Mikrodisseksiyon tarafından Gelişmekte Serebellumunda farklı olarak hücre popülasyonlarının İzolasyonu
21 Eylül 2014
Nestin-salgılayan progenitorlar gelişen beyincikte nöronal progenitörlerinin yeni tespit edilen bir gruptur. Floresan-aktive edilmiş hücre sıralama ile kombinasyon halinde burada sunulan mikrodiseksiyon tekniği kullanarak, bu hücre popülasyonu, diğer beyincik bölgelerinin herhangi bir bulaşma ile saflaştırılabilir ve daha ileri araştırmalar için kültürlenebilir.
Bu prosedürün genel amacı, gelişmekte olan beyincikten spesifik hücre popülasyonlarını izole etmektir. Bu, floresan proteinleri taşıyan yenidoğan farelerden ilk olarak serebella toplanmasıyla gerçekleştirilir. İşlemin ikinci adımı, bir vibrato kullanarak canlı doku kesitleri elde etmektir.
Üçüncü adım, serebellumun dış germinal tabakasını bir floresan diseksiyon mikroskobu altında mikrodiseksiyon yapmaktır. Son adımlar, dokuyu tek bir hücre süspansiyonuna ayırmak ve floresanla aktive edilmiş hücre sıralaması ile hücreleri toplamaktır. Sonuç olarak, sonuçlar belirli hücre popülasyonlarının beyincikten izole edilebileceğini gösterebilir.
Bu tekniğin lazer yakalama, mikro diseksiyon gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, hücrelerin canlı olması ve kültürlenebilmesidir. Daha fazla deney için Bu prosedür için, cerrahi aletleri bir otoklav kullanarak sterilize edin. 37 santigrat derece su banyosunda kullanıma hazır taze veya yeniden ısıtılmış %3 erime noktalı aros alın.
Papaya bazlı hücre ayrışması için gerekli çözümleri oluşturun. Taze NBB 27 kültür ortamı hazırlayın. Ardından süzün, sterilize edin ve bir inkübatörde saklayın.
Faks arabelleğini hazırlayın ve poli de lisin kapak fişlerini hazırlayın. İlk kat otoklav, mililitre steril su başına 100 mikrogram poli de lisin ile kayar. Daha sonra kapak fişlerini 37 santigrat derecede iki saat veya gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
Daha sonra, kapak fişlerini kullanmadan önce lamel su ile ve ardından NBB 27 ortamı ile yıkayın. Onları tamamen kurulayın. Bu, başlamadan önce en az bir saat sürecektir.
Önce diseksiyon alanını hazırlayın. % 70 etanol ile silerek temizleyin. Ardından emici bir ped ile örtün.
İkinci olarak, aletleri sterilizasyon poşetinden çıkarın ve kullanım için konumlandırın. Üçüncüsü, %1 kalem şeritli buz gibi steril DPBS içeren bir tabak yükleyin ve buzun üzerine koyun. Floresan belirteçleri ifade eden bir P dört yavrunun beynini inceleyin.
Sonra hazırlanan DPBS tabağına aktarın. Beyinciğini beynin geri kalanından dikkatlice ayırmak için forseps kullanın. Bu serebella, matematik bir, GFP belirteçlerini ifade eder ve EGL'nin GFP'yi eksprese ettiği ve moleküler tabakanın CFP için pozitif olduğu CFP'de yuvalanır.
Ardından, iki santimetre küp küp gömme kalıbını agro solüsyonla doldurun. 37 santigrat dereceden daha sıcak olmadığından emin olun. Delikli bir kaşıkla bir beyincik alın ve hafifçe hafifçe vurarak kurulayın.
Sonra forseps kullanarak kalıba yerleştirin. Beyincil'i dikey yönlere getirmek için bir iğne kullanın. Bir kez yaklaşık dört kalıba yüklenir.
Kalıbı buzun üzerine yerleştirin, böylece bir tıraş bıçağı kullanarak hızla katılaşacaktır. Kesit süresini azaltmak için bloğu kırpın. Daha sonra bloğu, beyincik dikey olacak şekilde yönlendirilmiş plakaya yapıştırın.
