Name: Içinde Neurovascular Yaptırma Analizi Entorhino-hipokampal Organotipik Dilim Kültürler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Öğrenin entorhino-hipokampal organotipik dilim kültürlerinde iskemik beyin hasarında nörovasküler analiz yöntemini. Bu teknik, nöron sağkalımı ve damsal değişiklikleri aynı anda inceleyerek hasar mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Basel Üniversitesi, Biyomedikal Bölümü ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (31003A_141007) tarafından desteklenmiştir. Markus Saxer teknik destek sağladı.

Hayvan deneyleri 22 Eylül 2010 tarihli Avrupa Toplulukları Konsey Direktifine uygun olarak yürütülmüştür (2010/63 / AB) ve gözden ve İsviçreli yetkililer tarafından izin verildi. 1. Organotipik Entorhino-hipokampal Dilim Kültürler kurma <ol><li> Statik kuluçka yöntemi 4,11 kullanarak doğum sonrası güne 4 (P4) fare yavrularından entorhino-hipokampal organotipik dilim kültürleri (EHOSCs) hazırlayın. Burada, C57Bl6 ve CB6F1 fareler kullanır. <ol><li> Örneğin dilim kültürlerinin hazırlanması için yavru fare başına yaklaşık olarak 30 dakika, 6 fare yavrular bir çöp 3 saat al. Steril cerrahi aletler ile bir laminer akış tezgah steril koşullar altında tüm adımları uygulayın. </li><li> Septorinoplastiyi zamansal ekseni boyunca dilimin konumundan muhtemel müdahaleyi önlemek için, yalnızca hipokampal septal yarısı dilim kullanır. Aksi belirtilmediği sürece, oda sıcaklığında tüm adımları gerçekleştirmek. </li></ol></li><li> T kestiO cerrahi makas ile bir P4 fare yavru kafa. Resim anestezi Bu aşama için gereklidir. <ol><li> Beyin çevresinde kafatası çıkarın ve hemisferdeki ve orta beyinin kaudal ucu arasındaki fissür tespit. Dikkatle kafatasından orta beyin beynin rostral bir kısmını çıkarmak ve L-glutamin, stabilize edilmiş bir formu ile takviye edilmiş MEM oluşan buzla soğutulmuş Müstahzar ortamda yerleştirin. </li></ol></li><li> Beyin, buz gibi hazırlama ortamına daldırılmış edilir bir stereo mikroskop altında diseksiyon devam edin. Kortikal hemisferden kalan meninks çıkarın. Yarımkürenin orta kaudal yüzeyinde hipokampus belirlenmesi ve beynin geri kalanından komşu entorhinal korteks ile birlikte ayırın. <ol><li> Bir doku helikoptere doku aktarın ve hipokampus septorinoplastiyi-zamansal eksene aseptik koşullar altında çaprazlama 400 mikron kalınlığında dilimler kesilir. </li></ol></li><li> Ce üzerinde dilimlerini yerleştirinll kültür ekleri (yaklaşık 6 uç başına dilim) ve inkübasyon ortamının (47 mi, MEM, 25 mi Eagle Medium, oyuk başına 1 mi, 25 mi at serumu, bir 1 ml Glutamax I, 1 ml &#39;si ile 6-yuvalı plakalar içinde inkübe bunları 37 ° C&#39;de% 5 CO2 ile nemli bir atmosferde ve steril% 10 glükoz çözeltisi, pH 7.3). Konusu orta ertesi gün ve 1 hafta sonra her gün yukarı değiştirin. </li></ol> REPERFÜZYONUNDA Vitro Hipokside 2. ve Oksijen-glukoz Yoksunluk <ol><li> Prosedürün tam bir zaman çizelgesi için Tablo 1&#39;e bakınız. Hipoksi ve OGD&#39;ye maruz bırakılmadan önce 5 gün boyunca (DIV5) için kültür EHOSCs. Bu zaman noktasında, aşağıdaki bileşim ile serum içermeyen ortam,% 25 at serumu ihtiva eden inkübasyon ortamından orta geçiş: Neuro temelli vasat% 2 B27 takviyesi,% 1 Glutamax ve ilave% 0.1 glukoz ile birlikte. </li><li> Referans 7 bileşenlerin .The son konsantrasyonları ayrıntılı olarak aşağıdaki gibi olacaktır OGD ortamı hazırlayın: 0.3mM CaCl2, 70 mM NaCI, 5.25 mM NaHCO 3, 70 mM KCI, pH 6.8, 1.25 mM NaH 2 PO 4, 2 mM MgSO 4 ve 10 mM sukroz. Iki adet 6 oyuklu doku kültür plakalarının her bir oyuğuna OGD, ortamın 1 ml ilave edilir. <ol><li> Hipoksi bir odasında 1 saat süreyle N2 ile OGD, orta serpmek ve daha sonra sızdırmaz hale getirir ve tutmak O / 37 ° C&#39;de bir kuluçka K. </li><li> Hipoksik göstergeleri olarak anaerobik şeritler kullanın. Şeritlerin rengi beyaz pembeden değiştirildiğinde oksijensiz ortama düşünün. </li><li> Hypoxia, yerine OGD, ortamın glikoz ile serumsuz ortamı kullanmaktadır. Kullanmadan önce, OGD, orta kısmında anlatıldığı şekilde bir bölme hipoksi halinde N2 ile orta serpmek. </li></ol></li><li> Dilimleri OGD&#39;ye maruz kalan önce, 30 dakika süreyle N2 ile tekrar orta OGD, serpmek. 1 mg / ml propidyum iyodür (PI), 30 dakika boyunca dilimlerine (2 ug / ml &#39;lik son bir konsantrasyon için) oyuk başına çözeltisi ve seçmek, 2 uldeney için, sadece sağlıklı dilim PI pozitif hücrelerin düşük sayılar ile gösterildiği gibi. </li><li> . OGD maruz kalma ve reperfüzyon Şekil 1&#39;de gösterildiği zamanlamasını kullanın 15 dakika boyunca ya oksijen sadece (hipoksi) veya oksijen ve glikoz (OGD) dilimleri mahrum. <ol><li> Hipoksi ve OGD&#39;ye indüksiyonu için OGD ortamına dilim aktarmak ve hipoksi odası içinde 15 dakika için tutun. Kültürler, orta ve arka OGD düzenli ortamından açıldığında, insertin iki tarafında kalan tüm sıvı aspire emin olun. </li><li> Hipoksi ve OGD&#39;ye sonra, oksijenli serum barındırmayan ortam maddesi ile OGD, orta yerine ve kültürler,% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de normal inkübatörde serum barındırmayan ortam içinde 3, 24 veya 48 saat süre ile iyileşmelerine izin verilir. Hücre ölümü tespiti için tespit için önce yeniden PI ekleyin. </li></ol></li></ol> Entorhino-hipokampal Organotipik Dilim Kültürler 3. Farmakolojik Tedaviler <ol><li> Kültürfarmakolojik tedavilere maruz bırakılmadan önce, kuluçkalama ortamı içinde 5 gün (DIV5) e EHOSCs. Farmakolojik tedaviler sırasında veya hemen OGD&#39;ye dilim serumsuz ortama transfer zaman sonra OGD, ya başlatın. </li><li> OGD&#39;ye koruması için Tedaviler. <ol><li> OGD, 30 dakika boyunca, indüksiyondan sonra hemen 100 uM 6-siyano-7-nitrokuinoksalin-2,3-dion (CNQX) ya da (15 dk) OGD, indüksiyon sırasında kültür ortamına 1 uM Tetrodotoksin (TTX) veya ekleyin. Daha sonra, tespitten önce, 48 saat boyunca normoksik, serum barındırmayan ortam içinde inkübe edilir. </li></ol></li><li> Eksitotoksik ölüme indüksiyonu için tedaviler. <ol><li> Kuluçka ortamı anahtar kültürlerinde 5 gün sonra, 30 dakika boyunca 100 uM, (RS) -α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolepropiyonik asit (AMPA) içeren içermeyen ortam serum. </li><li> Aspirasyon (ekler üzerinde herhangi bir kalıntı orta kaldırmak için özen) tarafından AMPA içeren kültür ortamı çıkarın, sonra da normal serum serbest orta ve taze plakaları dilim aktarmakfiksasyon kadar 48 saat boyunca saklayın. </li></ol></li></ol> 4. Fiksasyon ve immün Entorhino-hipokampal Organotipik Dilim Kültürler <ol><li> Propidium iyodür (PI) boyama. <ol><li> 2 ug / ml &#39;lik bir konsantrasyonda canlı dilimlerin kültür ortamına PI, 30 dakika boyunca ilave edin. Floresan optik ile donatılan bir ters mikroskop ile canlı kültürler el ve daha fazla tedavi için dilim seçmek. Immünhistokimya ile birlikte PI boyama için, önce kültürlerin tespit PI boňaltılması 30 dakika ekleyin. </li></ol></li><li> Dilimleri Fiksasyon. <ol><li> 6-delikli plaka kültür Ortamı çıkarın ve her bir oyuğa taze hazırlanmış% 4 paraformaldehit (PFA), 3 ml ekleyin. Daha sonra, bir buzdolabı içinde 6 oyuklu plaka yerleştirilir ve 4 ° C&#39;de O / N düzeltin. </li><li> PFA çözüme ertesi gün çıkarın ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile dilimleri 3-4 kez yıkayın. </li></ol></li><li> Hücre kültürü i ikinci dilim uzaklaştırılmasınsert ve serbest yüzen bölümlerinin imünohistokimya için engelleme prosedürü. <ol><li> Dikkatlice ayırın ve boyutu 0 veya daha küçük bir sanat boya fırçası kullanılarak kültürü ekler gelen dilim çıkarın. (% 3 normal keçi serumu (NGS) ve 2% Triton-X100 ile PBS) ile bloke edici tampon ile doldurulmuş bir 96 gözenekli plakanın bir kuyuya her bir dilim aktarın. Orbital bir karıştırıcı ile sabit çalkalama altında, oda sıcaklığında 2 saat için bloke edici tampon dilimleri tutun. </li></ol></li><li> Dilim kültürlerin immün <ol><li> Etiketleme için kan damarları 1 bir seyreltme poliklonal anti-laminin kullanın: 200 PBS% 1 NGS ve% 0.5 Triton-X100 ihtiva eden. </li><li> PBS% 1 NGS ve% 0.5 Triton-X100 içeren 500: etiketleme nöronlar 1 bir seyreltme proteini 2 (MAP2) ilgili anti-mikrotübül kullanın. </li><li> Sürekli çalkalama ile 4 ° C&#39;de 48 saat için primer antikorlar ile inkübe dilimleri. İnkübasyon süresinden sonra, 3-4 kez,% 0.5 Triton-X100 ile PBS ile yıkayın. </li&gt; <li> İkincil antikorlar 1 seyreltin: 500 PBS% 1 NGS ve% 0.5 Triton-X100 ihtiva eden. Alexa fluorofor konjüge sekonder antikor ile karanlıkta, oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe dilimleri. Alexa 350 veya 488 konjuge uygun keçi anti-tavşan veya keçi anti-fare ikincil antikoru kullanın. </li><li> Ikincil antikor çözeltisini çıkarın ve Tris-tamponlu tuzlu su (TBS) ile dilimleri üç defa yıkamak; cam slaytlar takar ve Mowiol ile slaytlar lamel. </li></ol></li><li> Lekelenmiş dilimlerin Mikroskopi </li><li> Epifloresans donanımları ile standart bir mikroskop veya bir konfokal mikroskop ile ya lekeli dilimleri gör. Uygun bir kamera ile çektiğiniz görüntüleri. Bazı görüntüler için, parlak arka planda koyu renkte boyalı gemileri elde etmek için floresan kontrast (Şekil 5 ve 6) ters çevirin. </li></ol> Kültürlerin Bölgesel Gemi Yoğunluk 5. Belirlenmesi <ol><li> Vesse niceliğiniReferans 8&#39;de tarif edildiği gibi kap geçişleri göre L. yoğunluğu. </li><li> Bu ölçümler için laminin lekeli dilimleri kullanın. Her grid kare başına 100 x 100 mikron, 0.25 mm 2 toplam alanına eşit bir 6 x 6 ızgara ile 10X büyütme Kayıtlı görüntüleri üst üste. </li><li> CA1, CA3, DG ve AK bölgede bindirme böyle üç ızgaraları (Şekil 2). Izgara çizgileri geçen gemileri saymak. </li><li> İyi bir istatistik alaka ile sonuç elde etmek için, fare yavru başına 3 dilim ile 3 fare yavrular, en az 3 bağımsız deneyde dahil her veri ölçümlerini yapmak. </li><li> Her bölge için ızgaralardan damar geçişlerinin ortalama değerini belirler ve uygun istatistik yazılımı kullanılarak (anlamlı olarak tanımlanan p &lt;0.05) post hoc test olarak Bonferroni düzeltmeli ANOVA ile istatistiksel analiz yapmak. </li></ol>

<ol><li>Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+science+of+cerebral+ischemia+and+the+quest+for+neuroprotection%3A+navigating+past+failure+to+future+success%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success.</a> J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).</li>
<li>Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+ischemic+stroke.+Part+two%3A+modeling+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Neurol+J%22%5BJournal%5D)">Animal models of ischemic stroke. Part two: modeling cerebral ischemia.</a> Open Neurol J. 4, 34-38 (2010).</li>
<li>Woodhams, P. L., Atkinson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+entorhino-dentate+projections+in+organotypic+slice+cultures%3A+mode+of+axonal+regrowth+and+effects+of+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Regeneration of entorhino-dentate projections in organotypic slice cultures: mode of axonal regrowth and effects of growth factors.</a> Exp Neurol. 140, 68-78 (1996).</li>
<li>Prang, P., Del Turco, D., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+entorhinal+fibers+in+mouse+slice+cultures+is+age+dependent+and+can+be+stimulated+by+NT-4%2C+GDNF%2C+and+modulators+of+G-proteins+and+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Regeneration of entorhinal fibers in mouse slice cultures is age dependent and can be stimulated by NT-4, GDNF, and modulators of G-proteins and protein kinase.</a> C. Exp Neurol. 169, 135-147 (2001).</li>
<li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+regeneration+of+intrinsic+spinal+cord+axons+in+a+novel+spinal+cord+slice+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model.</a> Eur J Neurosci. 27, 2483-2492 (2008).</li>
<li>Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+in+vitro+model+of+ischemia+based+on+hippocampal+slice+cultures+and+propidium+iodide+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Protoc%22%5BJournal%5D)">A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 4, 173-184 (1999).</li>
<li>Rytter, A., Cronberg, T., Asztély, F., Nemali, S., Wieloch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+hippocampal+organotypic+tissue+cultures+exposed+to+in+vitro+%E2%80%98ischemia%E2%80%99+show+selective+and+delayed+CA1+damage+that+is+aggravated+by+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Mouse hippocampal organotypic tissue cultures exposed to in vitro ‘ischemia’ show selective and delayed CA1 damage that is aggravated by glucose.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 23, 23-33 (2003).</li>
<li>Bendfeldt, K., Radojevic, V., Kapfhammer, J., Nitsch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+fibroblast+growth+factor+modulates+density+of+blood+vessels+and+preserves+tight+junctions+in+organotypic+cortical+cultures+of+mice%3A+a+new+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Basic fibroblast growth factor modulates density of blood vessels and preserves tight junctions in organotypic cortical cultures of mice: a new in vitro model of the blood-brain barrier.</a> J Neurosci. 27, 3260-3267 (2007).</li>
<li>Camenzind, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+transendothelial+glucose+transporter+1+and+P-glycoprotein+transporters+in+a+cortical+slice+culture+model+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Preservation of transendothelial glucose transporter 1 and P-glycoprotein transporters in a cortical slice culture model of the blood-brain barrier.</a> Neuroscience. 170, 361-371 (2010).</li>
<li>De Jong, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+hypoperfusion+yields+capillary+damage+in+the+hippocampal+CA1+area+that+correlates+with+spatial+memory+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cerebral hypoperfusion yields capillary damage in the hippocampal CA1 area that correlates with spatial memory impairment.</a> Neuroscience. 91, 203-210 (1999).</li>
<li>Cavaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+variation+in+brain+capillary+density+and+vascular+response+to+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Regional variation in brain capillary density and vascular response to ischemia.</a> Brain Res. 910, 81-93 (2001).</li>
<li>Chip, S., Nitsch, C., Wellmann, S., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subfield-specific+neurovascular+remodeling+in+the+entorhino-hippocampal-organotypic+slice+culture+as+a+response+to+oxygen-glucose+deprivation+and+excitotoxic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Subfield-specific neurovascular remodeling in the entorhino-hippocampal-organotypic slice culture as a response to oxygen-glucose deprivation and excitotoxic cell death.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33, 508-518 (2013).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
</ol>

Hayvan deneyleri 24 Kasım 1986 (86/609 / EEC) Avrupa Toplulukları Konsey Direktifine uygun olarak yürütülmüştür ve İsviçreli yetkililer tarafından yorumlanan ve izin verildi. Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada sunulan yöntemleri ile, hipokampal organotipik dilim kültürleri yaralanma sonrası nöral dokuda plastik değişiklikleri incelemek için çok yönlü bir araç olarak kullanılabilir. Organotipik kültürler dilim damar değişikliklerinin eş zamanlı çalışma yeni özelliğine 7, iskemi 6 nöronal reaksiyonların araştırılması için geçmişte kullanılan olsa da önemli ölçüde bu yöntemin potansiyel uygulamaları artırır. OGD&#39;ye ya da tek başına Hypoxia organotipik kesit kültürlerinde oldukça basit bir yöntem ...

Merkezi sinir sistemi, damar ile kayıp ya da oksijen ve glükoz stokunda azaltılmasına özellikle duyarlıdır. Beyne kan sağlayan bile çok kısa bir kesinti tipik inme sendromu yol, ilgili beyin alanlarında fonksiyonunun bir şekilde kaybolmasına neden olabilir. Birincil etkilenen bölgelerde nöron kaybına ek olarak, tipik olarak ikincil zararlar yoluyla ek geciktirilmiş nöron kaybı bulunmaktadır. Ne yazık ki, şu ana kadar ikincil nöronal ölümün azaltılması için bir nöro-koruyucu bir tedavi 1 kullanılabilir. Ikincil hasar mekanizmalarının incelenmesi için gösterilen araştırma çabaları arasında orta serebral arter oklüzyonu ve çeşitli trombotik oklüzyon teknikleri gibi serebral iskemi ile ilgili deneysel modellerinin kullanımına dayalı (güncel bir değerlendirme için bakınız 2). Buna paralel olarak,, aynı zamanda, sınırlama ve hayvan modellerinde, çeşitli merkezi sinir sistemi dokuların Organotipik kesit kültürünün kullanımı ile etik kaygılar Stu izin veren kullanılmıştıryaralanma 3-5 çeşitli tip nöronal reaksiyonların dy. Iskemik beyin yaralanmasının taklit koşullarda nöronal reaksiyonun incelenmesi için, oksijen glikoz yoksunluğu model sistem (OGD) geliştirilmiştir. Bu modelde, dilim kültürler geçici olarak glikoz yoksun ve oksijenin yokluğunda azot gazı ile dengeye getirilmiş olan bir ortama maruz bırakılır. Bu tür bir işlem ile, in vivo 6, 7 iskemik yaralanma sonrası gözlenen ile oldukça benzer nöronal yaralanma ve kaybını uyarmak mümkündür. Hipokampta, böyle bir tedavi olarak, özellikle CA1 nöronal kaybı uyarmaktadır ama CA3 alan veya hipokampus dentat girus. Bunun aksine, kesit kültürlerinde vasküler reaksiyonların Bu güne kadar geniş ele edilmemiştir. Bir belirgin bir neden dilim kültürü modelinde dolaşım ve kan damarı perfüzyon olmamasıdır. Bununla birlikte, bu B korumak mümkün olduğunu göstermiştikMSS lood gemiler 9, birkaç gün 8 kültürleri dilim. Bu yöntemin genel amacı OGD&#39;ye sonra nöronların kaderi izlemek, ancak yaralanma yanıtın önemli bir parçası olan damar kaderi ve biçimlenme çalışma genişletmek için değil sadece. Şimdiye kadar bu tür çalışmalar, hayvan deneylerinde kullanımını gerektirmiştir (. De Jong ve arkadaşları, 1999; Cavaglia ve diğerleri, 2001.). Protokol Burada yer olarak, bu tür çalışmalar, hipoksi ile birlikte ya da her ikisi nöronal hayatta kalma ve damar reaksiyonlarının analizi ile takip eksitotoksik lezyonlar ya meydan entorhino-hipokampal kesit kültürlerinde Organotipik detay yapılabilir nasıl. Bu protokol, bu konuda 10 önceden yayımlanan bir çalışmada dayanmaktadır ve MSS nörovasküler etkileşimleri ilgilenen herhangi bir laboratuvar için yararlı olabilir.

<table><tbody><tr><td>Minimum Esansiyel Orta MEM</td><td>Gibco</td><td>11012-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>stabilize edilmiş L-glutamin formu</td></tr><tr><td>Millicell hücre kültürü ekleri</td><td>Millipore PICM03050</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bazal ortam Eagle&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>41010-026</td><td></td></tr><tr><td>At serumu</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal ortam</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 takviyesi</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Anaerobik şeritler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59886</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iyodür çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>AMPA</td><td>R& D sistemleri</td><td>0169-10</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Ar-Ge D sistemleri</td><td>0190/10</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Ar-Ge D sistemleri</td><td>1078/1</td><td></td></tr><tr><td>poliklonal anti-laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393 & nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>anti-MAP2</td><td>Abcam</td><td>ab11267</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-fare 350</td><td>Moleküler Problar</td><td>A11045</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-fare 488</td><td>Moleküler Problar</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-tavşan 350</td><td>Moleküler Problar</td><td>A11046</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-tavşan 488</td><td>Moleküler Problar</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>İstatistik yazılımı</td><td>GraphPad Yazılımı</td><td>GraphPad Prizma</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain doku kıyıcı</td><td>Ted Pella</td><td>10180</td><td></td></tr><tr><td>Hipoksi odası</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td></td></tr></tbody></table>

içinde neurovascular yaptırma analizi entorhino-hipokampal organotipik dilim kültürler

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

İskemik beyin hasarı uygun beyin işlevini kaybetmesine en yaygın ve yıkıcı koşullar arasında ve genellikle etkilenen hastalarda fonksiyon kaybı devam eden yol açar. Yoğun araştırmalara rağmen, halen nöronal hasarı azaltır ve geciktirilmiş ikinci ölüm iskemik alanlarda nöronları korur hiçbir etkili bir tedavi seçeneği yoktur. Bu alanda yapılan araştırmalar, tipik olarak karmaşık ve sorunlu hayvan modellerinin kullanımını içerir. Oksijen ve glikoz mahrumiyet (OGD) ile meydan Entorhino-hipokampal organotipik dilim kültürleri serebral iskemi taklit in vitro modellerinde kurulmuştur. Bu çalışmada yeni veçhesi, beyin kan damarları ile karşılaştırılır değişiklikler korele edilebilir, nöronal ve nöronal değişiklikler bölmesi ve vasküler bölmesinin her iki reaksiyona ek olarak incelenmiştir olmasıdır. Bu protokol sunulan yöntemler ölçüde potansiyel uygulamalarını genişletmek veyaganotypic dilim kültür yaklaşım. OGD&#39;ye ya da tek başına Hypoxia organotipik kesit kültürlerinde oldukça basit bir yöntem ile uygulanabilir ve nöronal dokuda, güvenilir ve tekrarlanabilir bir hasara neden olabilir. Bu in vivo inme ve iskemi teşvik karmaşık ve sorunlu hayvan deneylerinde tezat olduğunu. Analizini genişleterek korumak ve beyin fonksiyonlarını geri nasıl yeni yollar sağlayabilir damar reaksiyonu çalışma dahil. Burada sunulan dilim kültür yaklaşımı iskemik beyin hasarının çalışma için cazip ve önemli bir araç haline olabilir ve nöro yönelik potansiyel terapötik önlemlerin test edilmesi için yararlı olabilir.

Oksijen glikoz yoksunluğu ve hipoksi hipokampal CA1 bölgesinde özellikle nöronal ölüm ve kan damarı azalmaya neden. Daha önce tarif edildiği gibi, 7 'e benzer hipokampus (Şekil 3) CA1 bölgesinde spesifik olarak, propidyum iyodür boyaması yolu ile görüldüğü gibi OGD, veya oksijen-yoksunluk sadece 15 dakika boyunca hücre ölümünün kuvvetli bir uyarımının neden olmuştur. Belirteçler kan damarlarının ağ görselleştirmek ile, damar yoğunluğu ve kurum CA1 bölgesinde hariç kültür çoğu bö...

Iskemik beyin hasarı birçok açıdan üreyen veriyor entorhino-hipokampal organotipik dilim kültürleri için bir protokol, sunulmuştur. Nöronlarda değişikliklere ek olarak neurovasculature değişiklikleri inceleyerek, bu protokol yaralanma sonrası nöral dokuda plastik değişiklikleri incelemek için çok yönlü bir araçtır.

Içinde Neurovascular Yaptırma Analizi Entorhino-hipokampal Organotipik Dilim Kültürler

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Bu prosedürün genel amacı, iskemik beyin hasarının bir doku kültürü modelinde nöronların ve kan damarlarının değişikliklerini aynı anda incelemektir. Bu, önce gergedan hipokampal dilim kültürlerine girerek gerçekleştirilir. İkinci adım, kültürleri hipoksik koşullara maruz bırakarak iskemik beyin hasarını taklit etmektir.Son adım, nöronal sağkalım ve vasküler değişiklikleri analiz etmek ve ilişkilendirmektir. Sonuç olarak, iskemik koşullar altında nöronlar ve vasküler sistem arasındaki karmaşık etkileşimleri göstermek için organik hipokampal dilim kültürlerine dayanan bir in vitro yaklaşım kullanılır. Bu tekniğin ana avantajı, hipoksik bir meydan okumadan sonra, nöronal sağkalım ve kan damarlarındaki değişikliklerin bir dilim kültür model sisteminde aynı anda incelenebilmesidir.Bu yöntem, nöronlar ve damar sistemi ile iskemik durumlar arasındaki karmaşık etkileşimleri ortaya çıkarmak gibi nöro iskemi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Başlamak için, hazırlanın, doğum sonrası gün formu fare poplarından gergedan hipokampal organotipik dilim kültürlerine girin. Kafatasını çıkardıktan sonra, serebral hemisferlerin kordal ucu ile orta beyin arasındaki çatlağı ta

the-analysis-neurovascular-remodeling-entorhino-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Organoptypic hipokampal kesit kültürü...

Nöronal Sakatlık incelenmesi için Organotipik Hipokampal Dilim Kültür Modeli

Biz diğer beyin bölgelerine kolayca adapte edilebilir Organotipik hipokampal dilim hazırlamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Beyin dilimlerini bir arayüz oluşturmak için izin gözenekli membranlar ve kültür ortamı üzerine koydu. Bu yöntem, kültür 2 hafta kadar hipokampus brüt mimarisi korur.

Organotipik Hipokampal Dilim Kültürler

Bu protokol, postnatal beyin ve rostral göçmen akışı neuroblast göç yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı görüntüleme için optimize edilmiş bir Organotipik dilim tahlil açıklamaktadır.

Doğum Sonrası Beyin Nöronal Göç Yüksek Çözünürlüklü Zaman Aşımı Görüntüleme için bir Organotipik Dilim Testi

Ön beyin ve beyincik dilim kültür sistemini kullanarak NG2 hücrelerini ve oligodendrositleri incelemek için bir teknik açıklanmıştır.  Bu yöntem, doku sitomimarisini korurken hücre dışı ortamın kolayca manipüle edilebildiği oligodendrosit soyu içindeki hücrelerin çoğalma ve farklılaşma dinamiklerinin incelenmesine izin verir.

Organotipik Dilim Kültürler Oligodendrosit Dinamikler ve miyelinasyonun incelemek için

Burada organotipik dilim kültür tekniği kullanılarak hipokampal doğum sonrası nöron incelemek için bir teknik tarif. Bu yöntem, yetişkin nöron in vitro müdahale edilebilmesini sağlar ve kültürlenmiş hipokampus farmakolojik maddelerin doğrudan uygulama için izin verir.

