Içinde Neurovascular Yaptırma Analizi Entorhino-hipokampal Organotipik Dilim Kültürler

Iskemik beyin hasarı birçok açıdan üreyen veriyor entorhino-hipokampal organotipik dilim kültürleri için bir protokol, sunulmuştur. Nöronlarda değişikliklere ek olarak neurovasculature değişiklikleri inceleyerek, bu protokol yaralanma sonrası nöral dokuda plastik değişiklikleri incelemek için çok yönlü bir araçtır.

Bu prosedürün genel amacı, iskemik beyin hasarının bir doku kültürü modelinde nöronların ve kan damarlarının değişikliklerini aynı anda incelemektir. Bu, önce gergedan hipokampal dilim kültürlerine girerek gerçekleştirilir. İkinci adım, kültürleri hipoksik koşullara maruz bırakarak iskemik beyin hasarını taklit etmektir.

Son adım, nöronal sağkalım ve vasküler değişiklikleri analiz etmek ve ilişkilendirmektir. Sonuç olarak, iskemik koşullar altında nöronlar ve vasküler sistem arasındaki karmaşık etkileşimleri göstermek için organik hipokampal dilim kültürlerine dayanan bir in vitro yaklaşım kullanılır. Bu tekniğin ana avantajı, hipoksik bir meydan okumadan sonra, nöronal sağkalım ve kan damarlarındaki değişikliklerin bir dilim kültür model sisteminde aynı anda incelenebilmesidir.

Bu yöntem, nöronlar ve damar sistemi ile iskemik durumlar arasındaki karmaşık etkileşimleri ortaya çıkarmak gibi nöro iskemi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Başlamak için, hazırlanın, doğum sonrası gün formu fare poplarından gergedan hipokampal organotipik dilim kültürlerine girin. Kafatasını çıkardıktan sonra, serebral hemisferlerin kordal ucu ile orta beyin arasındaki çatlağı tanımlayın.

Beyin rostralının orta beynin parçalarını dikkatlice çıkarın ve takviye edilmiş MEM'den oluşan buz gibi soğuk hazırlama ortamına yerleştirin. Diseksiyona stereo mikroskop altında devam edin ve beyni buz gibi soğuk hazırlama ortamına daldırın. Kalan meninksleri kortikal hemisferlerden çıkarın.

Daha sonra, hemisferin medial kordal yüzeyindeki hipokampusu tanımlayın ve onu beynin geri kalanından bitişik enter RH korteksi ile birlikte ayırın. Dokuyu bir doku kıyıcıya aktarın ve hipokampusun septal temporal eksenine enine 400 mikron kalınlığında dilimler kesin. Dilimleri hücre kültürü eklerine yerleştirin ve nemlendirilmiş bir atmosferde bir mililitre inkübasyon ortamı ile altı oyuklu plakada inkübe edin.

Ortamı ertesi gün ve ardından bir haftaya kadar iki günde bir değiştirin Ardından, OGD ortamını hazırlayın. İki altılık her kuyucuğa bir mililitre OGD ortamı ekleyin. Kuyu doku kültürü plakaları, OGG ortamını bir hipoksi odasında bir saat boyunca nitrojen ile perfüze eder ve gece boyunca mühürlemeden ve saklamadan önce 37 santigrat derecede bir inkübatörde, hipoksik göstergeler olarak anaerobik şeritler kullanın.

Şeritlerin rengi pembeden beyaza değiştiğinde ortamın oksijensiz olduğunu düşünün. Hazır olduğunda, propidyum iyodür veya PI boyama ile sağlıklı hücreleri seçin. Kültür ortamına mililitre başına iki mikrogram konsantrasyonda 30 dakika boyunca pi ekleyin.

Canlı kültürleri yalnızca floresan optiklerle donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskopla görüntüleyin. Burada gösterildiği gibi az sayıda etiketli hücreye sahip dilimler, burada gösterildiği gibi çok sayıda etiketli hücreye sahip daha fazla çalışma dilimi için seçilmelidir. OGD indüksiyonu için kullanılmamalıdır.

