Geçici veya kalıcı Serebral İskemi Modelinde lökosit alt popülasyonlarının Stereolojik ve Sitometrisi Karakterizasyonu

Bu prosedürün genel amacı, iskemik beynin fare miyeloid hücre alt kümelerini iki farklı metodoloji ile karakterize etmektir. İlk olarak, hem ortak karotis arter veya CCA'nın hem de orta serebral arterin distal gövdesinin veya esas olarak beyin korteksini etkileyen MCA oluşturan enfarktüsün tıkanmasıyla kalıcı bir serebral iskemi modeli tanıtılır. Daha sonra miyeloid hücre alt kümelerinin stereo mantıksal nicelemesi için, beynin seri koronal bölümleri, ilgilenilen hücreler için immün boyadır ve daha sonra sızan hücreler, optik fraksiyonatör yaklaşımı ile ölçülür.

Alternatif olarak, miyeloid hücreler mekanik ayrışma ile taze beyin dokusundan izole edilebilir ve daha sonra akış sitometrisi ile boyanabilir ve analiz edilebilir. Sonuç olarak, serebral iskemi sonrası fare beynine sızan spesifik miyeloid hücre alt kümelerinin doğru bir miktar tayini ve ayrıntılı kalitatif karakterizasyonu, sırasıyla stereo kantifikasyon ve multiparametrik akış sitometrisi ile elde edilebilir. Bu iskemi seri modelinin mevcut diğer modellere göre en büyük avantajı, tekniğimizin diğer yöntemlere göre önemli ölçüde daha düşük mortalite oranlarına sahip olması ve çalışma için gereken hayvan sayısını en aza indirgemesidir.

Bu alan, beyin hasarında mikro reaktivasyon, hematojen makrofajların ekstravazasyonu veya nötrofillerin rolleri gibi inme alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilecek bir yöntemdir. Bu yazıda gösterilen multiparametrik sitometri yaklaşımları üzerinde doğru teolojik niceleme, CE iskemiye doğuştan gelen immün yanıtın her ikisinde de miyeloid hücre popülasyonunun sayı fenotipi ve işlevi hakkında fikir verebilir. Önce CCA'yı bağlamak için, cerrahi mikroskop altında hayvanın boynunun ventral yüzeyi etrafında bir santimetre orta hat kesisi yapın.

Diseke edildikten sonra, distal MCA'yı bağlamak için sol CCA'yı kalıcı bir düğümle tıkamak için altı sıfırlı bir naylon sütür kullanın. Ardından, temporal kas üzerinde sağdan sola yatay bir kesi yapın. Ardından temporal kasın sağ tarafında ikinci bir dikey kesi yapın.

Şakak damarını kesmemeye özen gösterin. Temporal kası kafatasından ayırın ve temiz bir kafatası yüzeyi sağlamak için bir dikişle tutun. Ardından, kafatası şeffaflığı ile sol MCA'nın tam konumunu tespit etmek için kafatasını soğuk steril salinle temizleyin.

MCA tanımlandıktan sonra, elmacık arkı ile skuamal kemik arasındaki frontal lobda bir milimetre yuvarlak kraniotomi yapmak için paslanmaz çelik bir çapak kullanın. MCA'yı açığa çıkaran kafatasını dikkatlice çıkarın. Daha sonra, frontal ve posterior MCA dalları arasındaki çatallanmadan hemen önce distal gövdedeki sol MCA'yı kalıcı bir düğümle tıkamak için dokuz sıfır naylon sütür kullanın.

Beyni çıkarmak için, omuriliğin hemen üzerinde ötenazi yapılmış farenin kafasını kesin ve kafatasını ortaya çıkarmak için deride arka ön bir kesi yapın. Daha sonra yan duvarların ve kafatasının tabanının birleştiği yerde iki yanal kesi yapın ve küçük kemik parçasını çıkarın. Daha sonra, sagital sütür boyunca kafatasından bir kesik açın ve beyni ortaya çıkarmak için her yarım kürenin üzerindeki kafatasını çıkarmak için bir forseps kullanın.

Beyni kafatasından ayırmak için bir spatula kullanın ve onu% 4'lük bir PFA çözeltisine aktarın. Üç saat sonra, PFA'yı çıkarın ve beyni kriyo korumak için beyni% 30'luk bir sükroz çözeltisinde inkübe edin. 48 saat sonra, sükroz çözeltisini çıkarın ve beyni eksi 40 santigrat derece isop pentan içinde hızlı bir şekilde dondurun, ardından 30 mikrometre koronal beyin bölümleri yapmak için dondurucu bir mikrotom kullanın.

Bir kriyo koruyucu solüsyonda 10 seri setin toplanması. Her seri set, dilimler arası mesafesi 300 mikrometre olan yaklaşık 14 ila 16 koronal dilimden oluşur. Fare beyninin toplam sızan nötrofil sayısını tahmin etmek için bgma'nın ardından 1.94 ile negatif 2.46 arasında yeterli örneklemesini sağlamak.

Bir optik fraksiyonatör ile MCA oklüzyonundan sonra, önce nötrofilleri sıçan anti LY altı G antikoru ve uygun ikincil antikor ile yüzen bölümler üzerinde konvansiyonel immünofloresan tekniği ile immün boyayın yapın. Daha sonra beyin bölümlerini, enfarktüslü alan sağda olacak şekilde süper don mikroskop slaytlarına monte edin ve stereo araştırmacı yazılımını açın. Ardından, araçlar seri bölüm yöneticisi menüsüne tıklayın ve yeni bölüm düğmesi ile yeni bir bölüm ekleyin.

Bir adet 10. dilim örnekleme fraksiyonu için değerlendirme aralığını 10 olarak ayarlayın. Ardından kontur aşağı menüsünden, enfarktüslü alan kontur aracını seçin. 10 x hedefin altındaki enfarktüslü alanın ana hatlarını çizmek için bir kontur çizin.

Ardından mikroskopta ve objektif menüsünün altında 100 x objektife geçin. Problar menüsü altındaki nötrofilleri ölçmek için, şimdi optik fraksiyonlayıcıyı seçin ve hem X hem de Y ızgara boyutları için sayma çerçevelerinin XY yerleşimini 230'a ayarlayın. Şimdi işaretleyici çubuktan nötrofil düğmesini seçin ve enfarktüslü alandaki lekeli nötrofilleri işaretleyin.

Beyni tek bir hücre süspansiyonuna ayırmak için niceleme sonuçlarını bir elektronik tablo dosyasına aktarın. Beyni az önce gösterildiği gibi çıkardıktan sonra, ipsilateral korteksin çekirdeğini ve enfarktüs alanlarını bir beyin iskemik faresinin beyninden çıkarın. Beyin dokusunu tartın ve deney grupları arasında normalizasyon çağrısı başına beş mililitre buz gibi soğuk RPMI'ye yerleştirin ve ardından dokuyu tek bir hücre süspansiyonuna ayırmak için Teflon tokmaklı bir doku öğütücü kullanın.

Hücre süspansiyonlarını 50 mililitrelik bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın ve numunelere çağrı çözeltisi başına beş mililitre daha RPMI ekleyin. Daha sonra hücre süspansiyonlarını 7, 800 GS ve 25 santigrat derecede 30 dakika santrifüjledikten sonra. Çözeltinin üst kısmında miyiyeline karşılık gelen beyaz renkli bir tabakanın göründüğünden emin olun.

Miyelin tabakasını dikkatlice çıkarın ve peletlenmiş hücreler de dahil olmak üzere tüm hücre süspansiyonunu 40 mikrometrelik bir naylon ağ süzgecinden süzün. Tüm hücrelerin ağdan süzüldüğünden emin olmak için süzgeci 10 mililitre RPMI ile yıkayın ve ardından çözeltiyi 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücrelere 20 mililitre RPMI ekleyin ve daha sonra hücreler döndükten sonra lökosit peletini yeniden süspanse edin.

Bir mililitre PBS'de, eritrositleri parçalamak ve daha sonra hücreleri döndürmek için oda sıcaklığında dört mililitre lizis tamponunda iki ila üç dakika inkübe edin. Hücreleri% 1 BSA ve buz üzerinde uygun antikorları içeren 200 mikrolitre PBS'de etiketleyin. Daha sonra 45 dakika sonra, numuneleri bir mililitre soğuk PBS ile yıkayın ve Resus, akış sitometrik analizi için peletleri 100 mikrolitre faks akış tamponunda yeniden süspanse edin.

Bu model, cavalieri yöntemi ile tahmin edildiği gibi, orta serebral arter tıkanıklığından 24 saat sonra yüksek oranda tekrarlanabilir enfarktüs hacimleri ile karakterizedir. Niyal boyanmış bölümlerde, önceki çalışmalarla uyumlu olarak, nötrofil infiltrasyonu enfarktüs boyutu ile doğrudan ilişkilidir. Ek olarak, lökosit izolasyonu ve akış sitometrik karakterizasyonu, hücre süspansiyonunda bulunan toplam olayların %10 ila 30'unu oluşturan ve hücresel kalıntı ile ilişkili düşük bir ileri saçılma parametresi sunan iskemik farelerin IPS lezyonel hemisferinin korteksinden miyeloid hücrelerin izolasyonuna izin verir.

CD 11 B pozitif hücrelerin daha yüksek bir ileri saçılma değeri vardır, bu da hücre kalıntılarının bu işaretleyici ile etiketlenmediğini ve daha önce belirtildiği gibi, FSC eşiğini LY olarak karakterize edilen 200 nötrofil olarak ayarlayarak daha fazla analizden çıkarılabileceğini düşündürür. altı G pozitif hücre, bu serebral iskemi modeli kullanılarak iskemik fare beyninde MCA tıkanıklığından 24 saat sonra bulunan en çok sayıda sızmış hücre popülasyonudur ve CD 11 B pozitif CD 45 yüksek hücrelerin %70-80'ini oluşturur. Hücrelerin geri kalanı çoğunlukla, orta serebral arter tıkanıklığından 24 ila 48 saat sonra iskemik beyin bölgelerinde yüksek sayılarda bulunan CD 11 B, pozitif CD 45, yüksek LY altı G, negatif altı C yüksek proinflamatuar monositlerin bir alt popülasyonudur. Bu P-M-C-A-O modeli, akış sitometrisi prosedürünü takiben uygun şekilde gerçekleştirilirse 30 dakika içinde gerçekleştirilebilir.

Bu model sistemdeki miyeloid hücrelerin ekspresyon paternleri, metabolik değişiklikleri veya asetik aktiviteleri nelerdir gibi ek soruları yanıtlamak için belirli bir hücre alt kümesinin sıralanması gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, bir iskemi modelinin nasıl oluşturulacağını ve en önemlisi, bir fare beyin hasarında veya cere iskemi sonrası tpe'de sızan miyeloid hücrelerin sayısını ve fenotipini iki farklı yaklaşımla nasıl karakterize edeceğinizi iyi anlamak için.