POSTNATAL nöron Çalışmaları için organotipik Dilim Kültürler

Organotypic Hipokampal dilim kültürler (OHSC) vivo durumu çok iyi taklit bir vitro modeli temsil. Burada biz vibratome tabanlı açıklar yüksek kaliteli dilimleri tümör hücreleri biyolojik davranışını veya yeni maddeler nöroprotektif potansiyelini değerlendirmek amacıyla elde etmek için iletişim kuralı Dilimleme geliştirilmiş.

Organotypic Hipokampal dilim kültürler çalışma Neuroprotection ve tümör hücrelerinin Invasiveness Model olarak

Bu protokol, radyal olarak göç eden kortikal nöronların doğrudan gözlenmesi için talimatlar sağlar. N utero elektroporasyonda, organotipik dilim kültürü ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme, göç eden nöronlardaki ilgi genlerinin aşırı ekspresyonunun veya downregülasyonunun etkilerini doğrudan ve dinamik olarak incelemek ve gelişme sırasındaki farklılaşmalarını analiz etmek için birleştirilir.

Embriyonik Fare Beyni Organotipik Dilim Kültüründe Nöronların Geçiş Sürekli Konfokal Görüntüleme Kullanımı<em&gt; Utero&#39;da</em&gt; Elektroporasyon

Yetişkin insan beyninden serbest yüzen dilim kültürleri hazırlamak için bir protokol sunulmaktadır. Protokol membran ekler kullanarak yaygın olarak kullanılan dilim kültür yönteminin bir varyasyonudur. Bu basit, maliyet-etkin, ve yaşilişkili beyin hastalıkları arkasında nörodejenerasyon mekanizmaları çözmek için amaçlayan kısa vadeli tahliller çalıştırmak için önerilir.

Yetişkin İnsan Beyninden Kısa Süreli Serbest Kayan Dilim Kültürleri

Fare ön beyninin organotipik dilim kültürlerinde genetik olarak kodlanmış FRET tabanlı sensör ATeam1.03YEMK'ın hücre tipi spesifik ekspresyonu için bir protokol tanımladık. Ayrıca, nöronlar ve astrositlerde hücresel ATP düzeylerinin dinamik görüntülemeiçin bu sensörünasıl kullanılacağını gösteriyoruz.

FRET tabanlı Sensör ATeam1.03YEMK kullanılarak Fare Beyninin Organotipik Doku Dilimlerinde Hücre İçi ATP'nin Görüntülenmesi

Burada, renal korteks-hipokampus organotipik dilimlerin hazırlanmasını anlatıyoruz. Serumun kademeli ve kontrollü yoksunluğu altında, bu dilimler gelişen epileptik benzeri olayları tasvir eder ve epileptogenezin ex vivo modeli olarak kabul edilebilir. Bu sistem, spontan aktivitenin dinamiklerini izlemek ve epileptogenez boyunca nöroinflamatuar özelliklerin ilerlemesini değerlendirmek için mükemmel bir aracı temsil eder.

Renal Korteks-Hipokampus Organotipik Dilim Kültürlerinde Epileptogenez Modeli

Bu yazıda, hücresel replasman tedavilerini test etmek için ex vivo bir model olarak nöral kök hücrelerle nakledilen uzun süreli omurilik organotipik dilimleri oluşturmak ve sürdürmek için tekrarlanabilir bir yöntem sunuyoruz.

Omurilik Yaralanmasında Hücre Transplantasyonunu Doğrulamak için Bir Platform Olarak Uzun Süreli Fare Omurilik Organotipik Dilim Kültürü

Öğrenin entorhino-hipokampal organotipik dilim kültürlerinde iskemik beyin hasarında nörovasküler analiz yöntemini. Bu teknik, nöron sağkalımı ve damsal değişiklikleri aynı anda inceleyerek hasar mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

Içinde Neurovascular Yaptırma Analizi Entorhino-hipokampal Organotipik Dilim Kültürler

Daha fazla video keşfet