Dilimleri OGD ortamına aktarın ve hipoksi odasında 15 dakika bekletin, ekin yanlarında kalan tüm sıvıların anahtar kültürleri üzerinde aspire edildiğinden emin olun. Normal ortamdan OGD ortamına ve OGD'den sonra geri dönün, OGD ortamını oksijenli serum içermeyen ortamla değiştirin ve kültürlerin 3, 24 veya 48 saat boyunca iyileşmesine izin verin. Serum serbest ortamda, hücre ölümünün belirlenmesi için fiksasyondan önce tekrar pi ekleyin.

Çalışma farmakolojik tedaviler gerektiriyorsa, bunlara ya OGD sırasında ya da dilimler serumsuz olarak aktarıldıktan hemen sonra başlayın. PI boyama için ortam. İmmünohistokimya ile kombinasyon halinde, kültürlerin fiksasyonundan 30 dakika önce PI çözeltisini ekleyin.

Hücreleri gece boyunca sabitledikten sonra, PFA solüsyonunu çıkarın ve dilimleri üç ila dört kez yıkayın. PBS ile, dilimleri kültür eklerinden dikkatlice ayırarak ve bunları blokaj tamponu ile doldurulmuş 96 oyuklu bir plakanın kuyusuna aktararak blokaj prosedürüne başlayın. Dilimleri, bir orbital çalkalayıcı tarafından sürekli çalkalama altında oda sıcaklığında iki saat boyunca bloke edici tamponda tutun.

Tercih edilen birincil antikorları ekledikten sonra, inkübasyon süresinden sonra sürekli çalkalama ile dört santigrat derecede 48 saat inkübe edin. PBS'de %0,5 Triton X 103 ile dört kez yıkayın. Daha sonra, leke bölümlerini kapak kızakları ile cam slaytlara monte etmeden önce ikincil antikor boyunca standart prosedürleri izleyin.

Lekeli dilimleri epi floresan ekipmanlı standart bir mikroskopta veya konfokal mikroskopla görüntüleyin. Bazı görüntülerde, laminin için lekelenmiş dilimler kullanarak parlak bir arka plan üzerinde koyu lekeli damarlar elde etmek için floresan kontrastını ters çevirin. 10 x büyütme oranlı kaydedilmiş görüntüler, altıya altı ızgara kaplaması ile ca bir, CA üç DG ve DC bölgesinde bu tür üç ızgarayı kaplar.

Ve iyi istatistiksel alaka düzeyine sahip sonuçlar elde etmek için ızgara çizgilerini geçen gemileri sayın. Her biri, fare yavrusu başına üç dilim olan üç fare ponpuzundan elde edilen veriler de dahil olmak üzere en az üç bağımsız deneyden ölçümler alın. Kontrol kültürlerinin tedavi edilenlerle karşılaştırılması, hipoksinin hipokampusun yaklaşık bir bölgesinde nöronal ölüme ve kan damarı kaybına neden olduğunu ortaya koymaktadır.

Bu örneklerde, PI boyaması kırmızı olarak gösterilir ve hipoksi tedavisinden üç saat sonra yeşil laminin boyaması ile birleştirilir, görünür PI boyaması yoktur ve vasküler değişiklik belirgin değildir. 24 saat sonra PI lekelenmesi ortaya çıkar ve kan damarı kaybı da belirgindir. Hem PI lekelenmesi hem de kan damarı kaybı 48 saat sonra daha belirgin hale gelir.

OGD tek başına hem nöronal kayba hem de kan damarı kaybına neden olur. TTX veya CN QX'in bir uygulamasında, PI boyamasında görüldüğü gibi hem nöronal kayıp hem de 30 dakika boyunca 100 mikromolar A MPA ile laminin boyama tedavisi ile ortaya çıkan kan damarı kaybı, hipokampustaki çoğu alanda yaygın nöronal kayba neden oldu, ancak kan damarlarının kaybı CA bir alan ile sınırlı kaldı. Kan damarlarının nicelleştirilmesi, CA bir alanındaki seçici kaybı doğrular.

Bu işlemi takiben, etkili nöroprotektif ajanları tanımlamak ve vasküler yeniden şekillenme mekanizmalarını daha iyi anlamak için ilaç tedavileri veya genetik modifikasyonlar yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, intervenç hipokampus benzeri kültürlerin nasıl kurulacağını ve OGD'nin nasıl indükleneceğini ve ardından hem nöronal sağkalımın hem de vasküler değişikliklerin analizinin nasıl yapılacağını iyi anlamış olmalısınız.