Name: Musküler Distrofi Hastalarda gelen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin oluşturulması: İdrar Türetilmiş Hücre Verimli Entegrasyonu-ücretsiz yeniden programlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Öğrenin, müsküler distrofi hastalarından idrar türetilmiş hücreleri kullanarak entegrasyon-ücretsiz iPSC üretme yöntemini. Sendai virüsü ile hızlı yeniden programlama sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu protokolün geliştirilmesi, Daha Sağlıklı Bir Wisconsin'in Geliştirilmesi ve Ulusal Sağlık Enstitüleri, Translasyonel Bilimleri Geliştirme Ulusal Merkezi tarafından 8UL1TR000055 Hibe Numarası ile desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve NIH'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

NOT: Hastalar ve / veya veliler çalışmayı onayladı bir Kurumsal Değerlendirme Kurulu katılmak için bilgilendirilmiş onam vermelidir. 1. Tamponlar ve Medya Hazırlıklar <ol><li> Yıkama tamponu: yıkama tamponu 100 ml hazırlamak fosfat tamponlu salin (PBS) ile 99 ml 100x pen / strep çözeltisi (Streptomisin 100 U / ml penisilin + 100 ug / ml), 1 ml ekleyin. </li><li> İdrar Progenitor Hücre (UPC) Orta: UPC orta hazırlamak keratinosit Serum Ücretsiz (KSF) Orta + Progenitor Hücre Orta eşit hacimlerde karıştırmak için. <ol><li> KSF Orta: epidermal büyüme faktörü 5 ng / ml (EGF), büyükbaş hayvan hipofız bezi ekstraktı, 50 ng / ml (BPB), kolera toksini, 30 ng / ml, ve pen / strep çözeltisi (100 u ilave keratinosit ortamı hazırlamak için / ml penisilin, 500 ml, KSF ortam için, 100 ug / ml streptomisin). </li><li> Progenitor Hücre Orta: FBS, 0.4 ug / ml hidrokortizon, 0.1 Ham-F12 medya dörtte biri ile DMEM dörtte üçü ekleyin ve% 10 ile eknM, kolera toksini, 5 ng / ml insülin, 1.8 x 10 -4 M adenin / ml transferin, 2 x 10 -9 M triiyodo tironin, 10 ng / ml EGF ve pen / strep solüsyonu 5 ug. </li></ol></li><li> embriyonik kök Ortamı:% 20 KO-serum yerine (K-SR), 1x MEM esansiyel olmayan amino asitler, 2 mM L-glutamin, 100 uM β-merkaptoetanol, 20 ng / ml bFGF ve pen / strep ekleyin 400 mi DMEM / F12 ortamı. </li></ol> 2. İdrar Numune Toplama <ol><li> Idrar yeterli miktarda (~ 30-40 ml) tahsil edilebilir olmasını sağlamak için idrar toplama 30 dakika önce sıvıları içmek hasta söyleyin. </li><li> Hasta ve / veya onların veliler aşağıdaki öğeleri içeren bir idrar toplama kiti ver: (1) steril ya da temiz yakalamak idrar örneği almak için nasıl yazılı talimatlar, (2) nemli bir anti-bakteriyel tuvaletler, ve (3) 100 ml steril örnek toplama fincan. Örnek toplamak için hasta söyleyin. </li><li> Hemen buz üzerinde idrar örnekleri yer ve laborant transferBir soğutucu tory. Hemen hücre izolasyonu için idrar işleyin. Bir gecikme kaçınılmaz ise, hücre canlılığı kaybıyla kadar 4 saat boyunca buz üzerinde numune saklamak. </li></ol> 3. İzolasyon ve İdrar Hücreleri Genişleme NOT: Bir BSL2 Biyolojik Güvenlik Kabinesi steril koşullar altında aşağıdaki adımları uygulayın. <ol><li> Steril pipetler kullanarak, transferi idrar örnekleri 50-ml santrifüj tüpleri steril alanlar. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Tüp içinde 1 ml bırakarak süpernatant aspire; Hücre pelet rahatsız etmemek için dikkatli olun. </li><li> Süspanse yıkama tamponu 7 ml birden çok tüpünden elde edilen taneler bir araya ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g&#39;de tekrar santrifüj ve. </li><li> Dikkatle hücre pelet ve süpernatant ~ 0,2-0,5 ml bırakarak, süpernatant aspire. İdrar Progenitor Hücre (UPC) orta 2-3 ml süspanse ve un 4-6 kuyulara süspansiyon transferikaplanmış 24 oyuklu plaka. </li><li> 72 saat sonra, göz başına taze UPC ortamı, 0.5 ml kültür ek ve 2-3 gün sonra ortam değiştirin. plaka takmak gerekmez eritrosit ve skuamöz hücreler orta değişikliklerle silinecektir. </li><li> 4-6 gün sonra kültür izleyin. NOT: Küçük 2-4 hücre kolonileri görünmeye başlayacak. Hücreler yuvarlak veya tip I veya renal epitel (RE) hücrelerin sırasıyla 3 tip II temsil eden uzamış olacaktır. </li><li> Hücreler görünür bir kez, onlar hızlı bir genişleme fazı uğrayacak beri her 2-3 günde orta değiştirin. </li><li> Hücreler% 80-90, kaplama sonra yaklaşık 9-15 gün ulaştıklarında, daha da genişlemesi için 24 plaka 2-4 kuyuları üzerine hücreleri (15,000-18,000 hücre / cm 2) ayırmak ve geçit. Hücre geçişi 1 (P1) olarak bu işaretleyin. </li><li> Akım sitometri analizi yoluyla soy özellikleri için idrar hücreleri karakterize immunohistochemnik boyama ya da ters transkriptaz-polimeraz zincir reaksiyonu yoluyla (RT-PCR). </li><li> Uzun süreli dondurulup saklanma (DMEM% 10 serum ve% 10 DMSO ile desteklenmiş) izole idrar hücreleri (bölüm 4) reprogram veya Orta Donma onları aşağı dondurma. </li></ol> Sendai Virüs Kullanılması 4. İdrar Hücre yeniden programlanması NOT: transfekte maddeler işlenirken doğru kullanımı ve PPE (kişisel koruyucu ekipman) kullanılması tavsiye edilir. Bir BSL2 Biyolojik Güvenlik Kabinesi steril koşullar altında aşağıdaki adımları uygulayın. ajan ve / veya transfekte hücreleri transfekte uygun atılması, çevre ve sağlık tehlikeleri riskini önlemek için tavsiye edilir. Aşağıda ayrıntılı olarak idrar hücre yeniden programlanması için, üreticinin besleyici bağımlı protokol değişiklikleri ile Sendai yeniden programlanması Kit kullanın. <ol><li> Sendai virüsü kullanarak yüksek verim yeniden programlama sağlamak için, kullanım hızlı olan idrar hücrelerinin 1-5 geçişlerily bölünmesi. Hücreler de çoğaltmak veya yaşlanınca yoksa onlar verimli reprogram olmayacak gibi, onları atın. </li><li> Tohum, 6 gözlü bir plakanın iki kuyu içinde oyuk başına 60,000 hücre. Mark Day -2 olarak bu. Hücre tohumlama yoğunluğunu ayarlayın (5 x 04-09 Ekim x 10 4 hücre kuyu başına) Günün 0% 80-90 ulaşmak için gerektiği gibi. </li><li> Gün 0 (hücreleri kaplama sonra 48 saat), dört OSKM faktörlerin her içeren Sendai yeniden programlama vektörleri (SeV) hazırlamak. Önceden ısıtılmış UPC ortamı, 1 ml için vektörlerin her ekleyin. Yeniden programlama idrar hücreleri için yeterli olan 1-1.5 MOI (5-7,5 x 10 5 UKÜ) kullanın. Orta aspire ve yavaş yavaş idrar hücrelerinin bir kuyuya 1 ml UPC + Sev ekleyin. Transdüksiyon negatif kontrol olarak ikinci kuyu kullanın. </li><li> Gün 1, taze UPC ortam ile UPC + SeV orta yerine. Bazı hücre ölümü nedeniyle viral sitotoksisite 24 saat sonra görülür. </li><li> Reprogrammed Clon verimliliğine bağlıE oluşumları ve kompakt morfolojisi, günde 6 ya da 7 kadar günlük orta değişen tutmak. </li><li> Önce kalıt aktarımlı hücrelerin (gün 5 veya 6), Mitomisin-C (3 st için 10 ug / ml), 0.1 5 x 10 4 hücre / cm2, yoğunluğu tedavi-MEF&#39;ler kaplama ile MEF besleyici plakalar hazırlamak ayrışması için bir günlük % jelatin 100 mm 2 kültür yemekleri kaplı. </li><li> Ertesi gün (gün 6 ya da 7),% 0.25 tripsin ile hücreleri ayırmak UPC orta ve plaka 5 x 10 4 hücreleri tekrar süspansiyon - 2 x 10 5 hücre / 100 mm2 MEF besleyici plaka. </li><li> Ertesi gün, embriyonik kök ortamına geçiş ve ortam her gün değiştirin. Dönüştürülmüş hücreler izlemek için bir mikroskop altında hücre dikkate alınmalıdır. NOT: Hücreler karakteristik arnavut morfolojisi ve sitoplazmik oranı yüksek çekirdeğe sahip (12-18 gün sonrası transdüksiyon) ile klonal agregatlar oluştururlar. </li><li> 2-3 hafta içinde transdüksiyon sonra, koloniler almak ve klon için yeni plakalar transferal genişleme. </li><li> 37 ° C&#39;de 1 saat süre ile TRA-1-81 antikoru ile inkübe edilmesi ile iPSC klonların seçilmesi için canlı hücre boyama gerçekleştirme C CO CO2 inkübatör içinde 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca özel bir floresan boya konjuge sekonder antikor ile karşı boyama ile 2 kuluçka takip etti. </li><li> Bir 26 G 1½ inç iğne kullanın küçük eşit büyüklükte parçalar halinde büyük TRA-1-81 pozitif iPSC klonlar (klon başına 4-6 adet) çapraz yumurtadan. </li><li> Çekme ve transfer Matrigel her çukuruna (10 ug / cm2) birden çok klonun 10-20 çapraz kesik parça embriyonik kök ortamı ile 24 yuvalı plaka -kaplı bir steril pipet ucu kullanın. NOT: Tek bir kuyuya ayrı ayrı kaplama bir tek klon gelen adet genişletmek veya pluripotensini korumak değil. </li><li> Programlanması klonlar Matrigel yüzeyine bağlı sonra iPSC ortamına hes 24-48 saat değiştirin. </li><li> Matrigel kaplı plakalar, manuel SCRA üzerinde bakım sırasındape-off tamamen yeniden programlanması ve pluripotent distrofik iPSC (MD-iPSC) klonları için zenginleştirmek için bir pipet-ucu kullanarak herhangi bir farklılaşmış hücre veya kontamine MEF besleyici hücreler. </li><li> Tek tek klonlar, ~ 100 um boyutlara ulaşmış sonra, 3 dakika boyunca 0.48 mM EDTA (etilendiamintetraasetik asit) çözeltisi ile ayrıştırma ve iPSC ortamda süspansiyon haline getirilmiş, MD-iPSCs küçük hücre toplulukları kaplama ile klonlar genişletme (5 uM Y27632 Rho Kinaz ile takviye önleyicisi ) taze matrigel (10 ug / cm 2) 12 plaka kaplama. Günlük iPSC orta değiştirin. </li><li> Her bir klonun tam yeniden programlama OSKM genler ve Pluripotency belirteçlerinin (Oct3 / 4 ve TRA-1-81) immünohistokimyasal boyama her iki gen ekspresyon analizi ile tespit edilebilir. Pluripotency potansiyeli titiz bir değerlendirme tamamen reprogrammed iPSC hatları üç germ içine ayırt edebilirsiniz onaylamak için istihdam edilmelidir. Bu embriyoit gövdesi (EB) oluşumu ve farklılaştırma denemesinde veya ter yoluyla gerçekleştirilebilmektedirAtoma formasyonu deneyi. </li></ol>

<ol><li>Guan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin-deficient+cardiomyocytes+derived+from+human+urine%3A+New+biologic+reagents+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery.</a> Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).</li>
<li>Dick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+Skipping+and+Gene+Transfer+Restore+Dystrophin+Expression+in+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells-Cardiomyocytes+Harboring+DMD+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Exon Skipping and Gene Transfer Restore Dystrophin Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells-Cardiomyocytes Harboring DMD Mutations.</a> Stem Cells Dev. 22 (20), 2714-2724 (2013).</li>
<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+urine+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples.</a> Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).</li>
<li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+the+new+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).</li>
<li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).</li>
<li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-Specific+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+as+a+Model+for+Familial+Dilated+Cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells as a Model for Familial Dilated Cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), 130ra147(2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+derived+cells+are+a+potential+source+for+urological+tissue+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction.</a> J Urol. 180 (5), 2226-2233 (2008).</li>
<li>Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technological+overview+of+iPS+induction+from+human+adult+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells.</a> Curr Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).</li>
<li>Malik, N., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+methods+for+human+iPSC+derivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A review of the methods for human iPSC derivation.</a> Methods Mol Biol. 997, 23-33 (2013).</li>
<li>Nakanishi, M., Otsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Sendai+virus+vectors+and+their+potential+applications+in+gene+therapy+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine.</a> Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).</li>
<li>González-Ramírez, R., Morales-Lázaro, S. L., Tapia-Ramírez, V., Mornet, D., Cisneros, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+and+nuclear+envelope+localization+of+dystrophin+Dp71+and+dystrophin-associated+proteins+%28DAPs%29+in+the+C2C12+muscle+cells%3A+DAPs+nuclear+localization+is+modulated+during+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nuclear and nuclear envelope localization of dystrophin Dp71 and dystrophin-associated proteins (DAPs) in the C2C12 muscle cells: DAPs nuclear localization is modulated during myogenesis.</a> J Cell Biochem. 105 (3), 735-745 (2008).</li>
<li>Villarreal-Silva, M., Centeno-Cruz, F., Suárez-Sánchez, R., Garrido, E., Cisneros, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+dystrophin+Dp71+impairs+PC12+cells+cycle%3A+localization+in+the+spindle+and+cytokinesis+structures+implies+a+role+for+Dp71+in+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Knockdown of dystrophin Dp71 impairs PC12 cells cycle: localization in the spindle and cytokinesis structures implies a role for Dp71 in cell division.</a> PloS One. 6 (8), e23504(2011).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

IPSCs kullanarak kardiyovasküler hastalıklar Modelleme genetik katkı 4-6 anlamak için ortak bir yaklaşım haline gelmektedir. Hastaların hücre örnekleri elde bazıları beklenmedik zorluklar, özellikle küçük çocuklar, böyle bir idrar toplama gibi bir non-invaziv bir yaklaşım seçeneği sunarak önlenebilir. Bu genç hasta popülasyonunda, bu yeniden programlama için yeterli idrar hücreleri elde etmek için yeterli idrar hacmini toplamak genellikle zordur. Sıvıları idrar toplama öncesinde 30 dakika içmek için genç hast...

Kardiyomiyopati Duchenne ve Becker kas distrofisi (MD) olan hastalarda ölüm ikinci önde gelen nedenidir. X&#39;e bağlı distrofin genindeki mutasyonlar 1 ortaya karşın: 3.500 erkek doğum, çok az ilerici kalp kası hasarına yol açan moleküler ve hücresel olaylar hakkında bilinmektedir. Müsküler distrofi hastalardan elde edilen insan uyarılmış pluripotent kök hücreleri altta yatan hastalık mekanizmaları incelemek ve ilaç 1,2 tarama için kullanılacak yeni bir araç olarak ortaya çıkmıştır. cilt biyopsisi veya kan örneklerinin beklenen rahatsızlık çalışması katılım için onay vermek, genç hastalar ve / veya onların veliler caydırmak olabilir. İdrar numuneleri yeniden programlama yöntemleri iyileştirilebilir olan somatik hücre non-invaziv bir kaynağıdır. Son zamanlarda, kas distrofisinin, hastalardan toplanan idrar hücreler kültürlendi olabileceğini göstermiştir ve verimli bir şekilde Yamanaka faktörleri ile retroviral transdüksiyonu ile iPSCs (içine yeniden programlanabilir adresOct3 / 4, Sox2 Klf4 ve c-Myc; OSKM) 1. retroviral gen aktarımı dezavantajı konak kromozom içine yeniden programlanması genlerin rastgele bütünleşmesidir. Bu sınırlamayı aşmak için, biz idrar hücre yeniden programlama olmayan entegre Sendai virüsü kullandık. Bu protokol daha sonra çalışma için kardiyomiyositlerde ya da diğer hücre tiplerine ayırt edilebilir kas distrofisi hastalardan elde edilen idrar hücrelerinin Sendai virüsü yeniden programlama göstermektedir. Bu protokol, aynı zamanda diğer hasta belirli hastalıklar için adapte edilebilir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>4 Oz. Kapaklı Numune Kabı</td><td>İdrar Örneği Toplama için</td><td>STL Medical Supply</td><td>M9AMSAS340</td></tr><tr><td>15 ml BD-Falcon Tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml BD-Falcon Tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Yuvarlak Cam Lameller</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-81</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune-iPS Sendai Yeniden Programlama Kiti</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A1378-001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Glutaminsiz Pen-Strep&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140-122</td><td>37 °C'de Sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>B-27 İnsülinçli Takviye (50x)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17504-044</td><td>37 °C sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>B-27 İnsülinsiz Takviye (50x)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>0050129SA</td><td>37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11330-032</td><td>37 °C sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>Versene, 1: 5.000</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15040066</td><td>37 ° C'de sıcak; C kullanmadan önce su banyosu</td></tr><tr><td>bFGF (10 & mikro; g)</td> <td>Yaşam Teknolojileri</td><td>13256-029</td><td>37 & derece'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>Hücre Sayacı Kartuşları</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Nakavt Serumu (500&nbsp; ml Şişe)</td> <td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10828-028</td><td>37 °C Sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>Geri Kazanım Hücre Kültürü Dondurma Orta Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>Keratinosit-SFM (1x), Sıvı Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td>17005-042</td><td>37 °C sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>DMEM, Yüksek Glikoz, Glutamax</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10566-016</td><td>37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>Ham's F-12 Besin Karışımı&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11765-054</td><td>37 °C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>EGF Rekombinant İnsan Proteini, Sıvı Form</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>PHG0311L</td><td>37 °C Ilık; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>İnsülin, İnsan Rekombinant, Çinko Soln</td><td>Life Technologies</td><td>12585-014</td><td>37 °C sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>TeSR-E8</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>5940 37</td><td>° C'de Sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>ROCK İnhibitörü (Y-27632)</td> <td>Selleck</td><td>S1049</td><td>37 ° C'de Sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>hESC Nitelikli Matris, LVED Ücretsiz</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Sentez Kiti</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8890</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2x)</td><td>Termo-Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>FBS Nitelikli</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>37 °C &°C'de Sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>Adenin Bioreagent</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2786-5G</td><td>37 ° C'de sıcak; C kullanmadan önce su banyosu</td></tr><tr><td> Vibrio cholerae</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8052-.5MG'den</td> Kolera Toksini <td>37 derecede sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>Hidrokortizon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0888-1G</td><td>37 ° C'de ısıtın; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr>İnsan <td>Sigma Aldrich</td><td>T0665-50MG'den</td><td>Holo-transferrin</td><td>37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>3,3 ',5-Triiyodo-L-tironin sodyum tuzu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6397-100MG</td><td>37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>SC-3598</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount Susu montaj ortamı</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>%16 Paraformaldehit</td><td>Alfa-Aesar</td><td>43368</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Antikorlar</td></tr><tr><td>Mouse anti CD44 - FITC ile etiketlenmiş&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>560977</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti CD146 - PE ile etiketlenmiş</td><td>BD Biosciences</td><td>561013</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti CD73 - PE ile etiketlenmiş</td><td>BD Biosciences</td><td>561014</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-&alfa;-düz kas aktini</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2547</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-Vimentin</td><td>Abcam</td><td>ab8978-100</td><td></td></tr><tr><td>Fare Anti - TRA-1-81</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>411100</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti Ekim 3/4</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>Fare Anti Distrofin</td><td>Leica Biosystems</td><td>NCL-DYSB</td><td></td></tr></tbody></table>

musküler distrofi hastalarda gelen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin oluşturulması: İdrar türetilmiş hücre verimli entegrasyonu-ücretsiz yeniden programlanması

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Distrofik kardiyomiyopati müsküler distrofi bir tam olarak anlaşılamamıştır sonucudur. Kas distrofisi olan hastalarda gelen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) üretilmesi, in vitro bir hastalık modeli sistemleri için çok değerli bir hücre kaynağıdır ve ilaç tarama çalışmaları için kullanılabilir. Hasta türetilmiş idrar hücreleri distrofik kardiyomiyopati 1 modellemek için uyarılmış pluripotent kök hücrelerin içine başarılı bir yeniden programlama kullanılmıştır. Vektör sistemlerinin entegre güvenlik endişelerini hitaben, biz Yamanaka transdüksiyon müsküler distrofi hastalardan alınan idrar hücrelerine faktörler olmayan bir entegre Sendai virüsü vektörü kullanılarak bir protokol mevcut. Bu protokol, tamamen 2-3 hafta içinde klonlar yeniden programlanan üretir. pluripotent hücreler geçit-13 vektör-ücretsizdir. Bu distrofik iPSCs kardiyomiyositlerde ayrılmakta ve hastalık mekanizmalarını tam ve ilaç taraması için çalışma halinde kullanılabilir.

(Sırasıyla, 97,37%, 97.09%, ve% 97.3; Şekil 1A ve 1B) insan idrarından izole en projenitör hücreleri, CD44, CD73 ve CD146 gibi epitelyal progenitör ve perisit işaretleri için pozitiftir. Bu hücreler, aynı zamanda, alfa-düz kas aktin ve vimentin (Şekil 1B) gibi diğer mezenşimal ifade edilen işaretçileri değiştirmemiştir. RT-PCR analizi sitokeratin-7 zayıf sentezleme olduğu kültürlerin hücre oluşan karışık bir popülasyonda kanıt sağlar (CK-7) ve Uroplakin (UP) Ia--IIIa, e...

Bu protokol, kas distrofisi hastalarından idrardan türetilmiş hücrelerin izolasyonu için ayrıntılı prosedürler gerektirir; Sendai virüsü transdüksiyonu yoluyla verimli ve hızlı yeniden programlamaları.

Musküler Distrofi Hastalarda gelen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin oluşturulması: İdrar Türetilmiş Hücre Verimli Entegrasyonu-ücretsiz yeniden programlanması

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, idrardan türetilmiş hücre kültürlerinden ve entegrasyon gerektirmeyen bir yeniden programlama yönteminden başlayarak kas distrofisi hastalarından indüklenmiş pluripotent kök hücreleri veya IPSC'yi verimli bir şekilde üretmektir. Bu, önce kas distrofisi hastalarından idrar örnekleri toplanarak elde edilir. İkinci adım olarak, idrar hücreleri izole edilir ve idrardan türetilen hücre kültürlerine genişletilir.Daha sonra, idrardan türetilen hücreler Yamanaka faktörleri içeren Sendai virüsü ile dönüştürülür ve 12 gün sonra tipik pluripotent benzeri koloniler ortaya çıkar. Nihayetinde, 13. pasaja göre, pluripotent kök hücrelerin transgen serbest durumu, R-T-P-C-R analizi ile doğrulanabilir. Bu tekniğin, lentiviral vektörler kullanılarak izole edilmiş deri fibroblastlarının yeniden programlanması gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bu teknikle somatik hücrelerin hastalardan non-invaziv olarak elde edilebilmesi ve sıfır ayak izi viral yeniden programlama yöntemi kullanılarak IPC'leri verimli bir şekilde oluşturmak için kullanılabilmesidir.Bu yöntem, kas distrofisi alanında, bu koşulların insan uygulaması için güvenlik endişeleri olmadan in vitro olarak nasıl modelleneceği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Prosedürleri gösteren, doktora sonrası bir araştırmacı olan Mohammad Zishan Al, bir teknisyen olan Courtney Guesting ve Melanie Ryder yüksek lisans öğrencisi, üçü de laboratuvarımdan İdrar örneği toplamak için, hastaya yaklaşık 30 ila 40 mililitre idrar toplanabilmesini sağlamak için toplamadan 30 dakika önce sıvı içmesini tavsiye ederek başlayın. Hasta hazır olduğunda, hastaya aşağıdaki öğeleri içeren bir idrar toplama kiti, steril veya temiz akılda kalıcı ve örnek nemli antibakteriyel tuvaletlerin nasıl elde edileceğine dair yazılı talimatlar ve 100 mililitrelik steril örnek toplama kabı verin.Numune toplandığında, toplama kabını hemen buzun üzerine yerleştirin ve numuneyi bir soğutucu içinde laboratuvara aktarın. Daha sonra idrar örneğini steril 50 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarmak için steril pipetler kullanın ve tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 kez G'de döndürün. Daha sonra, bir BSL'de iki biyolojik güvenlik kabini, peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek, süpernatantın sonuncusu hariç hepsini mililitre aspire edin.Daha sonra hücreleri yedi mililitre yıkama tamponunda yıkayın ve hücreleri tekrar döndürün. Bu sefer, süpernatantın sonuncusu hariç hepsini aspire ediyor: yaklaşık 0.2 ila 0.5 mililitre. Şimdi peleti iki ila üç mililitre idrar progenitör hücresi veya UPC ortamında yeniden kullanın ve süspansiyonu 72 saat sonra kaplanmamış 24 oyuklu bir plakanın dört ila altı oyuğuna aktarın, kültürü oyuk başına 0,5 mililitre taze UPC ortamı ile destekleyin.Kültürü dört ila altı günlük inkübasyon boyunca izleyin. Sırasıyla tip bir veya tip iki renal epitel hücrelerini temsil eden yuvarlak veya uzun hücrelerden oluşan küçük iki ila dört hücre kolonileri ortaya çıkmaya başlamalıdır. Ortamı her iki ila üç günde bir değiştirmeye devam edin.Koloniler, kültürün yaklaşık dokuz ila 15 gününde hızlı bir genişleme aşamasından geçeceğinden, hücreler bu noktada% 80 ila 90 oranında birleşmiş olmalı, daha fazla genişleme için hücreleri 24 oyuklu bir plakanın iki ila dört oyuğuna bölünmelidir. Bu kültürü hücre geçişi bir olarak işaretleyen idrar hücreleri daha sonra akış sitometrik analizi, immünohistokimyasal boyama veya transdüksiyon tohumundan önceki günlere yüksek verimli yeniden programlama sağlamak için ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu yoluyla soya özgü belirteçler için karakterize edilebilir, kuyu başına 60.000 hücre. Sıfırıncı günde bir ila beş kültürden altı kuyulu bir plakanın iki kuyusuna.Dört OSKM faktörünün her birini bir mililitre ön ısıtma UPC ortamına yeniden programlama için uygun bir MLI'ye ekleyerek, süspansiyon ortamını aspire ederek ve virüs süspansiyonunu önümüzdeki altı gün boyunca idrar hücrelerinin bir kuyusuna yavaşça ekleyerek Sendai yeniden programlama vektörünü hazırlayın. Süpernatanı günlük olarak beşinci günde taze UPC ortamı ile değiştirin, altıncı günde jelatin kaplı 100 milimetre kare kültür kaplarına plaka mitomisin tohumu ile muamele edilmiş MES'i yerleştirin. İdrar hücrelerini tripsin ile ayırın, bunları UPC ortamında yeniden süspanse edin ve metamfetamin besleyici plaka başına dördüncü hücrenin 10'u ile beşinci hücrelerin 10'u arasında beş kez plakalayın.Ertesi gün, UPC ortamını insan embriyonik aşaması veya HES ortamı ile değiştirin ve dönüştürülmüş hücreleri yaklaşık 12 ila 18 gün boyunca gözlemlemek için hücreleri mikroskop altında izleyin. Transdüksiyon sonrası, hücreler karakteristik bir parke taşı morfolojisine ve daha yüksek bir çekirdek-sitoplazmik orana sahip klonal agregatlar oluşturmalıdır. Yeniden programlanmış IPSC klonlarını tanımlamak için, bir TRA 180 1 antikoru için canlı hücre boyama yapın.Ardından, TRA 180 1 pozitif klonal agregaları klon başına dört ila altı küçük eşit boyutlu parçaya çapraz taramak için 26 gauge yarım inçlik bir iğne kullanın. Daha sonra, birden fazla klondan 10 ila 20 çapraz taranmış parçayı almak ve her bir oyuklu HESC'li 24 kuyulu matrigel kaplı plakaya aktarmak için steril bir pipet ucu kullanın. Orta, yeniden programlanan klonlar matrigel yüzeyine kaplandıktan 24 ila 48 saat sonra.Ortamı IPSC ortamıyla değiştirin. Tamamen yeniden programlanmış ve pluripotent distrofik IPSC klonlarının saflaştırılmasına yardımcı olmak için farklılaşmış hücreleri veya kontamine metamfetamin besleyici hücreleri manuel olarak kazımak için bir pipet ucu kullanın. Klonlar yaklaşık 100 mikrometre boyuta ulaştıktan sonra, hücreleri üç dakika boyunca EDTA ile ayırın ve daha sonra RO kinaz inhibitörü ile takviye edilmiş IPSC ortamında süspanse edilmiş yeniden programlanmış distrofik IPSC'nin küçük hücre agregatlarını taze bir matrigel kaplı 12 folyo plaka üzerine plakalayın.Son olarak, hem gen ekspresyon analizi hem de immünohistokimyasal boyama ile her klonun pluripotentliğini doğrulayın. Pluripotent belirteçler için, insan idrarından izole edilen hücrelerin çoğu, CD 44, CD 73 ve CD 1 46 gibi progenitör ve kök hücre belirteçleri için pozitiftir. Hücreler ayrıca alfa, düz kas, aktin ve menton gibi mezenkimal belirteçler sergiler.İzole edilen hücrelerin R-T-P-C-R, kültürlerde karışık bir hücre popülasyonunun kanıtını sağlar. Bunda, euro epitel hücrelerinin sitokeratin, yedi ve UIN, bir, A ve üç a'nın zayıf ekspresyonu vardır. İdrar hücreleri, sıfırıncı günde uzamış tip iki hücreden, yeniden programlamanın dördüncü gününde bir parke taşı desenine dönüşür.12. günde, tipik pluripotent klonlar gözlenir ve besleyicisiz koşullar altında pluripotent morfolojilerini koruyabilirler. TRA 180 1 için canlı hücre boyama, yeniden programlanmış klonları tanımlamak için kullanılabilir. Vektör ve transgen, serbest pluripotent klonların oluşumunu doğrulamak için, R-T-P-C-R, Sendai virüsü genomuna ve eksojen OSKM faktörlerinin her birine karşı primerler kullanılarak gerçekleştirilebilir.Ekzojen gen ekspresyonu artık pasaj 13 ile tespit edilememektedir, ancak endojen faktörlerin yukarı regülasyonu gözlemlenebilir. İmmünofloresan boyama, IPC'ler üzerindeki pluripotent belirteçlerin ekspresyonunu doğrular, ancak idrar hücreleri üzerinde değil. Distrofin proteininin ve geninin ekspresyonu daha sonra daha fazla immünofloresan boyama, western blotlama ve R-T-P-C-R ile doğrulanabilir, vahşi tip kontrol ve distrofik hücre hatlarından elde edilen bu temsili görüntülerle gösterildiği gibi.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik ucs'nin ücretsiz olarak yeniden programlanmasını sağlamak için kullanılabilir. Bu prosedürü takiben birkaç hafta içinde, kas distrofisinin arkasındaki mekanizmaları ilerletmek için IPC'leri kardiyomiyositlere veya iskelet miyositlerine ayırabiliriz.

generation-induced-pluripotent-stem-cells-from-muscular-dystrophy

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Biz retroviral Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ve c-myc (OSKM) kodlayan vektörler ve canlı boyama ile doğru yeniden programlanması hiPSC belirlenmesi kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC) Tra-içine insan somatik hücre verimli yeniden programlama için bir protokol sunmak 1-81 antikor.

İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre seçme ve ayırma Kolonileri Yetişkin Fibroblastlar gelen reprogrammed

İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi miyojenik progenitörler, kas distrofilerini tedavi etmek için hücre tedavisi stratejileri için adaylar vaat ediyor. Bu protokol, akut ve kronik kas yenilenmesinin fare modellerinde iPSC türevi mezoangioblastların (bir tür kas progenitörleri) engraftasyonunu ve farklılaşmasını değerlendirmek için gereken transplantasyon ve fonksiyonel ölçümleri açıklar.

Kas Yenilenmesinin Fare Modellerinde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre türevi Mezoangioblast benzeri Miyojenik Progenitörlerin Nakli

Burada, biz insana biyolojik özelliklerini özetlemek permisif kültür koşulları altında kasılma myofibers (myospheres) üç boyutlu kümeler oluştururlar iskelet kası atalarıdır, homojen bir nüfusa üreten doğru insan embriyonik kök hücreleri (hESC) epigenetik yeniden programlama dayalı bir protokol açıklar iskelet kasları.

Epigenetik yeniden programlanması ile hESC itibaren Myospheres Üretimi

Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi otolog nakli türetilmesi için ilginç umutları sağlar. Ancak, pluripotent devlet ve zahmetli yeniden farklılaşma yoluyla ilerleme hala klinik çeviri engellemektedir. Burada erişkin insan fibroblast türetme ve uyarılmış nöral progenitör hücrelerin içine doğrudan dönüşüm ve nöral soy içine sonradan farklılaşmayı açıklar.

Yetişkin İnsan Fibroblastları türetilmesi ve Genişletilebilir Sinir Progenitör Hücreler içine Doğrudan Dönüşüm

Uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs), klinik uygulamalar ve temel araştırma için hastaya özgü dokuların bir kaynağı temsil eder. Burada, non-entegre epizomal plasmidleri kullanılarak viral içermeyen iPSCs içine donmuş buffy kat elde edilen insan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMNCs) yeniden programlamak için detaylı bir protokol mevcut.

Bütünleşmeyen episomal plasmidler kullanılarak dondurulmuş Buffy tüylerdeki uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Bu protokol, insan yetişkin periferik kan hücrelerinden entegrasyon gerektirmeyen iPSC'lerin verimli bir şekilde üretilmesi için ayrıntılı bir yöntemi açıklar. Yeniden programlama faktörlerini ifade etmek için dört oriP/EBNA bazlı epizomal vektörün kullanılmasıyla, KLF4, MYC, BCL-XL veya OCT4 ve SOX2, 1 mL periferik kandan binlerce iPSC kolonisi elde edilebilir.

Epizomal vektörlerin kullanılması insan periferik kan mononükleer hücrelerinden entegrasyon içermeyen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Burada, Dmdmdx fare kaynaklı deri fibroblastlarından iPSC'de distrofin ekspresyonunu geri yüklemek ve Tet-on MyoD aktivasyon sistemini kullanarak iPSC'leri doğrudan miyojenik progenitor hücrelerine (MPC) ayırmak için Cas9 tabanlı ekson23 silme protokolü salıyoruz.

iPSC Kaynaklı Kas Atalarında Distrofin Ekspresyonunun Geri Kazanilmesinde CRISPR/Cas9 Teknolojisi

Protokol, çevresel kan mononükleer hücrelerin yeniden programlanması ile sinirsel kök hücrelerini Sendai virüs enfeksiyonu, dopaminerjik nöronlar içine inscs farklılaşma, tek taraflı-lesioned içine da öncüleri transplantasyon teşvik sunar Parkinson hastalığı fare modelleri ve PD tedavisi için iNSC-türetilen DA öncüleri güvenlik ve etkinliğini değerlendirilmesi.

Periferik mononükleer hücrelerden Indüklenen nöral kök hücrelerin üretimi ve transplantasyon çalışmaları için Dopaminergic neuron precursors doğru farklılaşma

Bu makalede, distropin mRNA ve protein düzeylerinin ekson atlama dan sonra restorasyon değerlendirmek için MYOD1-dönüştürülmüş idrar türetilmiş hücreleri kullanarak Duchenne musküler distrofi kasının verimli modelleme için ayrıntılı bir protokol açıklanır.

İnsan İdrar Türemiş Hücrelerden Elde Edilen Doğrudan Yeniden Programlanmış Miyotüplerde Ekson Atlama

Bu protokol, cilt fibroblastlarının miyoblastlara dönüşümünü ve farklılaşmalarını miyotüplere açıklar. Hücre hatları nöromüsküler bozukluğu olan hastalardan türetilmiştir ve patolojik mekanizmaları araştırmak ve terapötik stratejileri test etmek için kullanılabilir.

Nöromüsküler Bozukluklar için Tedavileri Araştırmak için İnsan Fibroblastlarının Myoblastlara Doğrudan Yeniden Programlanması

Mevcut protokol, insan ve insan olmayan primat idrar türevi hücreleri indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC'ler) izole etmek, genişletmek ve yeniden programlamak için bir yöntemin yanı sıra yeni üretilen iPSC'lerin besleyicisiz bakımı için talimatları açıklamaktadır.

İdrardan Elde Edilen Primat Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Üretimi ve Bakımı

Öğrenin, müsküler distrofi hastalarından idrar türetilmiş hücreleri kullanarak entegrasyon-ücretsiz iPSC üretme yöntemini. Sendai virüsü ile hızlı yeniden programlama sağlar.

Musküler Distrofi Hastalarda gelen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin oluşturulması: İdrar Türetilmiş Hücre Verimli Entegrasyonu-ücretsiz yeniden programlanması (Video) | JoVE Journal

Musküler Distrofi Hastalarda gelen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin oluşturulması: İdrar Türetilmiş Hücre Verimli Entegrasyonu-ücretsiz yeniden programlanması

Daha fazla video keşfet