Name: Geçici veya kalıcı Serebral İskemi Modelinde lökosit alt popülasyonlarının Stereolojik ve Sitometrisi Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Öğrenin, serebral iskemi modelinde fare miyeloid hücre alt popülasyonlarını stereolojik ve akış sitometrisi yöntemleriyle karakterize etme tekniklerini. Bu yöntemler, inme sonrası bağışıklık yanıtını hassas şekilde analiz etmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, İspanya Ekonomi ve Rekabet Edebilirlik Bakanlığı CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) ve RENEVAS RD06/0026/0005 (IL) ve Madrid Yerel Yönetimi S2010/BMD-2336 (MAM) ve S2010/BMD-2349 (IL) tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir. IB ve MIC, İspanya Ekonomi ve Rekabet Edebilirlik Bakanlığı'nın üyesidir.

<ol><li>Chamorro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunology+of+acute+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neurology%22%5BJournal%5D)">The immunology of acute stroke.</a> Nature Reviews. Neurology. 8, 401-410 (2012).</li>
<li>Iadecola, C., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunology+of+stroke%3A+from+mechanisms+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The immunology of stroke: from mechanisms to translation.</a> Nat Med. 17, 796-808 (2011).</li>
<li>Ramlackhansingh, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+after+trauma%3A+microglial+activation+and+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Inflammation after trauma: microglial activation and traumatic brain injury.</a> Annals of Neurology. 70, 374-383 (2011).</li>
<li>Jin, R., Yang, G., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+mechanisms+in+ischemic+stroke%3A+role+of+inflammatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells.</a> J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).</li>
<li>West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+thesubdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> The Anatomical Record. 231, 482-497 (1991).</li>
<li>Charleston, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+cell+number+in+the+central+nervous+system+by+stereological+methods%3A+the+optical+disector+and+fractionator%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Estimating cell number in the central nervous system by stereological methods: the optical disector and fractionator.</a> Current Protocols in Toxicology. 12 (Unit 12.6), (2001).</li>
<li>Begega, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+estimation+of+the+total+number+of+nervous+cells+and+volume+of+medial+mammillary+nucleus+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Unbiased estimation of the total number of nervous cells and volume of medial mammillary nucleus in humans.</a> Experimental Gerontology. 34, 771-782 (1999).</li>
<li>Cuartero, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N2+Neutrophils%2C+Novel+Players+in+Brain+Inflammation+After+Stroke%3A+Modulation+by+the+PPARgamma+Agonist+Rosiglitazone.+Stroke%3B+a%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Circulation%22%5BJournal%5D)">N2 Neutrophils, Novel Players in Brain Inflammation After Stroke: Modulation by the PPARgamma Agonist Rosiglitazone. Stroke; a.</a> Journal of Cerebral Circulation. 44 (12), 3498-3508 (2013).</li>
<li>Campanella, M., Sciorati, C., Tarozzo, G., Beltramo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+inflammatory+cells+in+ischemic+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of inflammatory cells in ischemic rat brain.</a> Stroke. 33, 586-592 (2002).</li>
<li>Carson, M. J., Reilly, C. R., Sutcliffe, J. G., Lo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+microglia+resemble+immature+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Mature microglia resemble immature antigen-presenting cells.</a> Glia. 22, 72-85 (1998).</li>
<li>Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+pattern+of+expression+and+colocalization+of+microglia%2Fmacrophage+phenotype+markers+following+brain+ischemic+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice.</a> J Neuroinflammation. 8, 174(2011).</li>
<li>Denker, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+are+comprised+of+resident+brain+microglia+not+infiltrating+peripheral+monocytes+acutely+after+neonatal+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Macrophages are comprised of resident brain microglia not infiltrating peripheral monocytes acutely after neonatal stroke.</a> Journal of Neurochemistry. 100, 893-904 (2007).</li>
<li>Ballesteros, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosiglitazone-induced+CD36+up-regulation+resolves+inflammation+by+PPARgamma+and+5-LO-dependent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Rosiglitazone-induced CD36 up-regulation resolves inflammation by PPARgamma and 5-LO-dependent pathways.</a> Journal of Leukocyte Biology. 95 (4), 587-598 (2013).</li>
<li>Michel, R. P., Cruz-Orive, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+Cavalieri+principle+and+vertical+sections+method+to+lung%3A+estimation+of+volume+and+pleural+surface+area%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area.</a> J Microsc. 150, 117-136 (1988).</li>
<li>Hernández-Jiménez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silent+Information+Regulator+1+Protects+the+Brain+Against+Cerebral+Ischemic+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Silent Information Regulator 1 Protects the Brain Against Cerebral Ischemic Damage.</a> Stroke. 44 (8), 2333-2337 (2013).</li>
<li>Gundersen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+stereological+tools%3A+disector%2C+fractionator%2C+nucleator+and+point+sampled+intercepts+and+their+use+in+pathological+research+and+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis.</a> APMIS. 96, 857-881 (1988).</li>
<li>Godino, M. E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+ischemic+brain+damage+by+peritoneal+dialysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Amelioration of ischemic brain damage by peritoneal dialysis.</a> J Clin Invest. 123, 4359-4363 (2013).</li>
<li>Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+pathophysiologies+of+focal+brain+ischemia%3A+implications+for+translational+stroke+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1310-1316 (2012).</li>
<li>García-Yébenes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+overload%2C+measured+as+serum+ferritin%2C+increases+brain+damage+induced+by+focal+ischemia+and+early+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Iron overload, measured as serum ferritin, increases brain damage induced by focal ischemia and early reperfusion.</a> Neurochem Int. 61, 1364-1369 (2012).</li>
<li>Sobrado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+lipoxin+A4+by+5-lipoxygenase+mediates+PPARgamma-dependent%2C+neuroprotective+effects+of+rosiglitazone+in+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synthesis of lipoxin A4 by 5-lipoxygenase mediates PPARgamma-dependent, neuroprotective effects of rosiglitazone in experimental stroke.</a> J Neurosci. 29, 3875-3884 (2009).</li>
<li>Cuartero, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N2+Neutrophils%2C+Novel+Players+in+Brain+Inflammation+After+Stroke%3A+Modulation+by+the+PPAR%CE%B3+Agonist+Rosiglitazone%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">N2 Neutrophils, Novel Players in Brain Inflammation After Stroke: Modulation by the PPARγ Agonist Rosiglitazone.</a> Stroke. 44, 3498-3508 (2013).</li>
<li>Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+digestion+with+dispase+substantially+reduces+lymphocyte+and+macrophage+cell-surface+antigen+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression.</a> Journal of Immunological Methods. 194, 71-75 (1996).</li>
<li>Pfenninger, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133+is+not+present+on+neurogenic+astrocytes+in+the+adult+subventricular+zone%2C+but+on+embryonic+neural+stem+cells%2C+ependymal+cells%2C+and+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells.</a> Cancer Research. 67, 5727-5736 (2007).</li>