Doldurma tepsisine %1 pent kayışlı buz gibi DPBS yükleyin ve soğuk kalması için tepsinin altına buz koyun. Şimdi blokları bir vibratörle bölümlere ayırın. 600 mikronluk kesitleri kesin ve toplayın.
Delikli bir kaşık kullanarak buz tepsisinden çıkarın ve buz üzerinde A-D-P-B-S dolgulu kaba aktarın. Floresan diseksiyon mikroskobu altında. Dilimleri olabildiğince çabuk inceleyin.
EGL'yi serebellar bölümün geri kalanından dikkatlice ayırın. CFP pozitif moleküler tabaka ile GFP pozitif EGL arasında ayrım yapmak için ince forseps kullanın. Bitişik bölgelerden kontaminasyonu önlemek için mikrodiseksiyon sırasında çok muhafazakar olun.
GFP pozitif EGL dokusunu buz üzerinde DPBS dolgulu yeni bir kaba aktarın. Herhangi bir moleküler katman dokusunu dahil etmekten kaçının, çünkü bu, kültürü Bergman glia'yı ifade eden iç içe geçme ile kirletecektir. Ardından, izole edilmiş EGL dokusunu çevreleyen agroları çıkarın.
EGL artık tek hücreli bir süspansiyon için paan tabanlı bir protokol kullanılarak ayrıştırılabilir. Bu işlem tamamlandığında, faks arabelleğindeki hücreleri tekrar askıya alın. Faks kullanarak CFP hücrelerini toplamaya devam edin.
Bunları yüksek hızlı bir sitometre ve bir CFP filtresi kullanarak sıralayın ve buz gibi soğuk faks arabelleğine çekin. P dört beyincik başına yaklaşık 100.000 NPS elde edilmelidir. Daha sonra havuzlanmış hücreleri beş dakika boyunca 300 Gs'de santrifüjleyin.
Onları yeniden kültürlemek için hücreleri hemen kullanın. Bunları önceden ısıtılmış NBB 27 ortamında askıya alın. Daha sonra bunları poli D lizin kaplı kapak fişlerine yükleyin.
Hücre bella dilimleri, CFP farelerinde P dört matematik bir GFP yuvasından hazırlandı. Serebellar EGL, esas olarak GFP eksprese eden GMP'leri içeriyordu ve CFP eksprese eden glia ile zenginleştirilmiş moleküler tabakadan kolayca ayrılabiliyordu Gerçekler analizi, EGL'deki hücrelerin %85'inden fazlasının geleneksel GNP'ler olduğunu gösterdi. NEP'ler, mikrodiseksiyon ile EGL'nin derin kısımlarından izole edildi, ardından gerçekler geldi.
Bu hücreler, EGL'nin dört günlük kültüründeki hücrelerin yaklaşık% 5'ini oluşturuyordu. Gerçekler, NPS'yi izole etti, beta tubulin eksprese eden nöronlara yol açtı. Bu, soy kısıtlı nöronal progenitör hücrelerin karakteristiğidir.
Bu prosedürü denerken, hızlı çalışmayı ve dokuyu mümkün olduğunca buz üzerinde tutmayı unutmamak önemlidir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, neonatal farelerin gelişmekte olan beyinciklerinden nestin-eksprese eden progenitorları izole etmek için bir yöntem sunmaktadır. Teknik, bu progenitorları daha fazla çalışma için saflaştırmak için mikrodiseksiyon ve floresan-aktive hücre sıralama tekniklerini birleştirmektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Gelişimsel Biyoloji
Arka Plan
- Nestin-eksprese eden progenitorlar, beyincikte yeni tanımlanmış bir popülasyondur.
- Bu progenitorları anlamak, nöronal gelişim hakkında içgörüler sağlayabilir.
- Mevcut hücre izolasyon yöntemleri genellikle kontaminasyonla sonuçlanır.
- Bu çalışma, izole edilen hücre popülasyonlarının saflığını artırmayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Beyincikten spesifik nöronal progenitor popülasyonlarını izole etmek.
- Bu hücrelerin daha fazla deney ve analizini sağlamak.
- Kültür için hücre canlılığını koruyan bir teknik göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Floresan markörlerle neonatal farelerden beyinciklerin hasat edilmesi.
- Floresan mikroskop altında dış germinal tabakanın mikrodiseksiyonu.
- Dokunun tek hücreli süspansiyona ayrılması.
- Spesifik hücre popülasyonlarını toplamak için floresan-aktive hücre sıralama.
Ana Sonuçlar
- Spesifik hücre popülasyonları beyincikten başarılı bir şekilde izole edildi.
- İzole edilen hücrelerin %85'inden fazlası geleneksel GNP'ler olarak onaylandı.
- NEP'ler izole edildi ve EGL hücrelerinin yaklaşık %5'ini oluşturdu.
- İzole edilen progenitorlar beta tubulin eksprese eden nöronlara yol açtı.
Sonuçlar
- Yöntem, canlı nöronal progenitorların izole edilmesine izin verir.
- Bu teknik, beyincik gelişimi çalışmasını artırabilir.
- Dokunun canlılığını korumak, başarılı hücre kültürü için kritiktir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Isolating specific cell populations from heterogeneous tissues remains a critical challenge in early-stage target validation and assay development. This microdissection-FACS workflow enables the recovery of live, contamination-free progenitors, supporting mechanistic de-risking and predictive confidence in neuronal lineage studies. The ability to culture isolated cells bridges discovery biology with translational biomarker exploration in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of Nestin-expressing progenitors as a distinct therapeutic hypothesis in cerebellar development.
- Operational Value: Provides a purified cell population free from contaminating granule neuron precursors and Bergman glia for functional target assessment.
- Predictive Value: Supports lineage-restricted progenitor validation through beta-tubulin+ neuronal differentiation readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates a live, single-cell suspension suitable for downstream fluorescent-activated sorting and phenotypic screening.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation through vibratome sectioning and microdissection under fluorescence guidance for reproducible EGL isolation.
- Assay Readiness: Yields approximately 100,000 viable progenitors per P4 cerebellum, enabling scalable compound testing in culture.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Isolated Nestin-expressing progenitors maintain viability for at least four days in culture, supporting preclinical phenotypic analysis.
- Biomarker Alignment: Beta-tubulin expression serves as a measurable readout for neuronal differentiation, aligning with translational biomarker strategies.
- Risk-Adjusted Advancement: Pure progenitor isolation reduces mechanistic ambiguity in de-risking neuronal differentiation pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven isolation of rare cell populations prior to functional screening and mechanistic validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of progenitor identity and spatial localization within the external germinal layer.
- Screening: Produces a standardized, live cell suspension compatible with FACS-based sorting and compound exposure assays.
- Analytics: Enables quantitative measurement of progenitor frequency (~5% of EGL) and differentiation outcomes via beta-tubulin expression.
- Translational Research: Connects isolated progenitors to preclinical validation through sustained culture and lineage-specific marker expression.
- Enterprise Reuse: The microdissection-FACS workflow is adaptable to other fluorescently labeled tissues, supporting platform-level application across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating live Nestin-expressing progenitors free from adjacent cellular contamination.
- Operational Value: Standardizes tissue viability preservation through ice-cold handling and rapid processing, enabling consistent culture initiation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence in neuronal progenitor studies by providing purified, functional cell inputs.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of cerebellar development targets through reliable, contamination-free cellular models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescent tissue dissection and microdissection under stereomicroscopy to maintain spatial precision.
- Dependent on cryostat-compatible embedding media (low-melting agarose) and vibratome sectioning at 600-micron thickness.
- Necessitates standardized FACS setup with CFP and GFP filters for parallel isolation of molecular layer and EGL populations.
- Requires poly-D-lysine coating and NBB 27 media preparation for adherent progenitor culture and differentiation assays.
- Practical limitation: Tissue must be processed rapidly on ice to prevent viability loss, restricting batch size without coordinated workflow.
