Fare Adrenal Kromafin Cell Hücre bağlı Kapasitans Ölçümler Yöntemleri

Bu prosedürün genel amacı, tek vezikül, sitoz ve endositozu tespit etmektir. Bu, önce fare adrenal bez dokusunun temiz ve tam bir sindirimi elde edilerek gerçekleştirilir. İkinci adım, hücreleri adrenal bezlerden ayırmak ve plakalamaktır.

Daha sonra kromin hücreleri tanımlanır ve hücreye bağlı kapasitans kayıtlarını elde etmek için yama klemplenir. Sonuçta, tek vezikül, sitoz ve endositoz gözlenebilir. Bu tekniğin, tek iyon kanallarının hücreye bağlı kayıtları gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, tek veziküllerin ekzositozunu ve endositozunu tespit edebilmemizdir.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi, bir giga contası elde etmenin öğrenilmesi zor olduğu için yararlıdır. Ayrıca, plaka içinde bulunan karışık hücre tipleri arasındaki hücreleri tanımlamak zor olabilir. Ameliyata hazırlanmak için bir çift büyük ve küçük diseksiyon, makas ve iki çift forseps otoklavlayarak başlayın.

Ardından diseksiyon tepsisini bir buz kovasının üzerine yerleştirin. Ayrıca enzim çözeltisini %5 karbondioksit ve %95 oksijen ile köpürtmeye başlayın. Çözelti, köpürmeden önce parlak pembedir. Önümüzdeki.

Yeni doğmuş bir bebeği üç günlük bir fareye ötenazi yaptıktan ve başını kestikten sonra, omurgayı servikal bölgeden kordal bölgeye kadar takip eden yavrunun sırtını kesmek için daha küçük makas setini kullanın. Vücut boşluğunu delmemek için derinin altında yüzeysel olarak kestiğinizden emin olun. Daha sonra, cildi omurgadan uzaklaştırın, böylece kas sistemi açığa çıkar ve omurganın net bir görünümü olur.

Şimdi servikal omurilikte trans kesitsel bir kesim yapın ve daha sonra hayvanın ana gövdesini tutan bir çift forseps ile omurganın kenarları boyunca iki paralel kesim yapın. Omurgayı tutmak için diğer forseps çiftini kullanın ve böbrekler açığa çıkana kadar omurgayı geri soyun. Böbreküstü bezlerini böbreklerin üstüne yerleştirdikten sonra, bunları çıkarmak için forseps kullanın.

Daha sonra adrenal bezleri dikkatlice kilit çözeltisi ile doldurulmuş konik bir tüpe yerleştirin. Böbreküstü bezlerini çıkarmak için ikinci bir forseps çifti kullanın. İlk forseps çiftine yapışırlarsa, konik tüpü buzun üzerine yerleştirin.

Bezler iki saate kadar kilit solüsyonunda tutulabilir. Bu noktada, dengelenmiş çözeltinin parlak pembe renkten pembemsi turuncu renge dönüştüğünden emin olmak için enzim çözeltisini kontrol edin. Daha sonra, mililitre başına 20 ila 25 birimlik bir nihai konsantrasyonda taze kabarcıklı enzim çözeltisine pape ekleyin.

Daha sonra propan enzim çözeltisini yeni bir konik tüpe ekleyin ve adrenal bezleri propan enzim tüpüne aktarmak için forseps kullanın. Bezleri 37 santigrat derecede 40 ila 60 dakika inkübe edin. Daha sonra her tüpe% 75 inaktivasyon çözeltisi ekleyin ve 37 santigrat derecede 10 dakika daha inkübe edin.

10 dakika sonra, bezleri nazikçe yeni etiketlenmiş bir tüpe aktarın ve bezleri üç kez kültür ortamı ile yıkayın. Yıkadıktan sonra, bezleri 200 mikrolitre kültür ortamına yerleştirin ve ardından bezleri 200 mikrolitrelik bir pipetin pipet ucundan yukarı ve aşağı doğru nazikçe titre edin. Titrasyon yaparken, 200 mikrolitrelik pipet ucundan aşağı doğru kuvvetle tüpün altındaki bezleri koruyun ve dokuyu nazikçe ve yavaşça yerine getirin Titrasyondan sonra asla hızlı veya ani pipetleme yapmadan yavaş, sürekli vuruşlar kullandığınızdan emin olun, kültür ortamının toplam hacmini 450 mikrolitreye çıkarmak için 250 mikrolitre daha kültür ortamı ekleyin.

Sonraki sırada, 60 x 50 milimetrelik bir kültür kabı plakasında yedi adet 12 milimetre PDL önceden kaplanmış kapak kayması. Daha sonra, çözelti içeren hücrenin 60 mikrolitresini yedi kapak fişinin her birine yerleştirin. Kaplandıktan sonra, tabağı 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübatöre yerleştirin.

İnkübasyondan sonra, kültür kabına nazikçe beş mililitre ön ısıtma kültür ortamı ekleyin, ardından hücreye bağlı kayıtları gerçekleştirmeden önce 24 saat inkübe edin. İnkübasyon yerleştirildikten sonra, adrenal hücreleri içeren 12 milimetrelik örtü, hücre dışı çözeltiye kayar. Tüm adrenal bezler kullanıldığından, bir sonraki adım kromin hücreleri ve kortikal hücreler arasında ayrım yapmaktır.

Kültürde, kromin hücreleri tipik olarak kahverengimsi bej bir renk ve mükemmele yakın dairesel bir form ile çok parlaktır. Buna karşılık, kortikal hücreler CHRO hücrelerinden daha küçük ve daha sönüktür. Yama pipetlerini metin protokolünde açıklandığı gibi çektikten sonra, camın kapasitansını azaltmak için pipet ucunu erimiş balmumuna batırın.

Ardından, bu balmumu pipet ucunun içinden üflemek için ucu ateşle parlatın. Daha sonra, pipeti, direnci yaklaşık iki mega ohm olacak şekilde yama pipet çözeltisiyle oluşturun. Yama pipetini manipülatörüne takın ve hücrenin birkaç mikron yakınına getirin.

Herhangi bir hafif hücre deformasyonu olup olmadığını aramak için pipeti ilerletmeye devam edin. Deformasyon tespit edildikten sonra, bir giga om conta elde edilene kadar hafifçe emme uygulayın. Hücreye bağlı bir konfigürasyon elde edilir.

Bir giga om contası ortaya çıktığında, bir EPC yedi artı yama kelepçesi amplifikatörü ve metin protokolünde açıklandığı gibi iki fazlı bir analog kilitleme amplifikatörü kullanarak hücreye bağlı kayıtlar yapın, kilitleme fazını ayarlayın amplifikatör, hafif emme ile üretilen geçici kapasitans değişiklikleri için. Darbeler sadece yama kapasitansında görülür veya yama içine projeksiyon olmadan iz bırakır, iletkenlik veya yama işlemi mekanik stimülasyon görevi görür. Aksiyon akımı tipik olarak çoğu hücreden kaydedilebildiğinden, işaretli aşağı doğru adımla tipik kapasitans değişikliklerini tanımlayın.

Son adım, verileri gelecekteki analizler için kaydetmektir. Burada, birden fazla aşağı doğru adımla tipik bir hücreye bağlı kapasitans kaydı gösterilmektedir. Her aşağı doğru adım, tek bir iCal endositozu ile ilişkilidir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, hücre kültürü iki ila üç saat içinde tamamlanabilir ve kayıtlar, geliştirilmesinden sonraki dört gün içinde gerçekleştirilebilir. Bu teknik, sinaptik iletim alanındaki araştırmacıların nöroendokrin kromin hücrelerinde sinaptik vezikül geri dönüşümünü keşfetmelerinin yolunu açtı.