Çoklu foton İntrasellüler Sodyum Görüntüleme CA1 piramidal Nöronlar Glutamatın UV-aracılı Odak uncaging ile birlikte

Bu prosedürün genel amacı, sağlam dokudaki merkezi nöronların omurgaları ve dendritleri gibi küçük hücresel bölmelerdeki sodyum dinamiklerini uyandırmak ve analiz etmektir. Bu, önce akut bir fare hipokampal dilimi hazırlanarak, bir piramidal nöronun sodyuma duyarlı floresan boya SBFI ile bir yama pipetinden yüklenmesi ve çoklu foton uyarımı kullanılarak hücresel morfolojinin görüntülenmesiyle gerçekleştirilir. Sonraki adımlar, deney için dikenli bir dendrit seçmek ve Foley'in bu dendrite yakın kafesli glutamat gibi foto aktive bir bileşik enjekte etmektir.

Daha sonra, tercih edilen dendrite yakın küçük bir hacmi hedeflemek için doğru bir şekilde konumlandırılmış bir UV lazer kullanılarak Foley kafessiz glutamata bir UV flaşı uygulanır. Son adım, dendritte SBFI floresansında ortaya çıkan değişiklikleri izlemek ve bitişik dikenlerdeki sodyumda ortaya çıkan değişiklikleri izlemektir. Eşlik eden membran akımları da kaydedilir.

Sonuç olarak, reseptör blokerleri gibi uygun farmakolojik araçların kullanılması, uyarılmış hücre içi sodyum sinyallerini üreten mekanizmaların incelenmesini sağlayacaktır. Bu yöntem, küçük hücresel bölmelerde ve sağlam beyin dokusunda hücre içi sodyum sinyallerinin araştırılması için güvenilir bir araç sağlar. Burada, tüm hücre yama kelepçesi ve çoklu foton sodyum görüntülemeyi, UV ışığının neden olduğu açma için modifiye edilmiş bir prosedürle birleştiriyoruz.

İle, nöroaktif bileşiklerin kesin ve fokal uygulamaları üzerine hücresel yanıtları izlememizi sağlar. Prosedür, Karl KA ve laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi olan Kaan Kleinhans tarafından gösterilecek. Dokunun diseksiyonuna başlamak için, beyni hemen buz gibi soğuk diseksiyon, yapay beyin omurilik sıvısı veya A BOS ile bir Petri kabına yerleştirin ve orta hat boyunca sagital bir kesim yaparak bir hemisferi inceleyin.

Engelleme yüzeyi olarak istenen yönde ikinci bir kesim yapın. Sonra bunu süper yapıştırıcı ile bir vibramın kesme aşamasına takın. Vibramın kesme haznesini ve soğutma elemanını dondurucudan çıkardıktan sonra, beyin bölümü hazneye gelecek şekilde kesme aşamasını yerleştirin.

Daha sonra soğutma elemanını hazneye koyun ve dokuyu buz gibi soğuk diseksiyon A BOS'a batırın. Sonraki kesim 250 mikrometre kalınlığında. Hipokampusun para sagital dilimleri bir viome ile.

CS sıvılarının her zaman köpürtüldüğünden emin olun. Dilimlemeden sonra, dokuyu normal bir A CS'ye sahip bir beherde bir ağ üzerinde tutun ve 34 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra dokuyu oda sıcaklığında tutun.

Bu deney karanlık bir ortamda yapılmalıdır, ancak burada çekim amacıyla loş ışık koşullarında gösterilmiştir. Önce donanımı hazırlamak için, çoklu foton sisteminin bileşenlerini açın ve kızılötesi lazer ışını hizalamasını metin protokolünde açıklandığı gibi ayarlayın. Ardından, pcal hücresinin ve fotoğraf çarpanlarının ayarlarını değiştirerek çoklu foton lazer dalga boyunu ve ışın yoğunluğunu ayarlayın.

Ardından, objektif merceğin altına bir floresan numune slaytı yerleştirerek kafes açma sistemini açın ve kalibre edin. Kafes açma ünitesi kontrol yazılımının kalibrasyon rutinini başlatın. UV lazer noktasına tıklanarak floresan bir CCD kamera ile yakalanırken, UV lazeri tarama aralığı içinde birkaç noktaya ayarlayın.

Her noktada, galvanik tarama aynalarının konumunu yazılımdaki belirli bir koordinata karşılık gelecek şekilde ayarlayın. Kafes açma noktasının doğru konumlandırılması, görüntüleme sisteminin bir görüntüsünün, kafesleme ve görüntüleme bilgisayarları arasındaki bir ağ bağlantısı aracılığıyla içe aktarılmasıyla elde edilir. Ekran yakalayıcı yazılımını kullanarak, görüntüleme yazılımının çerçevelerini sürekli olarak okuyun ve görüntülemeyi ayarlayın.

Ve bittiğinde, kafes çerçeveleri, tüm deney boyunca doğru ayarlamayı sağlamak için her 10. kareyi görüntüleme yazılımından referans görüntü olarak flaş ünitesine uyumlu bir şekilde dışa aktarın. Ardından, kafesli bileşiğin hedef bölgeye iletilmesi için mikro manipülatörlerin elektrofizyoloji bileşenlerini ve basınç uygulama cihazını açın. Ateşle parlatılmış boro silikat cam kılcal damarlar kullanarak tüm hücre yama kelepçesi ve yerel bolluk için pipetleri çekin.

Daha sonra dilimi deney banyosuna yerleştirin ve bir ızgara ile sabitlemek için banyoyu mikroskop aşamasına yerleştirin ve dilimi bir BOS ile kalıcı olarak perfüze edin. Yama pipetini hücre içi çözelti veya SBFI içeren ICS ile yükleyerek tüm hücre yama klemplemesine başlayın, ardından yerel perfüzyon pipetini kafesli bir bileşikle yükleyin. Pipetleri ilgili mikro manipülatörlere takın ve referans elektrodu banyoya yerleştirin.

Bozulmamış hücre morfolojisinin yanı sıra kafes açma ışınının düşük saçılmasını ve zayıflamasını sağlamak için dilimin yüzeyinin 30 ila 70 mikrometre altına yerleştirilmiş bir soma ile bir CA bir piramidal hücre seçin. Bu hücreye IR DIC video mikroskobu kullanan bir yama pipeti ile yaklaşın. Bir giga conta elde edilene kadar hafifçe emme uygulayın.

Hızlı kapasiteyi telafi edin. Daha sonra zarı kırın ve hücre konfigürasyonu elde etmek için hücreyi açın. Son olarak, mevcut kelepçe modunda hücre canlılığını değerlendirin.

Depolarize edici bir akım enjekte edin ve görüntüleme ve stimülasyon gerçekleştirmek için ortaya çıkan ani yükselme aktivitesini kontrol edin. İlk olarak, voltaj kapılı sodyum kanallarının aktivasyonunu ve aksiyon potansiyellerinin oluşmasını önlemek için A BOS'a tetro DOIND ekleyin. Çoklu foton uyarımı ve bunun sonucunda ortaya çıkan SBFI floresansını kullanarak hücresel morfolojiyi görselleştirin.

Deney için dikenli bir dendrit seçin. Daha yüksek çözünürlükteki görüntüler için yakınlaştırın ve dendritin etrafına bir klip kutusu yerleştirin. Ardından pipeti, kafesli bileşikle birlikte dendritin yanına yerleştirin.

Pipeti, tercih edilen dendritin verimli bir şekilde lokal perfüzyonuna izin verecek şekilde konumlandırın. Açma lazerini, açma noktasını ilgilenilen yapıya yakın konumlandıracak şekilde ayarlayın. Ardından, görüntüleme yazılımını kullanarak seçilen dendrit ve bitişik dikenler üzerindeki ilgi bölgelerini ayarlayın.

İlgilenilen bölgeye yaklaşın ve kafesli bileşiği düşük basınçlı başlatma yaması, cl ile birkaç saniye boyunca enjekte edin.amp tetik sinyali aracılığıyla ve floresan kayıtları. Kafesli bileşiğin lokal bolluğu sırasında, ağartmayı önlemek için uyarma ışını tamamen kısılır. Ardından, kafesli bileşiğin yerel bolluğunu durdurun.

Ardından, SBFI'nin verimli bir şekilde uyarılmasını sağlamak için iki foton lazerin yoğunluğunu artırın ve SBFI floresansındaki ve somatik akımdaki değişiklikleri kafeste başlatmak için bir UV flaşı uygulayın, SBFI floresan taban çizgisine geri döndükten sonra kaydı durdurmaya devam edin. Morfoloji elde etmek için, gerçekleştirilen ölçümler için ayarlanan klip kutusu bölgesinin bir XY, Z yığınını kaydedin. En iyi görüntü evrişimini gidermek ve görüntü kalitesini ve çözünürlüğünü artırmak için bu yığının uzamsal olarak fazla örneklendiğinden emin olun.

Nöronların yama pipeti aracılığıyla SBFI ile yüklenmesi, kafesli glutamat ile lokal perfüzyondan sonra çoklu foton uyarımı kullanarak ince dendritler ve bitişik dikenler dahil olmak üzere tüm hücrenin görselleştirilmesini sağladı. Bir dendrite yakın bir UV flaşı uygulamak, hücre içi sodyum konsantrasyonundaki bir artışı yansıtan SBFI'nin floresan emisyonunda geçici bir azalmaya neden oldu. Aynı zamanda, SOMA'nın kafesli glutamat ile önceden perfüze edilmemiş dilimlere bir UV flaşı uygulaması sırasında içe doğru bir akım kaydedildi.

SBFI floresansında veya bu sinyallerin glutamatın açılmasından kaynaklandığını gösteren iç akımlarda hiçbir zaman değişiklik ortaya çıkmadı. Tepe genlikleri, kafesleme noktasına yakın dikenlerde, biraz daha yüksekken, daha ileri dikenler için desenler ana dendrite benziyordu. Glutamatın açılmasına yanıt olarak dendritlere ve dikenlere sodyum akışı yolu, sodyum geçirgen iyonotropik glutamat reseptörleri, glutamat kaynaklı hücre içi sodyum sinyalleri için seçici blokerler kullanılarak incelendi ve ortaya çıkan somatik akımlar bu blokerlerin varlığında ihmal edildi.

Blokerlerin yıkanması üzerine, sinyaller yeniden kazanılır, bu da glutamatın açılmasının hücre içi sodyum geçici ve içe doğru akımlara neden olan ca bir piramidal nöronlar üzerindeki sitotropik glutamat reseptörlerini aktive ettiğini gösterir. Bu prosedürü denerken, preparasyona gelebilecek herhangi bir hasarı en aza indirmek için kızılötesi lazer için mümkün olan en düşük yoğunluğu seçmeyi unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, hücresel mikro kalıntılarda sodyum sinyalizasyonunu incelemek için deneysel yaklaşımımızın kritik adımlarını iyi anlamış olmalısınız Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, diğer teknikler tarafından tanıtılan hareket artefaktlarından arınmış olan sağlam dokuda aktivite uyarılmış hücre içi iyon sinyallerinin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlar.