Name: Fare Adrenal Kromafin Cell Hücre bağlı Kapasitans Ölçümler Yöntemleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Öğrenin fare adrenal kromafin hücrelerinde tek vezikül ekzositoz ve endositoz tespiti için hücre bağlı kapasitans ölçüm yöntemini. Bu teknik sinaptik iletim mekanizmalarını anlamaya katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, LWG'ye verilen Ulusal Bilim Vakfı ödülü (1145581) ile desteklenmektedir.

NOT: Chicago Illinois Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan tüm prosedür, Ulusal Sağlık Enstitüleri kurallarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. 1. Çözümleri ve Kültür Medya Hazırlıklar <ol><li> Altı aya kadar -20 ° C&#39;de tüm çözümleri tutun. 3 aya kadar 4 ° C &#39;de kültür ortamı tutun. </li><li> DMEM ile 100 ml ITSX (İnsülin-Transferrin-Selenyum takviyesi-) 1 Pen-strep çözeltisi ve 1 ml kültür ortamı karıştırılarak 100 ml hazırlayın. </li><li> DMEM, 250 mi, 100 mM CaCl2, 2.5 ml ve 50 mM EDTA, 2.5 ml enzim çözeltisi karıştırarak hazırlayın. </li><li> DMEM, 225 ml FBS, 25 ml, 625 mg albumin ve 625 mg tripsin inhibitörü karıştırılarak inaktivasyonu çözeltisi hazırlayın. </li><li> 154 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 5,0 mM HEPES, 3.6 mM NaHCO3, 5,6 mM glikoz, bir Locke çözeltisi hazırlayın. NaOH ile 7.3 pH ayarlayın. </li><li>50 mg / ml &#39;lik bir poli-D-lisin (PDL) çözeltisi hazırlayın. Kat lamelleri, 1 mg / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyon kullanın. </li><li> 140 mM NaCI, 5 mM KCI, 2 mM CaCI2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES-NaOH, 10 mM glukoz, hücre dışı bir çözelti hazırlayın. ~ 310 nmol / kg &#39;lık bir ozmolarite NaOH ile 7.3 pH ayarlayın. </li><li> 50 mM NaCI, 100 mM TEACl, 5 mM KCI, 2 mM CaCI2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, bir pipet çözeltisi hazırlayın. ~ 290 nmol / kg &#39;lık bir ozmolarite NaOH ile 7.3 pH ayarlayın. </li></ol> 2. Adrenal İzolasyon <ol><li> Büyük ve küçük diseksiyon makas ve forsepsle iki çift bir çift otoklava. Bütün bu işlemler sırasında eldiven giyin ve bir buz kovası diseksiyon tepsiye yerleştirin. </li><li> Gün, 0-3 alındığı fareler kullanır. Dekapitasyon basınçlı CO 2 tankı ile hayvan öldürülür. </li><li> Cervi&#39;de gelen omurga aşağıdaki yavru geri kesmek için makas küçük kümesi yararlanın<html> cal bölgeyi kaudale. Deri altında yüzeysel kesilir ve vücut boşluğuna delmek değil emin olun. </li><li> Sonraki uzak omurga soyma cilt bu kaslar omurga net bir görünümü var maruz böylece. Buradan, servikal spinal kord bir transectional kesim yapmak ve daha sonra omurga kenarları boyunca iki paralel kesim yapmak. </li><li> Hayvanın ana gövdesini tutan forseps bir çift, omuriliğe kapmak ve böbrekler maruz dek omurga geri soymak için forseps diğer çifti kullanın. </li><li> Bu noktada, böbreklerin üstüne böbreküstü bezleri görselleştirmek. Daha sonra dikkatli bir Locke çözeltisi ile doldurulmuş bir konik tüp içine her hayvandan iki bezi yerleştirin. NOT: Bazen bezleri forseps sadık olacaktır. Bu durumda, yavaşça Forseps ve Locke çözelti içine bezlerinin bertaraf edilmesine yardımcı olmak için başka bir çift forseps kullanır. Bezleri 2 saat kadar bu durumda muhafaza edilebilir. </li></ol>e &quot;&gt; 3. Doku sindirimi <ol><li> Bu arada, kabarcık, 15 dakika boyunca% 5 CO2 +% 95 O2 ile enzim solüsyonu kullanımdan önce. Dengelenmiş çözüm pembemsi / turuncu renk içine bir parlak pembe renk döner emin olun. </li><li> 20-25 ünite / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyonda taze olarak kabarcıklar halinde enzim çözeltisine papain ekleyin. , Papain ile enzim çözeltisi içerisinde 37 ° C&#39;de 40-60 dakika boyunca, her bir hayvandan bezlerinin her çift inkübe edin. </li><li> Her tüpe inaktivasyon çözeltisi% 75 ilave edildikten sonra 10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Bu inkübasyon papain enzim aktivitesini eylemsiz hale getirir. </li><li> Inaktivasyonu çözeltisi ile 10 dakika süreyle inkübe edildikten sonra, yavaşça yeni etiketli tüpe aktarın ve bezleri bezleri kültür ortamı ile 3 kez yıkayın. </li></ol> 4. Hücre Ayrılma ve Kaplama <ol><li> Yıkama işleminden sonra, kültür ortamı içine 200 ul iki bezi yerleştirin ve sonra yavaşça bezleri ve titreaşağı 200 ul pipet pipet ucu ile artık çözelti içinde dokusunun büyük bir parçası kalmayıncaya kadar. Not: titre zaman, 200 ul pipet ucu aşağıya doğru bir kuvvet ile tüpün alt bezleri ve muhafaza ve yavaşça doku girerler. , Yavaş, sürekli darbeleri kullanmak için belirli olun asla hızlı veya ani pipetlerken. </li><li> 450 ul kadar kültür ortamı toplam hacmi getirmek için ek bir 250 ul kültür ortamı ekleyin. </li><li> Plaka, bir 60 x 15 mm kültür tabağına yerleştirilir yedi ila 12 mm PDL önceden kaplanmış lamelleri, her biri üzerine, bu, hücre-ihtiva eden çözelti, 60 ul. </li><li> Bir kez kaplama, hücre canlılığı için bir ortam sağlamak için 30 dakika boyunca% 5 CO 2 sürekli bir akış / arz ile 37 ° C ayarlanır ve muhafaza kuvöz içine koyunuz. İnkübasyondan sonra, yavaşça kültür kabı içine önceden ısıtılmış kültür ortamı 5 ml ilave edilir ve 24 saat süreyle tekrar inkübatör içine yemeğin geri hücre ataşe öncesinded kayıtları. Not: Hücreler tipik olarak, en fazla 4 gün boyunca elektrofizyolojik kayıtları için kullanılabilir. </li></ol> 5. Hücre Tanımlama ve gigaohm Seal Oluşumu <ol><li> Hücre dışı çözelti içine 12 mm&#39;lik bir örtücü cam yerleştirin. Bütün böbreküstü bezleri hücre hazırlanması için kullanılan bu yana, kortikal hücreleri (küçük ve) hücreleri kromafin daha sönük kültür içinde kromaffin hücreleri (kahverengimsi / bej rengi ve mükemmele yakın bir dairesel formlu, genellikle çok parlak (Şekil 1) karıştırın. </li><li> Programlanabilir P-97 çektirmenin kullanarak dört aşamada yama pipetler çekin. Daha sonra cam kapasitenin azaltılması ve yardımcı olacak bir erimiş mum içine pipet ucu batırın pipet içerisinden ucu &quot;darbe-away&quot; lehçe bu balmumu ateş. Not: Yama pipet çözeltisi ile doldurulan, yama pipetler genellikle yaklaşık 2 M? Bir dirence sahiptir. </li><li> Birkaç metre içinde hücreye yakın yama pipet Yaklaşımicrons. Hücreye bağlı bir konfigürasyon elde etmek için, hücreye yakın yama pipet yaklaşması sırasında herhangi bir hafif hücre deformasyon için bak. Bir GΩ mühür elde edilinceye kadar nazik vakum uygulayın. </li></ol> 6. Hücre-Ekli Kapasite Kayıtlar <ol><li> Bir mühür ortaya GΩ sonra, EPC-7 artı yama-kenet büyütücü kullanımı ile hücre bağlı kayıt yapmak ve iki fazlı bir analog kilidi amplifikatör (ekipman ekli tabloya bakınız). Kilit-amplifikatör 50 mV (rms) genlik ve 20 kHz frekans ile bir sinüs dalgası uygulayın. </li><li> 1 msn zaman sabiti ve 24 db de kilit-amplifikatör çıkış filtre ayarlayın. Kilit-amplifikatör gibi nazik emme bakliyat tarafından üretilen geçici kapasite değişiklikleri sadece yama iletkenlik (Re) iz içine hiçbir projeksiyon ile yama kapasitans (Im) iz görünür ki (Şekil 2) fazını ayarlayın. NOT: bir yeniden sistemin kalibrasyonu için ayrıntıları bakın19 Ference. </li><li> &quot;Aşağıya doğru&quot; adımlar (Şekil 3) ile tipik kapasite değişiklikleri belirlemek. NOT: Bir katı kayıt Tek veziküllerini içselleştirerek gösterir birçok aşağıya doğru adımlarla bir &quot;merdiven&quot; tipi benzerliği olarak görülecektir. Yama işlemi eylem akım tipik olarak en hücrelerinden kaydedilmiş olacağından mekanik uyarım olarak hizmet vermektedir. </li><li> Bu dosya içinde aa / gg / yıl ve kendi bireysel numaralandırma (xx) gibi her hücre bağlı kayıt: Bireysel tarih dahil klasörler gibi dosyaları isim. </li></ol>

<ol><li>Rettig, J., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+presynaptic+proteins+in+Ca%2B%2B-triggered+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of presynaptic proteins in Ca++-triggered exocytosis.</a> Science. 298, 781-785 (2002).</li>
<li>Gong, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol+phosphate+kinase+type+I+gamma+regulates+dynamics+of+large+dense-core+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol phosphate kinase type I gamma regulates dynamics of large dense-core vesicle fusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5204-5209 (2005).</li>
<li>Lindau, M., Alvarez de Toledo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fusion+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The fusion pore.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1641, 167-173 (2003).</li>
<li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389, 509-512 (1997).</li>
<li>Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitance+flickers+and+pseudoflickers+of+small+granules%2C+measured+in+the+cell-attached+configuration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Capacitance flickers and pseudoflickers of small granules, measured in the cell-attached configuration.</a> Biophys J. 75, 53-59 (1998).</li>
<li>Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+fusion+pore+of+small+granules+has+a+conductance+similar+to+an+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The exocytotic fusion pore of small granules has a conductance similar to an ion channel.</a> The Journal of cell biology. 129, 99-104 (1995).</li>
<li>Dernick, G., Gong, L. W., Tabares, L., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+amperometry%3A+high-resolution+measurements+of+single-vesicle+fusion+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Patch amperometry: high-resolution measurements of single-vesicle fusion and release.</a> Nat Methods. 2, 699-708 (2005).</li>
<li>Neher, E., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete+changes+of+cell+membrane+capacitance+observed+under+conditions+of+enhanced+secretion+in+bovine+adrenal+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).</li>
<li>Gong, L. W., de Toledo, G. A., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytotic+catecholamine+release+is+not+associated+with+cation+flux+through+channels+in+the+vesicle+membrane+but+Na%2B+influx+through+the+fusion+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exocytotic catecholamine release is not associated with cation flux through channels in the vesicle membrane but Na+ influx through the fusion pore.</a> Nature Cell Biology. 9, 915-922 (2007).</li>
<li>Gong, L. W., Hafez, I., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+vesicles+membrane+area+is+regulated+in+tandem+with+quantal+size+in+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Secretory vesicles membrane area is regulated in tandem with quantal size in chromaffin cells.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 23, 7917-7921 (2003).</li>
<li>Yao, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization+does+not+provide+direct+mechanical+forces+for+vesicle+fission+during+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization does not provide direct mechanical forces for vesicle fission during clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 33, 15793-15798 (2013).</li>
<li>Yao, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin+1+is+necessary+for+the+Ca2%2B+dependence+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin 1 is necessary for the Ca2+ dependence of clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 3778-3785 (2012).</li>
<li>McMahon, H. T., Boucrot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+and+physiological+functions+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 12, 517-533 (2011).</li>
<li>Murthy, V. N., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+the+presynaptic+terminal%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cell biology of the presynaptic terminal.</a> Annu Rev Neurosci. 26, 701-728 (2003).</li>
<li>Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-mediated+endocytosis+is+the+dominant+mechanism+of+vesicle+retrieval+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses.</a> Neuron. 51, 773-786 (2006).</li>
<li>Rosenboom, H., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exo-endocytosis+and+closing+of+the+fission+pore+during+endocytosis+in+single+pituitary+nerve+terminals+internally+perfused+with+high+calcium+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Exo-endocytosis and closing of the fission pore during endocytosis in single pituitary nerve terminals internally perfused with high calcium concentrations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 5267-5271 (1994).</li>
<li>MacDonald, P. E., Eliasson, L., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+increases+endocytotic+vesicle+size+and+accelerates+membrane+fission+in+insulin-secreting+INS-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Calcium increases endocytotic vesicle size and accelerates membrane fission in insulin-secreting INS-1 cells.</a> Journal of Cell Science. 118, 5911-5920 (2005).</li>
<li>Zhao, Y., Fang, Q., Straub, S. G., Lindau, M., Sharp, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+inhibition+of+endocytosis%3A+novel+roles+for+noradrenaline+and+G+protein+G%28z%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hormonal inhibition of endocytosis: novel roles for noradrenaline and G protein G(z).</a> J Physiol. 588, 3499-3509 (2010).</li>
<li>Debus, K., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+patch+capacitance+recordings+and+of+fusion+pore+conductances+in+small+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Resolution of patch capacitance recordings and of fusion pore conductances in small vesicles.</a> Biophys J. 78, 2983-2997 (2000).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Hücre bağlı kapasite ölçümleri başarılı bir şekilde yüksek kalitede ses kayıtları elde etmek için bazı kritik adımları gerektirir: böbreküstü bezlerinden hazırlanmış 1) canlı ve sağlıklı hücreleri; Lamelleri 2) PDL kaplama; 3) gigaohm yalıtım oluşturma; 4) sistem gürültü seviyesi; ve 5) faz düzeltme. Hayvan ameliyatı için bir potansiyel yapabilirsiniz değişiklikler en uygun dirayeti cerrahi yaklaşımı ayarlamak ve diseksiyon sırasında zarar görmesini önlemektir. Elektrofizyolojik kayıtlar içi...

Sinaptik nörotransmiter içeren sinaptik veziküllerin ekzositozu aracılık eder ve bu veziküller uzun vadede nöronal iletişim sağlamak için sinir terminal içinde yerel endositik geri dönüşüm geçmesi gerekmektedir. Sinaptik vezikül döngüsü, bir bütün olarak, hücresel haberleşme daha iyi bir kavramaya yönelik gerekli bir temel teşkil eden moleküler makine anlaşılması, sinaptik iletim temel rolü göz önüne alındığında. Hücre modeli sistemleri arasında, adrenal kromafin hücre sinaptik vezikül geri dönüşüm altında yatan moleküler makineler içine en kesin içgörü bazı sağlamıştır. Ekzositoz, nörotransmitter açıklamasında son adım, son derece okudu ve adrenal chromaffin hücrenin 1,2 kullanımı yoluyla incelenmiştir. Aslında, salgı granüllerin oluşumuna, hedefleme, yerleştirme ve füzyon orkestra moleküler oyuncu büyük çapta div uygulanmasından tespit edilmiştirkromafin hücreleri 1 erse teknikleri. Ayrıca, Ekzositoz katılan protein makine tek-vezikül çözümü için izin için bir fırsat sağlayarak, kromaffin hücre vezikül füzyonu 3 soruları yanıtlamak için güçlü bir model kalır. Hücre bağlı kapasitans ölçümleri ilk Ekzositoz 3 sırasında tek vezikül füzyon çözümünde kullanılmıştır. ~ Çapı 60 mil gösterilmiştir kadar küçük veziküller Ekzositoz hücre konfigürasyonda bağlı olarak 4-7 yama kelepçe tekniğiyle birlikte hücre zarı admitans ölçümleri ile tespit edilebilir. Admittans bir devre ya da cihaz, bir akımın akmasına izin verecek kadar kolay bir ölçüsü olarak tanımlanır; Bu empedansının tersidir. Böylece, giriş ölçümler membran kapasitans anlaşılmasını sağlamak. Bu, plazma membranı içine veziküler membranın eklenmesi ile gerçekleştirilir; Bu birleşme yüzeyinde değişiklikler ortayaalan 8. Her bir füzyon vezikül membran kapasitans 9,10 kademeli bir artışa neden olur. Ayrıca, bu geçiri ölçüm membran iletkenliğini ve eksositotik olay 3 sırasında füzyon gözenek iletkenlik sağlar. Bu tekniğin Ekzositoz sırasında tek vezikül kinetiği belirlenmesi eşsiz bir araç sağladı gibi, bizim laboratuvar son zamanlarda tek kesecikler 11,12 endositozu algılamak için bu kavramı başvurdu. Bizim özel ilgi birçok hücreleri 13 ve nöronal terminalleri 14,15 sinaptik vezikül endositoz için bir ana yol olarak temel bir temizlik bileşeni olarak kabul edilmiştir klatrin aracılı endositoz (CME), olduğunu. CME Ancak kinetiği nedeniyle tekil endositik olayların izlenmesinde teknik sınırlamalara tam olarak anlaşılamamıştır, biyolojik olarak önemli olduğu bilinmektedir. Kromaffin hücreleri ve nöronlar arasındaki 1 ekzositik mekanizmalarında benzerlikler dikkate alındığında, plchromaffin hücreleri fisyon mekanizmalar büyük olasılıkla nöronlarda sinaptik vezikül endositoz için geçerli olabilir ausible. Hücre bağlı kapasite ölçümleri bireysel endositik olayları izlemek ve en yöntemleri çözemiyorsanız fisyon kinetik analiz için kullanılmıştır. Bizim hücre bağlı kayıtlarında, 20 kHz&#39;de bir sinüs dalgası tutma potansiyelinden üzerine biner, ve çıkış akımı yükseltici kilitli iki fazdan, başka bir kanalda bir kanal ve membran kapasitans membran iletkenliği ayrılır 16- 18. Membran iletimini ve kapasitanstaki değişimlere kaynaktan, tek bir olasılıkla kabarcık kıstırma önce plazma zarına içe vezikül bağlayan boru şeklindeki zar boynuna karşılık fisyon-gözenekli, kinetiğini hesaplayabilir. Topluca, bu teknik bize CME sırasında vezikül fisyon düzenleyici mekanizmaları incelemek için fırsat verir.

<table><tbody><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td>15066024</td><td>UV</td></tr><tr><td>Dulbecco'dan Uzak Tutun s Modifiye Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kapak Camı</td><td>Carolina Biological</td><td>633029</td><td>12 mm</td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td>15140122 100 ml</td></tr><tr><td>İnsülin-Trans-Sel-X</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>51500056</td><td>Sadece ICE üzerinde çözdürün!</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>39S11614</td><td></td></tr><tr><td>EPC-7 plus yama amplifikatörü</td><td>HEKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BNC-2090 veri toplama kartı</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igor veri toplama yazılımı</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-97 pipet çektirmesi</td><td>Sutter Instruments Microforge</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Scientific Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat cam kılcal damarlar</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-110-10</td><td>Dış çap: 1,5 mm 
İç çap: 1,10 mm 
Uzunluk: 10 cm</td></tr></tbody></table>

fare adrenal kromafin cell hücre bağlı kapasitans Ölçümler yöntemleri

Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

Nöronal iletim, beyindeki hücresel iletişimin ayrılmaz bir parçasıdır. Presinaptik membranın depolarizasyonu, sinaptik iletime aracılık eden ekzositoz olarak bilinen vezikül füzyonuna yol açar. Endositoz olarak tanımlanan bir süreçte yeni nörotransmitter dolu veziküller oluşturmak için sinaptik veziküllerin daha sonra alınması gereklidir. Ekzositoz sırasında, vezikül zarlarının kaynaşması yüzey alanında bir artışa neden olur ve ardından endositoz, yüzey alanında bir azalmaya neden olur. Burada, laboratuvarımız, fare adrenal kromaffin hücresindeki tek endositik olayların hücreye bağlı kapasitans kayıtlarına temel bir giriş göstermektedir. Bu tür elektriksel kayıt, tek vezikül seviyesinde ekzositoz ve endositozun yüksek çözünürlüklü kayıtları için kullanışlıdır. Bu teknik hem vezikül ekzositozunu hem de endositozu tespit edebilirken, laboratuvarımızın odak noktası vezikül endositozudur. Ayrıca, bu teknik, tek endositik olayların kinetiğini analiz etmemizi sağlar. Burada fare adrenal bez dokusu diseksiyonu, kromaffin hücre kültürü, temel hücre bağlı teknikler ve tekil endositik olayı ölçen bireysel izlerin müteakip örnekleri açıklanmaktadır.

Hücre canlılığı ve gigaohm sızdırmazlık kalitesinin hücre bağlı kapasitans kayıtlarının kalitesini belirlemek için önemlidir. Bu nedenle, önceki elektrofizyolojik kayıtları ve tipik yaşayabilir hücrelerin, Şekil 1 'de gösterilmiştir etkili ve verimli bir hücre kültürünü temin etmek önemlidir. Teori ve zaman yüksek kaliteli bir yalıtım elde edilir gigaohm yararlı olacaktır. Bir açık protokol Aşama 5.3 'te tarif edildiği gibi Patch-Pipeti hücre yaklaşmaktadır hücre deformasyon görüldüğünde, yüksek kalitel...

Ekzositozdan sonra, kaynaşmış plazma zarı endositoz olarak bilinen bir işlemle elde edilir. Bu mekanizma, bir sonraki serbest bırakma turu için yeni sinaptik vezikülleri yeniden düzenler. Bireysel endositik olaylar, fare adrenal kromaffin hücrelerinde hücreye bağlı kapasitans kayıtlarının kullanılması yoluyla yakalanır ve analiz edilir.

Fare Adrenal Kromafin Cell Hücre bağlı Kapasitans Ölçümler Yöntemleri

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

Bu prosedürün genel amacı, tek vezikül, sitoz ve endositozu tespit etmektir. Bu, önce fare adrenal bez dokusunun temiz ve tam bir sindirimi elde edilerek gerçekleştirilir. İkinci adım, hücreleri adrenal bezlerden ayırmak ve plakalamaktır.Daha sonra kromin hücreleri tanımlanır ve hücreye bağlı kapasitans kayıtlarını elde etmek için yama klemplenir. Sonuçta, tek vezikül, sitoz ve endositoz gözlenebilir. Bu tekniğin, tek iyon kanallarının hücreye bağlı kayıtları gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, tek veziküllerin ekzositozunu ve endositozunu tespit edebilmemizdir.Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi, bir giga contası elde etmenin öğrenilmesi zor olduğu için yararlıdır. Ayrıca, plaka içinde bulunan karışık hücre tipleri arasındaki hücreleri tanımlamak zor olabilir. Ameliyata hazırlanmak için bir çift büyük ve küçük diseksiyon, makas ve iki çift forseps otoklavlayarak başlayın.Ardından diseksiyon tepsisini bir buz kovasının üzerine yerleştirin. Ayrıca enzim çözeltisini %5 karbondioksit ve %95 oksijen ile köpürtmeye başlayın. Çözelti, köpürmeden önce parlak pembedir. Önümüzdeki.Yeni doğmuş bir bebeği üç günlük bir fareye ötenazi yaptıktan ve başını kestikten sonra, omurgayı servikal bölgeden kordal bölgeye kadar takip eden yavrunun sırtını kesmek için daha küçük makas setini kullanın. Vücut boşluğunu delmemek için derinin altında yüzeysel olarak kestiğinizden emin olun. Daha sonra, cildi omurgadan uzaklaştırın, böylece kas sistemi açığa çıkar ve omurganın net bir görünümü olur.Şimdi servikal omurilikte trans kesitsel bir kesim yapın ve daha sonra hayvanın ana gövdesini tutan bir çift forseps ile omurganın kenarları boyunca iki paralel kesim yapın. Omurgayı tutmak için diğer forseps çiftini kullanın ve böbrekler açığa çıkana kadar omurgayı geri soyun. Böbreküstü bezlerini böbreklerin üstüne yerleştirdikten sonra, bunları çıkarmak için forseps kullanın.Daha sonra adrenal bezleri dikkatlice kilit çözeltisi ile doldurulmuş konik bir tüpe yerleştirin. Böbreküstü bezlerini çıkarmak için ikinci bir forseps çifti kullanın. İlk forseps çiftine yapışırlarsa, konik tüpü buzun üzerine yerleştirin.Bezler iki saate kadar kilit solüsyonunda tutulabilir. Bu noktada, dengelenmiş çözeltinin parlak pembe renkten pembemsi turuncu renge dönüştüğünden emin olmak için enzim çözeltisini kontrol edin. Daha sonra, mililitre başına 20 ila 25 birimlik bir nihai konsantrasyonda taze kabarcıklı enzim çözeltisine pape ekleyin.Daha sonra propan enzim çözeltisini yeni bir konik tüpe ekleyin ve adrenal bezleri propan enzim tüpüne aktarmak için forseps kullanın. Bezleri 37 santigrat derecede 40 ila 60 dakika inkübe edin. Daha sonra her tüpe% 75 inaktivasyon çözeltisi ekleyin ve 37 santigrat derecede 10 dakika daha inkübe edin.10 dakika sonra, bezleri nazikçe yeni etiketlenmiş bir tüpe aktarın ve bezleri üç kez kültür ortamı ile yıkayın. Yıkadıktan sonra, bezleri 200 mikrolitre kültür ortamına yerleştirin ve ardından bezleri 200 mikrolitrelik bir pipetin pipet ucundan yukarı ve aşağı doğru nazikçe titre edin. Titrasyon yaparken, 200 mikrolitrelik pipet ucundan aşağı doğru kuvvetle tüpün altındaki bezleri koruyun ve dokuyu nazikçe ve yavaşça yerine getirin Titrasyondan sonra asla hızlı veya ani pipetleme yapmadan yavaş, sürekli vuruşlar kullandığınızdan emin olun, kültür ortamının toplam hacmini 450 mikrolitreye çıkarmak için 250 mikrolitre daha kültür ortamı ekleyin.Sonraki sırada, 60 x 50 milimetrelik bir kültür kabı plakasında yedi adet 12 milimetre PDL önceden kaplanmış kapak kayması. Daha sonra, çözelti içeren hücrenin 60 mikrolitresini yedi kapak fişinin her birine yerleştirin. Kaplandıktan sonra, tabağı 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübatöre yerleştirin.İnkübasyondan sonra, kültür kabına nazikçe beş mililitre ön ısıtma kültür ortamı ekleyin, ardından hücreye bağlı kayıtları gerçekleştirmeden önce 24 saat inkübe edin. İnkübasyon yerleştirildikten sonra, adrenal hücreleri içeren 12 milimetrelik örtü, hücre dışı çözeltiye kayar. Tüm adrenal bezler kullanıldığından, bir sonraki adım kromin hücreleri ve kortikal hücreler arasında ayrım yapmaktır.Kültürde, kromin hücreleri tipik olarak kahverengimsi bej bir renk ve mükemmele yakın dairesel bir form ile çok parlaktır. Buna karşılık, kortikal hücreler CHRO hücrelerinden daha küçük ve daha sönüktür. Yama pipetlerini metin protokolünde açıklandığı gibi çektikten sonra, camın kapasitansını azaltmak için pipet ucunu erimiş balmumuna batırın.Ardından, bu balmumu pipet ucunun içinden üflemek için ucu ateşle parlatın. Daha sonra, pipeti, direnci yaklaşık iki mega ohm olacak şekilde yama pipet çözeltisiyle oluşturun. Yama pipetini manipülatörüne takın ve hücrenin birkaç mikron yakınına getirin.Herhangi bir hafif hücre deformasyonu olup olmadığını aramak için pipeti ilerletmeye devam edin. Deformasyon tespit edildikten sonra, bir giga om conta elde edilene kadar hafifçe emme uygulayın. Hücreye bağlı bir konfigürasyon elde edilir.Bir giga om contası ortaya çıktığında, bir EPC yedi artı yama kelepçesi amplifikatörü ve metin protokolünde açıklandığı gibi iki fazlı bir analog kilitleme amplifikatörü kullanarak hücreye bağlı kayıtlar yapın, kilitleme fazını ayarlayın amplifikatör, hafif emme ile üretilen geçici kapasitans değişiklikleri için. Darbeler sadece yama kapasitansında görülür veya yama içine projeksiyon olmadan iz bırakır, iletkenlik veya yama işlemi mekanik stimülasyon görevi görür. Aksiyon akımı tipik olarak çoğu hücreden kaydedilebildiğinden, işaretli aşağı doğru adımla tipik kapasitans değişikliklerini tanımlayın.Son adım, verileri gelecekteki analizler için kaydetmektir. Burada, birden fazla aşağı doğru adımla tipik bir hücreye bağlı kapasitans kaydı gösterilmektedir. Her aşağı doğru adım, tek bir iCal endositozu ile ilişkilidir.Bir kez ustalaştıktan sonra, hücre kültürü iki ila üç saat içinde tamamlanabilir ve kayıtlar, geliştirilmesinden sonraki dört gün içinde gerçekleştirilebilir. Bu teknik, sinaptik iletim alanındaki araştırmacıların nöroendokrin kromin hücrelerinde sinaptik vezikül geri dönüşümünü keşfetmelerinin yolunu açtı.

methods-for-cell-attached-capacitance-measurements-mouse-adrenal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Adrenal medüller kromafin hücre kültürü sistemleri, in vitro ortamda bir uyarım-salgılanması kaplin çalışması için son derece yararlı. Bu protokol adrenaller incelemek ve sonra Adrenal korteks uzak sıyırma medüller bölgede izole etmek için kullanılan yöntemi göstermektedir. Tek kromafin hücrelerine medulla sindirim sonra gösterilmiştir.

Fare Adrenal Kromafin Hücre İzolasyonu

Burada elektrofizyoloji ve Ca2 + görüntüleme için uygun agar-gömülü retina dilim hazırlanması için bir protokol. Bu yöntem, tek presinaptik sinir uçları doğrudan patch-klemp kayıtları kullanarak retina mikrodevreler şerit-tip sinaps bir çalışma sağlar.

Patch-kelepçe Kapasitans Ölçümler ve Ca 2 + Retina Dilimleri Tek Sinir Terminalleri Görüntüleme

Bu video makalede hücre gövdeleri yama kurulum, usul ve nasıl tüm montaj fare retinae ganglion hücrelerinden dinamik kelepçe kayıtları uygulamaya göstermektedir. Bu teknik, eksitatör ve inhibitör sinaptik girdi kesin katkısının incelenmesi ve nöronal spike için göreceli büyüklüğü ve zamanlaması sağlar.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Synaptic ve Yapay iletkenlikleri Dinamik Kelepçe Uygulama

Yabani tip ve mutant farelerden alınan bireysel kardiyomiyositler, kasılmalarını ve kalsiyum geçişlerini incelemek için kalpten izole edilebilir. Bu, hücresel disfonksiyonun herhangi bir nedenden dolayı kalp disfonksiyonuna katkısının karakterizasyonuna izin verir.

Fare kardiyomiyositlerde İzolasyon ve Fizyolojik Analizi

Ozmotik stres ekzositozu ve bu işlem sırasında serbest nörotransmitter miktarını etkiler. Biz nasıl transmisyon elektron mikroskobu ile birlikte elektrokimyasal yöntemleri birleştirerek ekstraselüler ozmotik basınç etkisi ekzositozu etkinlik, vezikül quantal boyut ve serbest nörotransmitter miktarı incelemek için kullanılabileceğini göstermek ekzositozu sırasında.

Ozmotik stres etkisi salgı veziküller ve ekzositozu izleme

Enterochromaffin (EC) hücreleri küçük bir alt gastrointestinal epitel hücrelerinin oluşturmaktadır. EC hücreleri elektriksel olarak heyecanlı ve kültür ve EC hücreleri tanımlayan zorlukları fizyolojik çalışmalar sınırlı henüz serotonin, bırakın. Burada sunulan yöntem bir birincil kültür model tek EC hücrelerin incelenmesi için mükellef tarafından Elektrofizyoloji kurar.

Tüm cep telefonu Elektrofizyoloji birincil kültürlü fare Enterochromaffin hücre

Burada adrenal bezlerin fareler üzerinden ayırma, dokuları düzeltmek, onları bölüm ve ayirt boyama gerçekleştirmek için bir yöntem mevcut.

Yalıtım, fiksasyon ve fare böbreküstü bezlerinin ayirt görüntüleme

Adrenal korteks tarafından salgılanan hormon stres ve hastalıklara karşı hayvanlar için hayati önem taşımaktadır. Burada, adrenal hücreler kültür birincil fare için bir iletişim kuralı mevcut. Adrenal steroidogenesis ve lipit sentezi ilgi reaktif mekanizmalarının araştırılması için iyi bir tüp bebek platform olabilir.

Sıçan Adrenokortikal hücreleri ve deneyleri Steroidogenic fonksiyonların birincil kültür

Bu protokol, sığır adrenal kromafin hücrelerinde üç füzyon modunu tespit etmek için konfokal bir görüntüleme tekniğini tanımlar. Bu füzyon modları arasında 1) füzyon gözenek açma ve kapama içeren yakın füzyon (öpüş ve koş olarak da adlandırılır), 2) füzyon gözenek açılmasını ve açılan gözenekin korunmasını içeren stay-füzyon ve 3) kaynaşmış vezikül büzülmesini içeren büzülme-füzyon bulunur.

Adrenal Kromafin Hücrelerinde Üç Füzyon Gözenek Dinamiği Modunu Ölçmek için Konfokal Mikroskopi

Fare adrenal korteks için zona glomerulosa ve zona fasciculata ile zenginleştirilmiş hücrelerin 2D birincil kültürlerini oluşturmak amacıyla sağlam ve tekrarlanabilir bir yaklaşım geliştirildi. Bu sistem, her bölgenin temel moleküler ve fonksiyonel özelliklerini koruyarak sinyal yolları, hormon üretimi ve adrenal kortikal hücre davranışının odaklanmış şekilde incelenmesini mümkün kılar.

Fare Adrenal Korteksinden Bölge Zenginleştirilmiş Birincil Kültürlerin Oluşumu

Öğrenin fare adrenal kromafin hücrelerinde tek vezikül ekzositoz ve endositoz tespiti için hücre bağlı kapasitans ölçüm yöntemini. Bu teknik sinaptik iletim mekanizmalarını anlamaya katkı sağlar.

Fare Adrenal Kromafin Cell Hücre bağlı Kapasitans Ölçümler Yöntemleri

Daha fazla video keşfet