<li>Tham, C. S., Lin, F. F., Rao, T. S., Yu, N., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+activation+state+and+lysophospholipid+acid+receptor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+International+Society+for+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglial activation state and lysophospholipid acid receptor expression.</a> International Journal of Developmental Neuroscience : the Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 21, 431-443 (2003).</li>
<li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 147(2012).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Burada tanıtılan serebral iskemi modeli son derece tekrarlanabilir enfarktüs hacimleri 24-48 saat ve farklı yaklaşımlar 8,15,17 tarafından MCA bağlanmasından sonra 7 gün tespit verir. Bu MCAO-modelindeki çalışmalarında kullanılan hayvan sayısını en aza indirir kıyasla düşük bir ölüm oranına (% 1&#39;den az) sahiptir. Mortalite bu düşük oran elde etmek için kritik bir adım strok indüksiyon sonrası hayatta kalma bozabilecek enfeksiyonları önlemek için uygun aseptik koşullarda muhafaza etmektir. Bu MCAO model, aynı zamanda, istenen zamanda, bir ilmek ve arka reperfüzyon ile CCA ve MCA geçici ligasyonu ile bir geçiş model olarak, translasyonel araştırma 18 için klinik olarak uygun model olarak kabul edilen bir sürekli MCAO-modelindeki olarak kullanılamaz 19. Bu yöntem, başarılı bir şekilde fareler ve sıçanlar 17,20 kullanılmıştır. Bütün bu deliller ligasyon ile MCAO çoklu uygulamalarla serebral iskemi, yüksek çok yönlü bir model olduğunu gösterir. Bir critiBu tekniğin cal adım, bir stereo mikroskop altında invaziv cerrahi gerektirir; MCA yanı sıra elmacık kemiği zarar değil gibi Kraniyotomi çok dikkatli yapılmalıdır. Ancak, sahte hayvanların kullanımı cerrahi prosedür bağımlı etkilerini ayırt etmek yararlı bir araçtır sağlar (cerrahi prosedür ama CCA ve MCA ligasyonu tabi tutulur gerçekleştirilmez). Bu teknik, aşağıdaki beyin hasarı derecesi, çeşitli yöntemlerle ölçülebilir. Beyin kesit, Nissl boyama ve Cavalieri hacim daha sonra tahmin protokol hasarlı bölgenin tayini için daha kesin sağlar ve seri beyin kesitleri farklı imünohistokimyasal analiz için kullanılabilir çünkü bu tür çalışmalarda kullanılan farelerin sayısını en aza indirir. Bu metodolojinin daha iyi bir performans için, stereoloji yazılımında kullanılan uygun parametreleri seçmek için kritik (Tablo 1) inci tahmin için gerekli olacakformülü ile farklı bölgelerin e hacmi: V = 1 / ssf * Bir f * t * ΣP i (Ssf t bölümlerin ortalama kalınlığı, dilim örnekleme fraksiyonu, bir f ızgara aralığı alanıdır ve ΣP yapıya vurma noktası sayısı). ligasyon ile uzak MCAO infiltre lökosit ve immün hücre alt-popülasyonunu beyin hasarı 1-4 Aşağıdaki iltihabik sürece katılmaya 8,13 karakterize etmek yararlı olabilir. Burada, beyin, bağışıklık hücre karakterizasyonu, kesin stereolojik yaklaşımla ve daha çok sayıda lökosit subpopülasyonunun karakterize bir akım sitometri analizi için iki farklı metodolojiler öneriyoruz. Seri beyin kesit yararlanan, nötrofil sayısının ölçümü hücrelerinin örneklenmiş zekâ sayısından hücrelerinin toplam sayısını tahmin optik parçalama yöntemiyle 16, elde edilebilirha yol X tarafsız sanal sayım alanlar arasında düzgün mesafe ile bizim durumumuzda, enfarktüs bölgesini ilgi tüm bölgeyi kapsayan tarafsız sanal sayma alanlarda, Sistematik rastgele Sampled (SRS) seti, Y ve Z Bu yöntem doğru bir araç sağlar bağlanmasından sonra farklı zamanlarda, iskemik beyin total nötrofil sayısını belirlemek. Bu çalışmada gösterilmiş olmasına rağmen, bu protokol de iskemi 21 sonra diğer sızmış lökositlerin gibi iskemik beyin bulunan diğer hücre popülasyonunun doğru ölçümü için farklı nötrofil alt popülasyonlarının tahmini için kullanılabilir (monositler / makrofajlar) ve aynı zamanda hayatta kalan nöronlar tahmin ya da inme sonrası nöron ölçümü için. olanlar İskemi bölgesinde nötrofil ölçümü için, Tablo 3&#39;de gösterildiği gibi, arzu edilen alanda, doğru bir tahmin etmek için en önemli adımı, uygun parametreler seçimidir.Bu parametreler (ΣQ- ile sayılan toplam hücre sayısı, N = ΣQ- x 1 / ssf x 1 / ASF x 1 / tsf denklemi kullanılarak toplam pozitif hücre sayısı (K) hesaplamak için stereoloji yazılımı için kullanılacaktır parçalama, ssf asf örnekleme fraksiyonu alanı, ve TSF örnekleme fraksiyonu kalınlığı) 5 olduğu, bölüm örnekleme bölümüdür. Bu yöntem, diğer ölçüm teknikleri daha düşük olmasına karşın (örneğin, doku, temsili görüntü veya alan başına nötrofil sayısının densitometri mg nötrofil belirteçlerin analizi), bu tarafsız ve kesin sağlayan bir katı madde teknik olma avantajına sahiptir hücre sayıları ölçümü. Beyin lökosit izolasyon yaklaşım bastırılması için ihtiyacı olan in vivo boyama ya da genetik manipülasyonlar sistem olmadan anında belirlenmesi ve çeşitli immün hücre alt-tiplerinin ölçülmesini sağlar. Karakterize miyeloid p gelen sıralama sonraki hücreopulations veya immünomanyetik ayırma gibi gen veya protein ekspresyonu ile ilgili başka çalışmalar gibi çok sayıda alt baş uygulamalar için kullanılabilir. Bu yöntem ile elde edilen nötrofiller, monositler ve mikroglia doğru karakterizasyon immünohistokimyasal çalışmalar, beyin doğuştan gelen bağışıklık tepkisine aracılık farklı miyeloid hücrelerine özel fonksiyonlar tahsis sağlayan bir avantaj olarak, mevcut yöntemlere göre yüksek spesifisite sağlamaktadır. Buna ek olarak, bundan başka, kanla taşınan makrofajlar (CD11 + CD45 yüksek CD68 +) gibi, uygun bir etiket ile diğer beyin popülasyonları için genişletilebilir ve diğer merkezi sinir sistemi patolojileri ve yaralanma çalışma için uygulanabilir. Bu nedenle bu teknik beyindeki inflamatuvar yanıtın heterojeniteyi keşfetmek için önemli bir araç sağlar. Bu tekniğin bir ana sınırlama değiştirebilir olan taze beyin dokusundan lökosit süspansiyonların hazırlanması bulunduğuhücreler veya bunların antijen değişiklik aktivasyon durumu. Bu teknik, immünohistokimyasal çalışmalara kıyasla daha detaylı bir niteliksel nitelenebilmesine olanak veren, ancak bu hücre izolasyonu göre daha az hassas bir ölçümü içerir. Buna rağmen, hücre izolasyon protokolünün etkinliği diğer yayımlanmış metodolojiler 9 benzer ve etkin bir şekilde kontrol ve MCAO gruplar arasında, hatta farklı tedaviler 8 tabi MCAO grupları arasında beyin bağışıklık hücrelerinin sayısında farklılık tespit etmek için kullanılabilir. Bu protokolün kritik adımlar doku diseksiyonu, doku bozulması prosedürü ve miyelin kaldırma vardır. Doku toplama ile ilgili olarak, bir normalleşme adımı nedeniyle farklı diseksiyon performansları değişkenlik önlemek için (toplanan doku tartarak) dahil edilebilir. Buna ek olarak, farklı MCAO grupları arasında normalleştirme da enfarktüs hacmi ile oluşabilir (daha önce manyetik R belirleniresonance). Bu sorunu çözmek için başka bir yolu hem iskemik ve kontrol gruplarının tüm ipsilateral yarımküre kullanmak, hatta kullanılan hayvan sayısını en aza indirmek için bir kontrol olarak iskemik fare kontralateral yarımkürede kullanmaktır. Bu yaklaşım, her diseksiyon arasındaki farklılıkları önler iken, bir ana dezavantajı vardır; Bir seyreltme faktörü sadece aynı taraf korteks çekirdek ve peri-enfarktüs alanları bulunan miyeloid hücrelerin sayısını hücrelerinin toplam sayısının artırılması, ancak ilave edilir. Doku bozulması ile ilgili olarak, bu protokol beyin hücrelerinin mekanik bozulması için adımlar, enzimatik tedaviler kaçınarak ve yüzey antijeni değişiklik 9,22, inflamatuar hücre alt daha kalitatif ve kantitatif analiz için önemli bir sorun önlenmesi göstermektedir. Ilgi hücre süspansiyonu hazırlanması yanı sıra, beyin örneklerinden miyelin çıkarma downst müdahaleyi önlemek için bir tavsiye adımdırBöyle immünomanyetik hücre ayırma veya sitometri 23,24 akış gibi delmek uygulamalar. Bu durum, farklı yöntemler, örneğin sukroz veya Percoll gradyenleri, ya da anti-miyelin boncuklar kullanılarak gerçekleştirilebilir. Burada, ve hücre verimini arttırmak için kullanılan miyelin kaldırmak için Percoll kullanımı ile birlikte beyin hücre süspansiyonu izolasyonu, mekanik bozulma için farklı yöntemler karşılaştırın ve 25 Canlılığına önceki çalışmalara dayanmaktadır.

Morfolojik, fenotipik ve gen ifadesi mikrogliya değişiklikler yanı sıra ekstravazasyon ve hematojen makrofajlar ve nötrofillerin aktivasyonu beyin hasarı 1-4 aşağıdaki patofizyolojik kaskad bir rol oynadığına inanılmaktadır. Bu protokol iki yaklaşım iskemik beyin farklı miyeloid hücre alt sayısını tahmin etmek ve onların fenotipik karakterizasyonu gerçekleştirmek için sağlar. Buna ek olarak, aynı zamanda, nasıl infarkt değerlendirmek için de dahil olmak üzere, her iki distal Orta Serebral Arter geçici veya kalıcı ligasyonu (MCA) ve ortak karotid arter (CCA) oluşur farelerde serebral iskemi deneysel modelinde, bir açıklamasını sağlar stereolojik yazılımı kullanarak doğru Cavalieri yöntemi ile. iskemik beyin miyeloid hücre alt kümelerini karakterize ilk yaklaşım optik parçalama yaklaşımı 5 dayalı bir stereolojik yöntemdir. Bu en çokyaygın yaşam bilimleri stereolojik sonda kullanılan ve hata 5-7 düşük katsayılı hassas bir yüksek derecede sağlar. Çünkü bölüme dokusunun parçalanması hücre tahminine önyargı önler gibi doku, bölümler halinde kesilir Bu hücre ölçümü için en iyi seçimdir. Bu yöntem numaraları, dinamikleri ve iskemik dokuda 8 sızmış nötrofil alt popülasyonlarının fenotipik değişiklikleri tanımlamak için çok güçlü bir yoludur. İkinci karakterizasyon yaklaşımı beyin lökosit süspansiyonları izole etmek ve akış sitometri onları karakterize etmek basit bir yol sağlar Campanella ve ortak 9 bir modifiye protokol dayanmaktadır. Geleneksel imünohistokimyasal teknikler aksine, bunların diff göre miyeloid hücreler (CD45 yüksek CD11b +) Özellikleri (CD45 lo CD11b +) mikroglia arasında ayrım sağlar akış sitometrisi ve infiltreCD45 9-13 erent ifade seviyeleri. Buna ek olarak, pro-enflamatuar monositler (CD45 yüksek CD11b + Ly-6G - Ly-6C yüksek), nötrofil (CD45 yüksek CD11b + Ly-6G +) ve iskemik doku ve diğer lökositler alt grupları ayırt edilebilir. Bu yaklaşım, beyin iskemisi deneysel modellerinde nöro-inflamasyonu değerlendirmek için güvenilir ve hızlı bir deney sağlar. Bununla birlikte, doku işleme aktivasyon durumunu ve bir yarı-kantitatif karakterizasyonu sağlayan iskemik doku içinde bulunan farklı hücre popülasyonlarının numaraları etkileyebilir.

<table><tbody><tr><td>Fotonik Led F1</td><td>WPI</td><td>571329-8</td><td></td></tr><tr><td>Ekipman Sıcaklık Kontrol Cihazı&nbsp;</td><td>Panlab&nbsp;</td><td>HB 101/2</td><td>Ekipman</td></tr><tr><td>Volvere GX</td><td>NSK</td><td>Ne22L</td><td>Ekipman</td></tr><tr><td>Mikroskobu</td><td>WPI</td><td>PZMIII-BS</td><td>Ekipman</td></tr><tr><td>Paslanmaz Çelik Çapaklar</td><td>FST</td><td>19007-14</td><td>Cerrahi malzeme</td></tr><tr><td>Forseps Dumont #5/45&nbsp;</td><td>FST</td><td>11251-35</td><td>Cerrahi malzeme</td></tr><tr><td>Forseps Dumont #5SF</td><td>FST</td><td>11252-30</td><td>Cerrahi malzeme Sütür</td></tr><tr><td>6/0</td><td>LorcaMarin</td><td>55108</td><td>Cerrahi malzeme</td></tr><tr><td>Sütür 9/0</td><td>LorcaMarin</td><td>61966</td><td>Cerrahi malzeme</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>TE300</td><td></td></tr><tr><td>Ekipman İzofluran</td><td>Esteve</td><td>571329-8</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Sodyum Pentobarbital</td><td>Vetokinol</td><td>570681</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Dondurma mikrotomu</td><td>Leica Microsystems GmbH</td><td>SM2000R</td><td>Ekipmanları</td></tr><tr><td>Superfrost slaytları</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>2014-07</td><td>Laboratuvar malzemesi</td></tr><tr><td>Kresil menekşe asetat</td><td>Sigma</td><td>C5042</td><td></td></tr><tr><td>Kimyasal Mikroskop &nbsp;</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse TE300</td><td>Ekipman</td></tr><tr><td>XYZ motorlu bilgisayar sahne ve denetleyici</td><td>Ludl elektronik Ürünler</td><td></td><td>Ekipman</td></tr><tr><td>Stereo Araştırmacı Sistemi</td><td>Microbrightfield</td><td>Sürüm 7.003 yazılım</td><td>Yazılım</td></tr><tr><td>Yazılım 5 ml Doku Öğütücü, teflon havaneli Potter-Elv</td><td>Thomas Scientific</td><td>0913X70</td><td>Laboratuvar Malzemesi</td></tr><tr><td>Polipropilen 50 ml Meşe Sırtı Santrifüj Tüpü</td><td>Nalgene</td><td>3119-0050&nbsp;</td><td>Laboratuvar malzemesi</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma</td><td>p1644-100</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>BE12-702F</td><td></td></tr><tr><td>Kimyasal Beckman Ultracentrifügue</td><td>Beckman Coulter</td><td>Ekipmanları</td>Beckman Coulter <td></td></tr><tr><td>ultrasantrifüj rotoru 45 Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Ekipmanı</td></tr><tr><td>BD Steril Hücre Süzgeci, 40 Mikron</td><td>BD</td><td>BD 352340</td><td>Laboratuvar Malzemesi</td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Sigma</td><td>A3733-500G</td><td>Reagment</td></tr><tr><td>FcR Bloke Edici Reaktif, fare</td><td>Miltenyi</td><td>130-092-575</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>CD11b-FITC, insan ve fare</td><td>Miltenyi</td><td>130-098-085</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>CD45-PE, fare</td><td>Miltenyi</td><td>130-102-596</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>Anti-Ly-6G-APC, fare</td><td>Miltenyi</td><td>130-102-936</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>PerCP / Cy5.5 anti-fare Ly-6C</td><td>Biolegend</td><td>128012</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>BD FACS Akışı</td><td>BD</td><td>342003</td><td>Reagment</td></tr><tr><td>BD FACSCalibur; 4 renkli</td><td>BD</td><td>342975</td><td>Ekipmanları</td></tr><tr><td>BD Cell Quest Pro Yazılımı</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yazılımı FlowJo yazılımı</td><td>Treestar inc.</td><td></td><td>yazılım</td></tr></tbody></table>

geçici veya kalıcı serebral İskemi modelinde lökosit alt popülasyonlarının stereolojik ve sitometrisi karakterizasyonu

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Mikroglia aktivasyonu, aynı zamanda kan oluşumu, makrofajların ve nötrofillerin ekstravazasyon, felç sonrası beyin hasarına önemli bir rol oynadığına inanılmaktadır. Bu miyeloid hücre alt popülasyonlar farklı fenotipleri ve işlevleri görüntülemek ve seçkin olması gerekir ve doku hasarına onların düzenleme ve katkı çalışma özelliği olabilir. Kesin stereolojik yaklaşım ve bir akım sitometri analizi: Bu protokol beyin bağışıklık hücre karakterizasyonu için iki farklı metodolojiler sağlar. stereolojik yaklaşım sistematik rastgele örnekleme yöntemi ile hesaplanan tahmini faiz (enfarkte beynin) bir alanda hücrelerin toplam sayısını hesaplar optik parçalama yöntemine dayanmaktadır. İkinci karakterizasyon yaklaşımı beyin lökosit süspansiyonları izole etmek ve mikroglianın karakterizasyonu için izin flow sitometri onları karakterize için basit bir yol sunar, monositler ve iskemik doku nötrofillerin sızmış. Buna ek olarak, aynı zamanda, dözel bir ölüm oranı düşük ve Cavalieri yöntemi ile enfarktüs hacmini tanımlamak için histolojik beyin işleme prosedürü ile yüksek oranda tekrarlanabilir infarkt üretilmesi, beyin korteksi etkiler farelerde serebral iskemi modeli etails.

Burada gösterilen serebral iskemi modeli striatum sulama MCA lenticulostriatal kolları (Şekil 1) tıkalı değildir, çünkü striatal doku etkilemeden kortekste sadece görülen infarkt oluşturur. Nissl boyama ile, hasarlı alan bir hipokrom kortikal alanda (Şekil 2) olarak tespit edilebilir. Bu model Nissl-lekeli bölümlerde Cavalieri yöntemi ile tahmin MCAO (% 15.89 ± 0.28 IH) (Şekil 2) 24 saat sonra yüksek tekrarlanabilir enfarktüs hacimleri ile karakterizedir. Cavalieri yöntemi ile infarkt hacmi tahmini contralesional ve ipsilesional hemisferde Gundersen hata (CE) katsayısı hem de infarkt alanı (Tablo 2) yansıyan bir düşük hata ile doğru bir yaklaşımdır. Hasar gören doku hacmi mm 3 hem de bölüm 3.2.13 formül kullanılarak% IH olarak ifade edilebilir. Buna ek olarak, tahminiipsilesional ve contralesional bölgelerin toplam hacminin enfarkte hacim düzeltilmesi için hasarlı dokuya (Tablo 2) olan yüksek değerleri bilmek ödem endeksinin hesaplanmasında sağlar. Beyin dokusunun seri kesit işleme göz önüne alındığında, bu Optik Parçalama yaklaşımı (Şekil 3 ve Tablo 4) kullanılarak, iskemik alanda, infiltre nötrofil gibi, hücre alt tamsayısının doğru tahmin gerçekleştirmek için bir avantaj alınabilir Tablo 3'te gösterilen parametreler ile. Bu protokol, 24 saat sürdürüldü ve pMCAO (Şekil 3D), sonra farede 82.856 ± 8.143 48'de saatte 23.328 ± 3.623 ve infarkt alanı nötrofillerin (Ly6G-pozitif hücreleri), toplam sayısını belirler. Önceki çalışmalarla uyumlu olarak, nötrofil infiltrasyonu doğrudan infarkt (Şekil 3E) ile ilişkilidir. T TahminiOptik Parçalama yöntemiyle nötrofil o sayı Gundersen (Tablo 4) CE tarafından yansıtılır, düşük hata ile doğru bir yaklaşımdır. lökosit izolasyonu ve karakterizasyonu protokolü flow sitometri iskemik farelerin ipsilesional yarımkürenin korteks 47.922 ± 23.174 miyeloid hücrelerin izolasyonu sağlar. Bu hücre süspansiyonu içinde bulunan toplam olayların% 10-30 ihtiva etmektedir. Hücresel enkaz (Şekil 4) ilişkili bu protokolü mevcut düşük FSC parametresi kullanılarak çekilen olayların büyük çoğunluğu. CD11 boyama CD11b + hücrelerinin daha önce belirtildiği gibi bu, 200 9'da FSC eşiği ayarı ile analiz dışında olabilir ki, hücre döküntüsü, bu işaretleyici ile etiketlenmiş olmadığını göstermektedir ve (Şekil 4) daha yüksek bir FSC değerine sahip olduğunu göstermektedir. Bu yöntemle elde edilen hücre enkaz değişebilen miktarda örnek süreci o farklılıkları göstermektediring (zamanlama, doku koruma, örnek sıcaklığı, verimli miyelin kaldırma, vb) bunun için hesap edebilirsiniz. Buna ek olarak, hücre süzgeçler kullanımı da örneklerde hücresel kelepçeler yok etmek için gerekli olan; Bu aşama, hücre boyama için yapılması gerekmektedir. CD11b ve CD45 ekspresyonu göre Şekil 5'te gösterilen yolluk strateji kullanarak, iskemik doku içinde yerleşik ve infiltre miyeloid hücrelerin birbirinden ayırabilir. Iskemik hemisferde bu CD11 + popülasyonu artar (Şekil 4, Şekil 5 ve Tablo 5) saf ve bu hücreler, çoğunlukla mikroglia iskemi sonrası çoğalan gösteren CD45 düşük ekspresyonu ile ilişkili olan plasebo grubu ile karşılaştırıldığında . Iskemik beyin bir CD11b + CD45 yüksek hücre alt-popülasyonu ortaya çıkması ile kanıtlandığı gibi bu fark (nedeniyle çevre hücre infiltrasyonuna Şekil 4, büyük olasılıklaŞekil 5 ve naif ve sahte beyinlerinde az sayıda olan Tablo 5). Beyin iskemi CD11b + hücre popülasyonuna infiltratların katkısı çok dinamik bir süreç 4. Bağlanması ile MCAO-modelindeki olarak,% 30 ila lezyonun büyüklüğüne ve karakterizasyonu yapılmıştır zaman bağlı olarak, toplam CD11b + hücrelerinin% 60 arasında değişebilir. Ly-6G + hücreleri gibi, özelliği Nötrofiller, bunlar CD11b + CD45% 70-80 ihtiva gibi, serebral iskemi, bu model kullanılarak iskemik fare beyninde MCAO 24 saat sonra bulunan en çok infiltre hücre popülasyonu hi. Ly-6C hi pro-inflamatuar monositlerin - hücrelerin geri kalanı çoğunlukla CD11 + CD45 hi Ly-6G bir ICSI'nin vardır. Bu modelde, bu nüfus 24 den MCAO sonra 48 saat iskemik beyin bölgelerinde sayısı artacak. Şekil 1:. MCA ligasyon için cerrahi prosedür, (A) geçici kas retraksiyonu sonra, küçük bir kranyotomi fare kafatası içinde gerçekleştirilir. MCA bir düğüm veya 9/0 sütür kullanarak bir ilmek ile bağlanır. (B) MCAO modeli tarafından üretilen kortikal lezyon Temsilcisi görüntüleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52031/52031fig2.jpg"> Şekil 2: Cavalieri tarafından infarkt hacmi miktarının belirlenmesi. (A) Nissl-lekeli beyin kesitlerinin Temsilcisi görüntüleri kalıcı MCA bağlanmasından sonra 24 saat. yüksek büyütme Nissl boyama sonra hipocromatic alanı gösterirMCAO'dan sonra hasarlı bölgeyi (çekirdek) tanımlar. Peri-Enfarktüs (PI) bölgesi de gösterilmiştir. (B) (n = MCAO sonra, seri Nissl lekeli bölümlerde 50 fare, 24 saat Cavalieri yöntemi kullanılarak% infarkt Yarımküre (% IH) olarak temsil enfarktüs hacminin sayısallaştırılması ). <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52031/52031fig3.jpg"> Şekil 3: infarkt alanında 24 nötrofil ve bağlanmasından sonra 48 saat içinde Stereolojik miktar, Optik Parçalama yöntemi kullanılarak. MCAO'dan 24 saat sonra İskemi bölgesinde infiltre edilmiş nötrofil (Ly6G-pozitif hücreleri) (A) Örnek görüntüsü. Sınırlandırılması enfarkte alanı göstermektedir. (B, C) ​​optik parçalama nötrofil ölçümü için bir optik dissektör örnekler. (D) 24 ° C'da enfarkte bölgedeki toplam nötrofil miktar tayini ve 48 saat (n = 4 fare). (E)Enfarktüs 24 boyuta ve MCA bağlanmasından sonra 48 saat ile nötrofil sayısının korelasyonu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52031/52031fig4.jpg"> Şekil 4:. Fiziksel parametreler (SSC ve FSC) temelinde naif, sahte ve iskemik (MCAO sonra 24 saat) hemisfer elde edilen beyin lökositlerin Temsilcisi nokta-arsa dağılım analizi CD11b (kırmızı) ifade olaylar bir nüfus tespit edilmiştir Tüm gruplarda. Bu popülasyon CD45 ekspresyonu göre kapı ve karakterize edildi. CD45 (yeşil) düşük seviyelerde ifade hücreler iskemik ve non-iskemik beyin korteksinde bulunan ve mikrogliyal hücrelere karşılık geldi. Bunun aksine, hücre (sarı) CD45 seviyeleri sentezleyen tektiniskemik yarımkürede ve plasebo grubunda daha az ölçüde bulunamadı. CD11 +, CD45 yüksek nüfusun daha fazla analizi, nötrofil (Ly-6G + hücreleri, mavi) ve pro-enflamatuar monositler (Ly-6C yüksek hücreleri, portakal), ana hücre, beyinde bulunan alt-popülasyonları bulunduğunu inme 24 saat sonra sızan olduğunu gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig4large.jpg" target="_blank">edin Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52031/52031fig5.jpg"> Şekil 5:. Iskemik doku infiltrasyonu miyeloid hücreleri yerleşik ayırt etmek için stratejiler yolluk CD11 + hücresi, ilk izotip floresan yoğunluğu (A) 'ya göre olan kapı edildi. Iskemik beyin hücre süspansiyonları bir temsilcisi nokta arsa panelinin yukarı-sağ köşesinde gösterilir. IçindeAyrıca, bu tekniği kullanarak elde edilen olayların toplam sayısı ve CD11b + olayların sayısı için tipik değerler (gösterilmiştir hayır hücre / iskemik beyin hemisfer;. (A) CD11b + hücrelerinin CD45 Floresan yoğunluğu analizi panelinde gösterilir kapılı CD11 + alt populasyonun CD45 ve CD11 ifade B. temsilcisi nokta arsa analizi panelinin yukarı-sağ köşesinde gösterilir. Buna ek olarak, iskemik beyin yarımkürede başına elde edilen CD45 lo CD45 hi hücrelerin tipik sayısı bu tekniği kullanarak (B) gösterilir. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col span="2"></colgroup><tbody><tr><td colspan="2"> Cavalieri yöntem için kullanılan parametreler </td></tr><tr><td> Bölüm Kalınlığı (t) </td><td> 30 um </td></tr><tr><td> Nesnel </td><td> 10X </td></tr><tr><td> Dilim örnekleme fraksiyonu (ssf) </td><td> 1/ 20 </td></tr><tr><td> Bölümleri arasındaki mesafe </td><td> 600 mikron </td></tr><tr><td> Izgara Aralığı </td><td> 100 um </td></tr></tbody></table> Tablo 1: enfarkte doku stereolojik ölçümü için kullanılan parametreler. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Sonuçlar </td><td> Contralesional </td><td> Ipsilesional </td><td> Enfarktüs </td></tr><tr><td> Konum (μm²) </td><td> 151.460.000 </td><td> 155.060.000 </td><td> 22.600.000 </td></tr><tr><td> Hacim (μm³) </td><td> 90876000000 </td><td> 93036000000 </td><td> 13560000000 </td></tr><tr><td> Cilt için düzeltildi Projeksiyon üzerinde (μm³) </td><td> 89957100000 </td><td> 92046300000 </td><td> &lt;strong&gt; 13416600000 </td></tr><tr><td> Hata Katsayısı (Gundersen), m = 0 </td><td> 0.068 </td><td> 0.077 </td><td> 0.067 </td></tr><tr><td> Hata Katsayısı (Gundersen), m = 1 ' </td><td> 0.015 </td><td> 0.017 </td><td> 0.015 </td></tr><tr><td> Hata Katsayısı (Gundersen), a (k) </td><td> 0.068 </td><td> 0.077 </td><td> 0.067 </td></tr><tr><td colspan="2"> % Enfarktüslü Yarımküre </td><td colspan="2"> 14.90 </td></tr><tr><td colspan="2"> Beyin Ödemi (Ips Cilt / Vol Devam) </td><td colspan="2"> 1.02 </td></tr></tbody></table> Tablo 2: Stereo Araştırmacı Yazılımı kullanarak Cavalieri yöntemi ile, contralesional ipsilesional ve enfarktüs hacimleri temsili örnekleri. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td col>Optik kincinin için kullanılan açıklık = "2"&gt; Parametreler </td></tr><tr><td> Bölüm Kalınlığı (TSF) </td><td> 30 um </td></tr><tr><td> Nesnel </td><td> 100X </td></tr><tr><td> Dilim örnekleme fraksiyonu (ssf) </td><td> 1/10 </td></tr><tr><td> Çerçeve Yüksekliği Sayma </td><td> 40 um </td></tr><tr><td> Çerçeve Genişliği Sayma </td><td> 40 um </td></tr><tr><td> X ızgara boyutu </td><td> 230 mikron </td></tr><tr><td> X ızgara boyutu </td><td> 230 mikron </td></tr><tr><td> Güvenli Guard </td><td> 2 um </td></tr><tr><td> Optik Disektör Yükseklik </td><td> 14 um </td></tr></tbody></table> Tablo 3: Stereo Araştırmacı Yazılımı kullanarak optik parçalama probu ile beyin iskemi sonrasında sızmış nötrofillerin stereolojik ölçümü için kullanılan parametreler. <table border="0" cellpadding="0" cellspadans ediyorum='"0"&gt;'><tr><td colspan="2"> Optik parçalama tarafından Nötrofiller Tahmini </td></tr><tr><td> Örnekleme Siteleri Sayısı </td><td> 430 </td></tr><tr><td> Şekil Faktörü </td><td> 6.24 </td></tr><tr><td> Toplam belirteçler Sayılan </td><td> 166 </td></tr><tr><td> Optik parçalama Tahmin Nötrofiller </td><td> 117,608.03 </td></tr><tr><td> Hata Katsayısı (Gundersen), m = 0 </td><td> 0.22 </td></tr><tr><td> Hata Katsayısı (Gundersen), m = 1 </td><td> 0.09 </td></tr></table> Tablo 4: Stereo Araştırmacı Yazılımı kullanarak Optik Parçalama probu ile beyin iskemi sonrasında tahmin sızmış nötrofillerin Temsilcisi örneği. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> CD11b + </td><td> Nötrofiller </td><td> Monositler </td><td> Mikroglia </td></tr><tr><td> Saf </td><td> 25.863 ± 4,575.8 </td><td> 473 ± 75.8 </td><td> 525 ± 191,4 </td><td> 19.012 ± 1,523 </td></tr><tr><td> Sham 24 saat </td><td> 24.563 ± 5.263 </td><td> 873 ± 192.5 </td><td> 1,124 ± 391,5 </td><td> 23.734 ± 2.910 </td></tr><tr><td> pMCAO 24 saat </td><td> 47.922 ± 23.174 </td><td> 4874 ± 748,7 </td><td> 4826 ± 1,345 </td><td> 35.395 ± 10.833 </td></tr></tbody></table> Tablo 5: yaklaşımla sitometri Akış ile beyin iskemi sonrasında tahmin miyeloid hücrelerin Temsilcisi sonuçları.

Inme sonrası beyin miyeloid hücreler karakterizasyonu optik parçalama yöntemi kullanılarak stereolojinin tarafından gerçekleştirilen, ya da beynin bir akım sitometri ile süspansiyonları lökosit olabilir. Her ikisi de iskemik beyin bulundu ana miyeloid hücre alt doğru fenotipik ayrımı gerçekleştirmek için yararlı teknikler vardır.

Geçici veya kalıcı Serebral İskemi Modelinde lökosit alt popülasyonlarının Stereolojik ve Sitometrisi Karakterizasyonu

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

Bu prosedürün genel amacı, iskemik beynin fare miyeloid hücre alt kümelerini iki farklı metodoloji ile karakterize etmektir. İlk olarak, hem ortak karotis arter veya CCA'nın hem de orta serebral arterin distal gövdesinin veya esas olarak beyin korteksini etkileyen MCA oluşturan enfarktüsün tıkanmasıyla kalıcı bir serebral iskemi modeli tanıtılır. Daha sonra miyeloid hücre alt kümelerinin stereo mantıksal nicelemesi için, beynin seri koronal bölümleri, ilgilenilen hücreler için immün boyadır ve daha sonra sızan hücreler, optik fraksiyonatör yaklaşımı ile ölçülür.Alternatif olarak, miyeloid hücreler mekanik ayrışma ile taze beyin dokusundan izole edilebilir ve daha sonra akış sitometrisi ile boyanabilir ve analiz edilebilir. Sonuç olarak, serebral iskemi sonrası fare beynine sızan spesifik miyeloid hücre alt kümelerinin doğru bir miktar tayini ve ayrıntılı kalitatif karakterizasyonu, sırasıyla stereo kantifikasyon ve multiparametrik akış sitometrisi ile elde edilebilir. Bu iskemi seri modelinin mevcut diğer modellere göre en büyük avantajı, tekniğimizin diğer yöntemlere göre önemli ölçüde daha düşük mortalite oranlarına sahip olması ve çalışma için gereken hayvan sayısını en aza indirgemesidir.Bu alan, beyin hasarında mikro reaktivasyon, hematojen makrofajların ekstravazasyonu veya nötrofillerin rolleri gibi inme alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilecek bir yöntemdir. Bu yazıda gösterilen multiparametrik sitometri yaklaşımları üzerinde doğru teolojik niceleme, CE iskemiye doğuştan gelen immün yanıtın her ikisinde de miyeloid hücre popülasyonunun sayı fenotipi ve işlevi hakkında fikir verebilir. Önce CCA'yı bağlamak için, cerrahi mikroskop altında hayvanın boynunun ventral yüzeyi etrafında bir santimetre orta hat kesisi yapın.Diseke edildikten sonra, distal MCA'yı bağlamak için sol CCA'yı kalıcı bir düğümle tıkamak için altı sıfırlı bir naylon sütür kullanın. Ardından, temporal kas üzerinde sağdan sola yatay bir kesi yapın. Ardından temporal kasın sağ tarafında ikinci bir dikey kesi yapın.Şakak damarını kesmemeye özen gösterin. Temporal kası kafatasından ayırın ve temiz bir kafatası yüzeyi sağlamak için bir dikişle tutun. Ardından, kafatası şeffaflığı ile sol MCA'nın tam konumunu tespit etmek için kafatasını soğuk steril salinle temizleyin.MCA tanımlandıktan sonra, elmacık arkı ile skuamal kemik arasındaki frontal lobda bir milimetre yuvarlak kraniotomi yapmak için paslanmaz çelik bir çapak kullanın. MCA'yı açığa çıkaran kafatasını dikkatlice çıkarın. Daha sonra, frontal ve posterior MCA dalları arasındaki çatallanmadan hemen önce distal gövdedeki sol MCA'yı kalıcı bir düğümle tıkamak için dokuz sıfır naylon sütür kullanın.Beyni çıkarmak için, omuriliğin hemen üzerinde ötenazi yapılmış farenin kafasını kesin ve kafatasını ortaya çıkarmak için deride arka ön bir kesi yapın. Daha sonra yan duvarların ve kafatasının tabanının birleştiği yerde iki yanal kesi yapın ve küçük kemik parçasını çıkarın. Daha sonra, sagital sütür boyunca kafatasından bir kesik açın ve beyni ortaya çıkarmak için her yarım kürenin üzerindeki kafatasını çıkarmak için bir forseps kullanın.Beyni kafatasından ayırmak için bir spatula kullanın ve onu% 4'lük bir PFA çözeltisine aktarın. Üç saat sonra, PFA'yı çıkarın ve beyni kriyo korumak için beyni% 30'luk bir sükroz çözeltisinde inkübe edin. 48 saat sonra, sükroz çözeltisini çıkarın ve beyni eksi 40 santigrat derece isop pentan içinde hızlı bir şekilde dondurun, ardından 30 mikrometre koronal beyin bölümleri yapmak için dondurucu bir mikrotom kullanın.Bir kriyo koruyucu solüsyonda 10 seri setin toplanması. Her seri set, dilimler arası mesafesi 300 mikrometre olan yaklaşık 14 ila 16 koronal dilimden oluşur. Fare beyninin toplam sızan nötrofil sayısını tahmin etmek için bgma'nın ardından 1.94 ile negatif 2.46 arasında yeterli örneklemesini sağlamak.Bir optik fraksiyonatör ile MCA oklüzyonundan sonra, önce nötrofilleri sıçan anti LY altı G antikoru ve uygun ikincil antikor ile yüzen bölümler üzerinde konvansiyonel immünofloresan tekniği ile immün boyayın yapın. Daha sonra beyin bölümlerini, enfarktüslü alan sağda olacak şekilde süper don mikroskop slaytlarına monte edin ve stereo araştırmacı yazılımını açın. Ardından, araçlar seri bölüm yöneticisi menüsüne tıklayın ve yeni bölüm düğmesi ile yeni bir bölüm ekleyin.Bir adet 10. dilim örnekleme fraksiyonu için değerlendirme aralığını 10 olarak ayarlayın. Ardından kontur aşağı menüsünden, enfarktüslü alan kontur aracını seçin. 10 x hedefin altındaki enfarktüslü alanın ana hatlarını çizmek için bir kontur çizin.Ardından mikroskopta ve objektif menüsünün altında 100 x objektife geçin. Problar menüsü altındaki nötrofilleri ölçmek için, şimdi optik fraksiyonlayıcıyı seçin ve hem X hem de Y ızgara boyutları için sayma çerçevelerinin XY yerleşimini 230'a ayarlayın. Şimdi işaretleyici çubuktan nötrofil düğmesini seçin ve enfarktüslü alandaki lekeli nötrofilleri işaretleyin.Beyni tek bir hücre süspansiyonuna ayırmak için niceleme sonuçlarını bir elektronik tablo dosyasına aktarın. Beyni az önce gösterildiği gibi çıkardıktan sonra, ipsilateral korteksin çekirdeğini ve enfarktüs alanlarını bir beyin iskemik faresinin beyninden çıkarın. Beyin dokusunu tartın ve deney grupları arasında normalizasyon çağrısı başına beş mililitre buz gibi soğuk RPMI'ye yerleştirin ve ardından dokuyu tek bir hücre süspansiyonuna ayırmak için Teflon tokmaklı bir doku öğütücü kullanın.Hücre süspansiyonlarını 50 mililitrelik bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın ve numunelere çağrı çözeltisi başına beş mililitre daha RPMI ekleyin. Daha sonra hücre süspansiyonlarını 7, 800 GS ve 25 santigrat derecede 30 dakika santrifüjledikten sonra. Çözeltinin üst kısmında miyiyeline karşılık gelen beyaz renkli bir tabakanın göründüğünden emin olun.Miyelin tabakasını dikkatlice çıkarın ve peletlenmiş hücreler de dahil olmak üzere tüm hücre süspansiyonunu 40 mikrometrelik bir naylon ağ süzgecinden süzün. Tüm hücrelerin ağdan süzüldüğünden emin olmak için süzgeci 10 mililitre RPMI ile yıkayın ve ardından çözeltiyi 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücrelere 20 mililitre RPMI ekleyin ve daha sonra hücreler döndükten sonra lökosit peletini yeniden süspanse edin.Bir mililitre PBS'de, eritrositleri parçalamak ve daha sonra hücreleri döndürmek için oda sıcaklığında dört mililitre lizis tamponunda iki ila üç dakika inkübe edin. Hücreleri% 1 BSA ve buz üzerinde uygun antikorları içeren 200 mikrolitre PBS'de etiketleyin. Daha sonra 45 dakika sonra, numuneleri bir mililitre soğuk PBS ile yıkayın ve Resus, akış sitometrik analizi için peletleri 100 mikrolitre faks akış tamponunda yeniden süspanse edin.Bu model, cavalieri yöntemi ile tahmin edildiği gibi, orta serebral arter tıkanıklığından 24 saat sonra yüksek oranda tekrarlanabilir enfarktüs hacimleri ile karakterizedir. Niyal boyanmış bölümlerde, önceki çalışmalarla uyumlu olarak, nötrofil infiltrasyonu enfarktüs boyutu ile doğrudan ilişkilidir. Ek olarak, lökosit izolasyonu ve akış sitometrik karakterizasyonu, hücre süspansiyonunda bulunan toplam olayların %10 ila 30'unu oluşturan ve hücresel kalıntı ile ilişkili düşük bir ileri saçılma parametresi sunan iskemik farelerin IPS lezyonel hemisferinin korteksinden miyeloid hücrelerin izolasyonuna izin verir.CD 11 B pozitif hücrelerin daha yüksek bir ileri saçılma değeri vardır, bu da hücre kalıntılarının bu işaretleyici ile etiketlenmediğini ve daha önce belirtildiği gibi, FSC eşiğini LY olarak karakterize edilen 200 nötrofil olarak ayarlayarak daha fazla analizden çıkarılabileceğini düşündürür. altı G pozitif hücre, bu serebral iskemi modeli kullanılarak iskemik fare beyninde MCA tıkanıklığından 24 saat sonra bulunan en çok sayıda sızmış hücre popülasyonudur ve CD 11 B pozitif CD 45 yüksek hücrelerin %70-80'ini oluşturur. Hücrelerin geri kalanı çoğunlukla, orta serebral arter tıkanıklığından 24 ila 48 saat sonra iskemik beyin bölgelerinde yüksek sayılarda bulunan CD 11 B, pozitif CD 45, yüksek LY altı G, negatif altı C yüksek proinflamatuar monositlerin bir alt popülasyonudur. Bu P-M-C-A-O modeli, akış sitometrisi prosedürünü takiben uygun şekilde gerçekleştirilirse 30 dakika içinde gerçekleştirilebilir.Bu model sistemdeki miyeloid hücrelerin ekspresyon paternleri, metabolik değişiklikleri veya asetik aktiviteleri nelerdir gibi ek soruları yanıtlamak için belirli bir hücre alt kümesinin sıralanması gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, bir iskemi modelinin nasıl oluşturulacağını ve en önemlisi, bir fare beyin hasarında veya cere iskemi sonrası tpe'de sızan miyeloid hücrelerin sayısını ve fenotipini iki farklı yaklaşımla nasıl karakterize edeceğinizi iyi anlamak için.

