Kantitatif İmmünofloresan Deneyi sentrozomlar Protein Düzeyleri Varyasyon Tedbir

Bu prosedürün genel amacı, çeşitli koşullar altında Sentrozomlardaki bir proteinin seviyesindeki nispi değişiklikleri ölçmektir. Örneğin, proteazomun inhibisyonundan sonra hücre döngüsünün belirli bir noktasında, bu, ilk olarak proteazom inhibitörü MG one 15 veya kontrol çözücüsü DMSO ile örtü kaymaları üzerinde büyüyen hücrelerin muamele edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra hemen her iki hücreye de BRDU ekleyin ve bunları bir hücre kültürü inkübatöründe dört saat boyunca inkübe edin.

İkinci adım, hücreleri sabitlemek için kapak fişlerini 24 oyuklu bir plakaya aktarmaktır. Daha sonra, hücreler BRDU'ya ve ilgilenilen proteinlere karşı antikorlarla ve daha sonra karşılık gelen ikincil antikorlarla boyanır. Son adım, her numuneden alınan hücrelere aynı maruz kalma süresi ve Z ekseni uzunluğunu uygulamak için bir floresan mikroskobu ve dijital görüntüleme yazılımı kullanarak BRDU pozitif hücrelerin görüntülerini elde etmektir.

Daha sonra, romal VDA C3'ün nispi seviyesini ölçmek için görüntüleri analiz etmek. Sonuç olarak, kantitatif immünofloresan mikroskobu, VDA C3'ün Centro somal havuzunun, proteazom S fazı sırasında inhibe edildiğinde iki kat arttığını göstermek için kullanılır. Bu tekniğin akış sitometrisi, immünoblotlama veya kantitatif mikroskop gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bu tekniğin, iki farklı örtü fişi üzerinde işlenen iki farklı muamele edilmiş numunede proteinin nispi romal seviyesini analiz etmesidir. Bu yöntem, iki deneysel hücre popülasyonunu işleme ihtiyacını kontrol etmek için dahili bir standarda normalleştirmeyi kullanır.

Ayrı olarak, bu yöntem sentrozomlardaki spesifik proteinlerin düzenlenmesi hakkında fikir verebilir. Diğer hücre altı yapılar veya hücre içinde birden fazla bölgede bulunan belirli protein havuzlarının incelenmesi gibi diğer durumlara da uygulanabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir doktora sonrası araştırmacı olan schu majumder olacak Deney geçişine başlamak için iki kez 10 ila beşinci eşzamansız olarak RPE'yi bir hücreyi daha önce hazırlanmış 35 milimetrelik kaplara kapak dudakları ile büyütün ve hücreleri iki mililitre tam ortamda büyütün.

Kültür ortamını her 24 saatte bir 44 saat sonra taze ön ısıtma ortamıyla değiştirin. Kültür ortamını, beş mikromolar nihai konsantrasyonda% 0.05 DMSO veya MG bir 15 içeren tam ortamla değiştirin ve aynı anda 40 mikromolar nihai konsantrasyonda hücrelere BRDU ekleyin, hücreleri dört saat inkübe edin. Ardından, her bir kapak fişini 24 oyuklu bir plakaya aktarın.

Her bir oyuğa 500 mikrolitre önceden işlenmiş metanol ekleyin ve hücreleri sabitlemek için plakayı eksi 20 santigrat derecede inkübe edin. 10 dakika sonra, kapak fişlerini hemen 500 mikrolitre yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. Sabit hücreleri kapakta inkübe edin, hücreler inkübe edilirken 30 dakika boyunca 200 mikrolitre bloke edici tampon içinde kaydırın.

Boş 1000 mikrolitrelik pipet ucu kutusunun alt yarısına ıslak bir kağıt havlu koyarak nemlendirilmiş bir oda hazırlayın. Raf yüzeyine bir parfüm şeridi yerleştirin ve paraformun üzerine bloke edici tampon içinde seyreltilmiş 20 mikrolitrelik bir tavşan anti V DDA üç ve fare anti gama tübülin antikoru ekleyin. Bloke ettikten sonra, her bir antikor çözeltisi damlacığı üzerine bir kapak kaymasını ters çevirin.

Hücrelerin daldırıldığından emin olun ve uç kutusunun kapağını kapatın. Hücreleri, nemlendirilmiş odada gece boyunca dört santigrat derecede birincil antikorlarla inkübe edin. Kapak fişlerini tekrar ters çevirin ve 24'e geri koyun.

Kapak fişlerini iyice yıkayın, daha sonra 150 mikrolitrelik bir ikincil antikor çözeltisi içinde inkübe edin, oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edici tampon içinde seyreltin İnkübasyondan sonra, kapak fişlerini yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. Eksi 20 santigrat derecede soğutulmuş 500 mikrolitre metanol ile lekeli RPE bir hücreyi sabitleyin. Hücreler 10 dakika sabitlendikten sonra, yıkama tamponunda üç kez yıkayın.

Daha sonra, hücreleri 30 dakika boyunca 200 mikrolitre iki normal HCL'de inkübe edin. Oda sıcaklığında, hücreleri 300 mikrolitre bir molar tris CL pH sekiz ile nötralize edin ve hücreleri üç kez yıkayın. Yıkama tamponu ile hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 200 mikrolitre bloke edici tampon ile bloke edin.

Bloke ettikten sonra, hücreleri sıçan anti BRDU antikoru ve nemlendirilmiş odada 37 santigrat derecede 45 dakika boyunca bloke edici tampon ile inkübe edin. Kapak fişlerini 24'e geri koyun. Hücreleri iyi bir şekilde çanak ve yıkayın.

Daha sonra, bunları 150 mikrolitre bloke edici tampon içinde seyreltilmiş ikincil antikor ile inkübe edin. Oda sıcaklığında bir saat boyunca 24 kuyulu bir tabakta. Ardından, kapak fişlerini bir cam mikroskop üzerinde Antifa reaktifi içeren altı mikrolitrelik bir montaj solüsyonu damlası olan bir XPBS lekesi ile üç kez yıkayın.

Hücre tarafı aşağı bakacak şekilde bir kapak kızağını montaj çözeltisinin üzerine kaydırın. Yumuşak bir temizleme mendili ile, fazla sıvıyı çıkarmak için kapak mendilini sürdüğüme hafifçe bastırın, kapak mendilini mikroskobun üzerine kapatın. Kapak kaymasının kenarı boyunca oje sürerek kaydırın.

Oda sıcaklığında BRDU pozitif RPE tek hücrelerin görüntülerini elde etmek için 1,4 sayısal açıklığa sahip 100 x plan APO yağa daldırma objektifi kullanın. 0,2 mikron adım boyutu ile Z ekseni boyunca uygun üst ve alt odak düzlemini belirleyin ve Z ekseni boyunca görüntüler elde edin. Ardından, Z ekseni boyunca elde edilen tüm görüntü yığınlarının evrişimini çözün.

Her görüntünün toplam yoğunluk projeksiyonunu elde edin. Sentrozomları iki mikrondan daha az ayrılmış hücreler için Z ekseni boyunca istifleyin. Her iki sentrozomun etrafına her iki kenarda 20 ila 30 piksellik küçük bir kare çizin ve seçilen alanı işaretleyin.

İlk karenin etrafına her kenarı 24 ila 35 piksellik daha büyük bir kare çizin ve büyük karenin seçili alanını işaretleyin. Daha sonra her bir floro dördünün alanını ve toplam floresan yoğunluğunu elde edin. Her kutuda, her bir floronun arka plan düzeltmeli floresan yoğunluğunu hesaplayın. Dört.

Son olarak, florosunun arka plan düzeltilmiş floresan yoğunluğunun oranını hesaplayarak VDA C3'ün normalleştirilmiş floresan yoğunluğunu elde edin. Seçilen dahili standart görüntüler için kullanılan floro dördü, eşzamansız olarak büyüyen RPE'nin rastgele alanlarından yakalandı: BRDU ile inkübe edilen bir hücre ve proteazom inhibitörü MG one 15 veya kontrol çözücüsü DMSO ve ekran DNA'sı ve BRDU. Arka plan, Centro Somal'a karşılık gelen floresan yoğunluğunu düzeltti.

VD üç, bu kutu ve bıyık diyagramında gösterildiği gibi, MG bir 15 ile tedavi edilen hücrelerde kabaca 2.5 kat daha yüksekti, daha sonra kontrol hücrelerinde. Veriler, gama tübülininkine karşı toplam VD üç floresan için normalleştirildiğinde, kat arttı, hafifçe kabaca iki katına düştü. Non-romal sitlerde VD C3 boyaması veya VD üçünün toplam hücresel seviyesi proteazom inhibisyonundan etkilenmedi.

Bu nedenle, VDA C3'ün romal havuzu, proteazom aracılı bozunma ile düzenlenir. Bu prosedürü denerken, test proteinine karşı antikorların ve iç standardın farklı konakçı türlerde yükseltilmesi gerektiğini ve her iki numunenin görüntülerinin, dijital görüntülemenin etkisini en aza indirmek için C-kesit sayısı ve maruz kalma süreleri gibi aynı görüntüleme parametreleri kullanılarak elde edilmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir.