><td>ATCC</td><td>CRL-12418</td><td></td></tr></tbody></table>

kemirgen embriyonik retroviral enfeksiyon hematopoetik farklılaşma analizi için hücre türetilmiş embriyoidlerin vücut kök hücreler

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embriyonik kök hücreler (ESC'ler), hücresel farklılaşmanın moleküler mekanizmalarını aydınlatmak için olağanüstü bir modeldir. Erken hematopoietik progenitör hücrelerin (HPC'ler) gelişimini araştırmak için özellikle yararlıdırlar. ESC'lerdeki gen ekspresyonu, bireysel moleküllerin gelişimdeki rolünün belirlenmesine izin veren çeşitli tekniklerle manipüle edilebilir. Bir zorluk, belirli genlerin ekspresyonunun genellikle zamansal ifadelerine bağlı olarak farklı fenotipik etkilere sahip olmasıdır. Bu sorun, doksisiklin ile indüklenebilen transgen sistemi gibi teknolojiyi kullanarak ilgilenilen bir geni indüklenebilir şekilde ifade eden ESC'lerin üretilmesiyle aşılabilir. Bununla birlikte, bu indüklenebilir hücre hatlarının üretilmesi maliyetli ve zaman alıcıdır. Burada açıklanan, ESC'den türetilmiş embriyoid cisimciklerini (EB'ler) tek hücreli süspansiyonlara ayırmak, hücre süspansiyonlarını retroviral olarak enfekte etmek ve daha sonra EB'leri damla asarak yeniden biçimlendirmek için bir yöntemdir. Aşağı akış farklılaşması daha sonra akış sitometrisi ile değerlendirilir. Bu protokol kullanılarak, ESC farklılaşmasının başlangıcında bir mikroRNA geninin eksojen ekspresyonunun HPC oluşumunu engellediği gösterilmiştir. Bununla birlikte, yeni ortaya çıkan mezoderm üretildikten sonra EB'den türetilmiş hücrelerde eksprese edildiğinde, mikroRNA geni hematopoietik farklılaşmayı arttırır. Bu yöntem, spesifik germ tabakası dokusu türetildikten sonra genlerin rolünü araştırmak için yararlıdır.

RW4 jelatinize Bu çalışmalarda kullanılmıştır EKH (129X1 / SVJ fare suşundan). EBS farklılaşma 3 gün sonra izole edilmiştir. En iyi sonuçlar için EBS küresel ve yapışkan olmayan (Şekil 1A, B) olmalıdır. Virüs, ilgili gen ile birlikte GFP floresan markörü ile birlikte ifade spinoculation sonra EBS olarak asılı damla yöntemiyle ıslah edilmiştir. EBS başarılı 2.0, 2.5, ve 3.0 gün EBS hazırlanan hücre süspansiyonları ıslah edilmiştir. Ancak, EBS günden 4,0 EBS hazırlanan hücre süspansiyonları reform olamazd...

Embriyonik kök hücrelerin (ESC'ler) farklılaşmasında zamansal gen ekspresyonunun manipüle edilmesi, indüklenebilir gen sistemleri kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, bu hücre hatlarının oluşturulması maliyetli ve zaman alıcıdır. Bu protokol, ES'den türetilmiş hücrelerin ayırt edilmesinde bir transgenin hızlı ekspresyonunu ve ardından aşağı akış hematopoietik farklılaşmasının analizini sağlar.

Kemirgen Embriyonik retroviral Enfeksiyon Hematopoetik Farklılaşma Analizi için Hücre Türetilmiş embriyoidlerin Vücut Kök Hücreler

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Bu prosedürün genel amacı, embriyonik kök hücrelerin farklılaşması sırasında bir genin farklı zamanlarda ekspresyonunun hematopoietik farklılaşmayı nasıl etkilediğini incelemektir. Embriyo gövdesinin transdüksiyonunu takiben, santrifüjleme ile tek hücre süspansiyonu embriyo gövdeleri, hematopoietik hücrelere daha fazla farklılaşmaya izin vermek için asılı damla ile yeniden şekillendirilir ve kültürlenir. Daha sonra, yeniden oluşturulmuş embriyo cisimciklerinin tek hücreli süspansiyonları hazırlanır, florokrom konjuge antikorlarla inkübe edilir ve hematopoietik farklılaşma için bir akış sitometresinde analiz edilir.Sonuç olarak, bu yöntem, embriyonik kök hücre farklılaşması sırasında bir genin ekspresyonunun hematopoietik gelişimi etkileyip etkilemediğini gösterir. Özellikle, yalnızca erken embriyonik dokunun oluşumunu takiben aktif olabilen genlerin rollerini göstermek için yararlıdır. Bu nedenle, embriyonik kök hücre farklılaşması sırasında farklı zamanlarda maceracı bir geni ifade etmek için yaygın teknikler, embriyonik kök hücre dizilerinin oluşturulmasını gerektirir ve doksisiklin gibi indükleyicilerle ilgilenilen bir geni indüklenebilir.Bu hatların oluşturulması zaman alıcı ol

retroviral-infection-murine-embryonic-stem-cell-derived-embryoid-body

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol detayları fare embriyonik kök hücreler (ESC) ve ölümcül ışınlanmış alıcı farelere sonraki enjeksiyon transplante hematopoietik kök hücre türetme. Kısaca ESC embriyoid organları, sonra retroviral HoxB4 ve OP9 stromal hücreler ve hematopoetik sitokinlerin birlikte kültürlü ile enfekte olarak ayırt edilirler.

Murin Embriyonik Kök Hücre Hematopoetik Kök Hücre türetilmesi

Lentiviral aracılı demonte sırasında Ex vivo İnsan Hematopoetik Kök Hücre Eritropoiesis

Sitometrisi kemik iliği hematopoietik öncü dağıtımı yanı sıra verimli yalıtmak için son derece saf hematopoetik kök hücreleri (HKH'ler) analiz etmek için bir yöntem tarif edilir. İzolasyon ^ işleminde esas olarak hücresel ve moleküler çalışmalar için HKH'ler arındırmak için sıralama c-Kit + hücreleri ve hücre manyetik zenginleştirme dayanmaktadır.

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

Bu protokol, HIV enfeksiyonuna karşı kök hücre tabanlı tasarlanmış bağışıklığa sahip insanlaştırılmış bir kemik iliği/karaciğer/timus fare modeli oluşturma yöntemlerini açıklar.

Insanlaşmış Fare Modelinde HIV enfeksiyonuna karşı kök hücre Tabanlı Engineered Bağışıklık

Hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPC) henüz küçük bazı endotel hücreleri kan yapıcı olmaya belirtmek hangi işlemi hakkında bilinen, gelişim sırasında uzman (hemogenic) endotel hücreleri kaynaklanıyor. Bu fare embriyonik dokulardan hemogenic endotel hücreleri ve HSPC eşzamanlı izolasyonu sağlayan bir akış-sitometri göre bir yöntem ortaya koymaktadır.

Fare Embriyonik Hemogenic endotel hücrelerinin izolasyonu

Tek bir T hücre reseptörü (TCR) retroviral tabanlı in vivo ekspresyon sistemi için hızlı ve esnek bir protokol sunuyoruz.  Retroviral vektörler, TCR transgenik farelere alternatif olarak in vivo olarak tek bir TCR'nin T hücresi gelişimini ve işlevini incelemek için kemik iliği progenitör hücrelerini dönüştürmek için kullanılır.

Kemik iliği projenitör hücrelerinin retroviral İletimi T-hücre reseptör Retrogenic fareler üretmek için

Burada açıklanan protokol, minimal bir transkripsiyon faktörü setinin aşırı ekspresyonu yoluyla fare embriyonik fibroblastlarında bir hemojenik programın indüksiyonunu detaylandırır. Bu teknoloji, hematopoez, hematolojik hastalık ve hematopoietik kök hücre nakli ile ilgili gelecekteki çalışmalar için platformlar sağlamak üzere insan sistemine çevrilebilir.

Transkripsiyon Faktörleri ile fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama bir Hemogenic Programı tetikleyebilecek

İki ya da üç boyutlu bir embriyoit gövdeleri oluşturmak için fare embriyonik kök hücreleri kullanılarak bir tekniği açıklar. Daha sonra progenitör hücre işaretleyici immünofloresan ve immün farklılaşma hallerindeki analiz retinoik asit ve ne göre embriyoit vücut hücrelerinin sinir farklılaşmasını uyarmak üzere açıklar.

İki ve Üç boyutlu Embriyoid Oluşumu Fare Embriyonik Kök Hücreler Retinoik Asit kaynaklı sinir Farklılaşma analizi

Hematopoetik kök ve ata hücrelerinin (HSPC) CRISPR/Cas9 sistemi tarafından hematopoetik sisteme özgü gen modifikasyonları ile fare model sistemlerini hızla geliştirmek için yüksek verimli genom düzenlemesi için protokoller tanımlanmıştır.

Hastalık Modellerinde Hematopoetik Hücrelerin İncelemi için Lentiviral CRISPR/Cas9-Aracılı Genom Düzenleme

Burada sunulan kök hücre kaynaklı viral antijen (Ag) özgü T lenfositlerin benimseyen hücre transferi (ACT) kullanarak farelerde hepatit B virüsü (HBV) replikasyonu nun etkin bastırılması için bir protokoldür. Bu işlem HBV enfeksiyonunun act tabanlı potansiyel immünoterapisi için uyarlanabilir.

Kök Hücre Kaynaklı Viral Ag-Spesifik T Lenfositler Farelerde HBV Replikasyonlarını Baskılar

Burada in vivo B-1a hücre göçve lokalizasyonu incelemek için retroviral aşırı ekspresyon ve murine B-1a hücrelerinin benimsenen transferi için bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokol, donör B-1a hücre lokalizasyonunun niceliği veya donör hücre kaynaklı salgılanan faktörlerin benimsenme sonrası salgılanan faktörlerin analizi de dahil olmak üzere çeşitli downstream fonksiyonel tahliller için uzatılabilir.

Murine B-1a Hücrelerinde CXCR4'ün Retroviral Aşırı Ekspresyonu ve Hedeflenen B-1a Hücre Nakliiçin Kemik İliği ve IgM Üretimine Geçişinde Benimsenmiş Transfer

Öğrenin, embriyonik kök hücrelerde retroviral enfeksiyon ve akış sitometrisi kullanarak hematopoietik farklılaşmayı nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, gen ekspresyonunun zamansal etkilerini hızlıca incelemenizi sağlar.

Kemirgen Embriyonik retroviral Enfeksiyon Hematopoetik Farklılaşma Analizi için Hücre Türetilmiş embriyoidlerin Vücut Kök Hücreler (Video) | JoVE Journal

Kemirgen Embriyonik retroviral Enfeksiyon Hematopoetik Farklılaşma Analizi için Hücre Türetilmiş embriyoidlerin Vücut Kök Hücreler

Daha fazla video keşfet