Musküler Distrofi Hastalarda gelen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin oluşturulması: İdrar Türetilmiş Hücre Verimli Entegrasyonu-ücretsiz yeniden programlanması

Aşağıdaki deneyin genel amacı, idrardan türetilmiş hücre kültürlerinden ve entegrasyon gerektirmeyen bir yeniden programlama yönteminden başlayarak kas distrofisi hastalarından indüklenmiş pluripotent kök hücreleri veya IPSC'yi verimli bir şekilde üretmektir. Bu, önce kas distrofisi hastalarından idrar örnekleri toplanarak elde edilir. İkinci adım olarak, idrar hücreleri izole edilir ve idrardan türetilen hücre kültürlerine genişletilir.

Daha sonra, idrardan türetilen hücreler Yamanaka faktörleri içeren Sendai virüsü ile dönüştürülür ve 12 gün sonra tipik pluripotent benzeri koloniler ortaya çıkar. Nihayetinde, 13. pasaja göre, pluripotent kök hücrelerin transgen serbest durumu, R-T-P-C-R analizi ile doğrulanabilir. Bu tekniğin, lentiviral vektörler kullanılarak izole edilmiş deri fibroblastlarının yeniden programlanması gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bu teknikle somatik hücrelerin hastalardan non-invaziv olarak elde edilebilmesi ve sıfır ayak izi viral yeniden programlama yöntemi kullanılarak IPC'leri verimli bir şekilde oluşturmak için kullanılabilmesidir.

Bu yöntem, kas distrofisi alanında, bu koşulların insan uygulaması için güvenlik endişeleri olmadan in vitro olarak nasıl modelleneceği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Prosedürleri gösteren, doktora sonrası bir araştırmacı olan Mohammad Zishan Al, bir teknisyen olan Courtney Guesting ve Melanie Ryder yüksek lisans öğrencisi, üçü de laboratuvarımdan İdrar örneği toplamak için, hastaya yaklaşık 30 ila 40 mililitre idrar toplanabilmesini sağlamak için toplamadan 30 dakika önce sıvı içmesini tavsiye ederek başlayın. Hasta hazır olduğunda, hastaya aşağıdaki öğeleri içeren bir idrar toplama kiti, steril veya temiz akılda kalıcı ve örnek nemli antibakteriyel tuvaletlerin nasıl elde edileceğine dair yazılı talimatlar ve 100 mililitrelik steril örnek toplama kabı verin.

Numune toplandığında, toplama kabını hemen buzun üzerine yerleştirin ve numuneyi bir soğutucu içinde laboratuvara aktarın. Daha sonra idrar örneğini steril 50 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarmak için steril pipetler kullanın ve tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 kez G'de döndürün. Daha sonra, bir BSL'de iki biyolojik güvenlik kabini, peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek, süpernatantın sonuncusu hariç hepsini mililitre aspire edin.

Daha sonra hücreleri yedi mililitre yıkama tamponunda yıkayın ve hücreleri tekrar döndürün. Bu sefer, süpernatantın sonuncusu hariç hepsini aspire ediyor: yaklaşık 0.2 ila 0.5 mililitre. Şimdi peleti iki ila üç mililitre idrar progenitör hücresi veya UPC ortamında yeniden kullanın ve süspansiyonu 72 saat sonra kaplanmamış 24 oyuklu bir plakanın dört ila altı oyuğuna aktarın, kültürü oyuk başına 0,5 mililitre taze UPC ortamı ile destekleyin.

Kültürü dört ila altı günlük inkübasyon boyunca izleyin. Sırasıyla tip bir veya tip iki renal epitel hücrelerini temsil eden yuvarlak veya uzun hücrelerden oluşan küçük iki ila dört hücre kolonileri ortaya çıkmaya başlamalıdır. Ortamı her iki ila üç günde bir değiştirmeye devam edin.

Koloniler, kültürün yaklaşık dokuz ila 15 gününde hızlı bir genişleme aşamasından geçeceğinden, hücreler bu noktada% 80 ila 90 oranında birleşmiş olmalı, daha fazla genişleme için hücreleri 24 oyuklu bir plakanın iki ila dört oyuğuna bölünmelidir. Bu kültürü hücre geçişi bir olarak işaretleyen idrar hücreleri daha sonra akış sitometrik analizi, immünohistokimyasal boyama veya transdüksiyon tohumundan önceki günlere yüksek verimli yeniden programlama sağlamak için ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu yoluyla soya özgü belirteçler için karakterize edilebilir, kuyu başına 60.000 hücre. Sıfırıncı günde bir ila beş kültürden altı kuyulu bir plakanın iki kuyusuna.

Dört OSKM faktörünün her birini bir mililitre ön ısıtma UPC ortamına yeniden programlama için uygun bir MLI'ye ekleyerek, süspansiyon ortamını aspire ederek ve virüs süspansiyonunu önümüzdeki altı gün boyunca idrar hücrelerinin bir kuyusuna yavaşça ekleyerek Sendai yeniden programlama vektörünü hazırlayın. Süpernatanı günlük olarak beşinci günde taze UPC ortamı ile değiştirin, altıncı günde jelatin kaplı 100 milimetre kare kültür kaplarına plaka mitomisin tohumu ile muamele edilmiş MES'i yerleştirin. İdrar hücrelerini tripsin ile ayırın, bunları UPC ortamında yeniden süspanse edin ve metamfetamin besleyici plaka başına dördüncü hücrenin 10'u ile beşinci hücrelerin 10'u arasında beş kez plakalayın.

Ertesi gün, UPC ortamını insan embriyonik aşaması veya HES ortamı ile değiştirin ve dönüştürülmüş hücreleri yaklaşık 12 ila 18 gün boyunca gözlemlemek için hücreleri mikroskop altında izleyin. Transdüksiyon sonrası, hücreler karakteristik bir parke taşı morfolojisine ve daha yüksek bir çekirdek-sitoplazmik orana sahip klonal agregatlar oluşturmalıdır. Yeniden programlanmış IPSC klonlarını tanımlamak için, bir TRA 180 1 antikoru için canlı hücre boyama yapın.

Ardından, TRA 180 1 pozitif klonal agregaları klon başına dört ila altı küçük eşit boyutlu parçaya çapraz taramak için 26 gauge yarım inçlik bir iğne kullanın. Daha sonra, birden fazla klondan 10 ila 20 çapraz taranmış parçayı almak ve her bir oyuklu HESC'li 24 kuyulu matrigel kaplı plakaya aktarmak için steril bir pipet ucu kullanın. Orta, yeniden programlanan klonlar matrigel yüzeyine kaplandıktan 24 ila 48 saat sonra.

Ortamı IPSC ortamıyla değiştirin. Tamamen yeniden programlanmış ve pluripotent distrofik IPSC klonlarının saflaştırılmasına yardımcı olmak için farklılaşmış hücreleri veya kontamine metamfetamin besleyici hücreleri manuel olarak kazımak için bir pipet ucu kullanın. Klonlar yaklaşık 100 mikrometre boyuta ulaştıktan sonra, hücreleri üç dakika boyunca EDTA ile ayırın ve daha sonra RO kinaz inhibitörü ile takviye edilmiş IPSC ortamında süspanse edilmiş yeniden programlanmış distrofik IPSC'nin küçük hücre agregatlarını taze bir matrigel kaplı 12 folyo plaka üzerine plakalayın.

Son olarak, hem gen ekspresyon analizi hem de immünohistokimyasal boyama ile her klonun pluripotentliğini doğrulayın. Pluripotent belirteçler için, insan idrarından izole edilen hücrelerin çoğu, CD 44, CD 73 ve CD 1 46 gibi progenitör ve kök hücre belirteçleri için pozitiftir. Hücreler ayrıca alfa, düz kas, aktin ve menton gibi mezenkimal belirteçler sergiler.

İzole edilen hücrelerin R-T-P-C-R, kültürlerde karışık bir hücre popülasyonunun kanıtını sağlar. Bunda, euro epitel hücrelerinin sitokeratin, yedi ve UIN, bir, A ve üç a'nın zayıf ekspresyonu vardır. İdrar hücreleri, sıfırıncı günde uzamış tip iki hücreden, yeniden programlamanın dördüncü gününde bir parke taşı desenine dönüşür.

12. günde, tipik pluripotent klonlar gözlenir ve besleyicisiz koşullar altında pluripotent morfolojilerini koruyabilirler. TRA 180 1 için canlı hücre boyama, yeniden programlanmış klonları tanımlamak için kullanılabilir. Vektör ve transgen, serbest pluripotent klonların oluşumunu doğrulamak için, R-T-P-C-R, Sendai virüsü genomuna ve eksojen OSKM faktörlerinin her birine karşı primerler kullanılarak gerçekleştirilebilir.

Ekzojen gen ekspresyonu artık pasaj 13 ile tespit edilememektedir, ancak endojen faktörlerin yukarı regülasyonu gözlemlenebilir. İmmünofloresan boyama, IPC'ler üzerindeki pluripotent belirteçlerin ekspresyonunu doğrular, ancak idrar hücreleri üzerinde değil. Distrofin proteininin ve geninin ekspresyonu daha sonra daha fazla immünofloresan boyama, western blotlama ve R-T-P-C-R ile doğrulanabilir, vahşi tip kontrol ve distrofik hücre hatlarından elde edilen bu temsili görüntülerle gösterildiği gibi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik ucs'nin ücretsiz olarak yeniden programlanmasını sağlamak için kullanılabilir. Bu prosedürü takiben birkaç hafta içinde, kas distrofisinin arkasındaki mekanizmaları ilerletmek için IPC'leri kardiyomiyositlere veya iskelet miyositlerine ayırabiliriz.