stereological-flow-cytometry-characterization-leukocyte

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Mevcut makalede, verimli, etkin bir şekilde akışını sitometrik analizler için kullanılabilir beyin ve omurilik dokularında mononükleer hücreleri izole etmek için hızlı bir protokol tanımlamaktadır.

Beyin ve Omurilik Mononükleer Hücreleri İzolasyon Percoll Degradeler

Fare beyni infiltre lökositler elde etmek için hızlı bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, sürekli Percoll degrade ve süreksiz Ficoll degrade lökosit zenginleştirilmiş katmanı seçin ve arındırmak için kullanır. İzole lökositler akım sitometrik ölçümleri ile karakterize olabilir.

Beyin-infiltre lökositler izolasyonu

Serebral perfüzyon izleme iskemik inme modelleri doğruluğunu geliştirmek için gösterilmiştir. Teknik zorluklar sıklıkla serebrovasküler araştırma için bu önemli aracının kullanımını sınırlamak. Bu videoda, optimize edilmiş bir sistem sıçanlarda intraluminal orta serebral arter oklüzyonu sırasında tek veya çoklu-site hemodinamik izleme elde etmek gösterilmiştir.

Intraluminar Orta Serebral Arter Tıkanıklığı ve Sıçan Strok Model Serebral Perfüzyon İzleme için Optimize Sistemi

Beyin inflamatuar yanıtının karmaşıklığı hakkında yeni bilgiler edinmenin bir yolu sunulmaktadır. İmmünofloresan tabanlı protokolleri ve ardından fokal iskeminin bir fare modelinde mikroglia/makrofaj fenotip belirteçlerinin birlikte ekspresyon modelini araştırmak için üç boyutlu konfokal analizi tanımladık.

Deneysel Beyin Hasarında Polarizasyonun Mikroglia/Makrofaj Belirteçlerinin Üç Boyutlu Konfokal Analizi

Tromboembolik inme modelleri, rekanalizasyon tedavisini optimize etmek için hayati araçlardır. Burada, tromboz ve enfarktüsü tetikleyen ve inme hastalarındakine benzer bir terapötik pencerede doku plazminojen aktivatörü (tPA) aracılı fibrinolize olumlu yanıt veren geçici serebral hipoksik-iskemik (tHI) insafa dayalı bir murin trombotik inme modeli sunulmaktadır.

Geçici Serebral Hipoksi-iskemi Dayalı Bir Trombotik İnme Modeli

İnflamasyon, iskemik inme patogenezinde merkezi bir rol oynar. Artan kanıtlar, erken beyin hasarını şiddetlendiren iki ucu keskin bir kılıç gibi davrandığını, ancak aynı zamanda daha sonraki onarıma da katkıda bulunduğunu göstermektedir. Bu protokol, immün hücrelerin iskemik beyinden izolasyonunu ve müteakip akış sitometrik fenotiplemesini tanımlar.

İskemik Fare Beyin gelen Bağışıklık Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

Serebral iskemi-reperfüzyon bir fare modeli kontur Patofizyoloji araştırmak için kuruldu. Klemple sağ orta serebral arter ve şu ortak Karotid arter ligate ve kan akımı iskemi 10-40 dakika sonra geri yükleme.

Serebral iskemi-reperfüzyon iki damar tıkanıklığı fare modeli

Bu protokol, iskemik inmenin bir murin modeli olan geçici orta serebral arter tıkanıklığını takiben pulmoner ortamda immün hücre kompozisyonu, sitokin profili ve kemokin profilindeki değişiklikleri tanımlamak için flow sitometrinin kullanımını açıklamaktadır.

Pulmoner Ortamda İmmün Hücrelerin ve Proinflamatuar Mediatörlerin Karakterizasyonu

Beyin bozukluklarına karşı bağışıklık tepkisini araştırmak için yaygın bir yaklaşım, bağışıklık hücrelerindeki değişiklikleri analiz etmektir. Burada, murin beyin dokusu ve kafatası kemik iliğinden bağışıklık hücrelerini izole etmek için iki basit ve etkili protokol sağlanmıştır.

Fare Beyninden ve Kafatasından İmmün Hücrelerin İzole Edilmesi

Burada, mini inme modelinde akış sitometrik analizi kullanarak iskemik inme sonrası immün hücre fonksiyonunu değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, nöroimmün etkileşimlerin ayrıntılı olarak incelenmesini sağlar ve diğer nörodejeneratif hastalıkları incelemek için uyarlanabilir ve inme patolojisindeki immün yanıtları anlamamızı geliştirir.

Mini İnme Murin Modelinde Nöroimmün Etkileşimlerin İzolasyonu ve Flow Sitometrik Değerlendirmesi

Öğrenin, serebral iskemi modelinde fare miyeloid hücre alt popülasyonlarını stereolojik ve akış sitometrisi yöntemleriyle karakterize etme tekniklerini. Bu yöntemler, inme sonrası bağışıklık yanıtını hassas şekilde analiz etmeyi sağlar.

Geçici veya kalıcı Serebral İskemi Modelinde lökosit alt popülasyonlarının Stereolojik ve Sitometrisi Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet