Floresan protein ifadesindeki Branchiostoma lanceolatum Döllenmemiş Oositlerinin içine mRNA Enjeksiyon

Bu prosedürün genel amacı, gelişmekte olan embriyoların in vivo floresan görüntülemesine izin vermek için bronş stoma lancia latam oositlerine bir floresan proteini kodlayan mRNA'yı tanıtmaktır. Bu, ilk olarak 24 saatlik bir sıcaklık şoku ile olgun amfi ailerin, erkeklerin ve dişilerin yumurtlamasını indükleyerek gerçekleştirilir. Sıcaklık şokunu takiben, dişiler ve erkekler ayrı ayrı yumurtlama kaplarına yerleştirilir ve sırasıyla oosit ve spermin toplanmasına izin verilir.

Sitler polilisin kaplı bir kapta sıralandıktan sonra, sitin çekirdeğinin içine çözelti enjekte etmek için özel olarak hazırlanmış mikroenjeksiyon iğnesi kullanılır. Son adım, sitin bir ila beş damla sperm ile döllenmesidir. Sonuçta iki foton lazer taraması.

Mikroskopi, mikro enjekte edilen mRNA'dan üretilen floresan proteinlerin her yerde bulunan ekspresyonunu göstermek için kullanılır. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü mikroenjeksiyon adımlarının öğrenilmesi zordur, çünkü detaylandırılması ve baskıda kapsanması imkansız olan gerekli teknik beceriler. Başlamak için, enjeksiyon sırasında sitleri hareketsiz hale getirmek için kullanılan polilisin kaplı kapları hazırlayın.

Her 35 milimetrelik hücre kültürü Petri kabı için, tabanı polilisin çözeltisi ile örtün ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Daha sonra, polilisin çözeltisini başka bir tabağa aktarın ve tekrar oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Solüsyonu atın ve Petri kaplarının oda sıcaklığında iki saat baş aşağı kurumasına izin verin.

Kuruduğunda, kaplanmış bulaşıkları plastik bir sargıya sarılmış olarak dört santigrat derecede bir haftaya kadar saklayın. Enjekte edilen embriyoları kültürlemek için kullanılan aros kaplı kapları hazırlamak için yapay deniz suyu ve ters ozmoz suyu yapın. Daha sonra, arosları filtrelenmiş bir SW içinde %1'lik bir konsantrasyona çözün, kabın çok ince bir aros kaplamasını sağlamak için ılık aros solüsyonunu bir Petri kabından diğerine hızla dökün.

Kaplanmış tabakları Saran sargısına sarın ve bir haftaya kadar dört santigrat derecede saklayın. İlk olarak, enjeksiyon karışımını RNA'lar ve DNA içermeyen su fenolünde hazırlayın. Kırmızı, çözeltiyi renklendirir ve başarılı bir şekilde enjekte edilen embriyoların tanımlanmasını sağlar.

Daha sonra, kristalleri peletlemek için karışımı santrifüjleyin ve kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde tutun. Hazır olduğunuzda, kristallerin peletlendiği tüpün dibinden kaçınarak 0,5 mikrolitre enjeksiyon karışımı içeren 10 mikrolitrelik bir pipet yükleyin. 0,5 mikrolitrelik enjeksiyon damlasını pipetleyerek enjeksiyon iğnesini geri doldurun.

İğnenin geniş açıklığına karıştırın. Enjeksiyon sırasında birinin kırılması ihtimaline karşı iki iğne hazırlayın. Enjeksiyonun buharlaşmasını önlemek için iğneleri dibinde su bulunan bir kavanozda saklayın.

Karıştırın ve dört santigrat dereceye yerleştirin. Kabarcık oluşumunu en aza indirmek için enjeksiyon karışımının en az bir saat boyunca enjeksiyon iğnesinin ucuna yavaşça gitmesine izin verin. Oosit ve sperm toplamaya başlamak için, erkekler ve dişiler 24 saat boyunca bir SW'de şoklanır ve daha sonra yumurtlamadan bir ila iki saat önce ayrı kaplara aktarılır.

Yumurtlamanın ardından hemen sperm ve sit toplayın. Toplama sırasında yetişkinleri ürkütmemeye özen gösterin. Ek hareket, toplandıktan sonra hem spermi hem de sitleri dağıtabilir ve dolayısıyla seyreltebilir.

Spermi 1.5 mililitrelik bir tüpte buz üzerinde tutun ve sitleri filtrelenmiş bir SW'de önceden durulanmış Petri kaplarına aktarın. Enjeksiyonları gerçekleştirmek için 100 ila 500 siti başka bir 35 milimetre petri kabına aktarın. Son olarak, sit kavramasının geri kalanını sperm ve sit kalitesi için bir kontrol veya diğer deneyler için dölleyin.

Enjeksiyon prosedürüne başlamak için, iğneyi mikro manipülatöre 25 eksoküler ile bir floresan diseksiyon kapsamı altında yatay düzleme göre 50 derecelik bir açıyla yerleştirin, 30 siti polilisin kaplı bir tabağa aktarın ve enjekte edilen sitleri takip etmeye yardımcı olmak için bir SW'yi filtreleyin. Bunları düzenli bir şekilde bir çizgi boyunca yatırın. Maruziyeti en aza indirmek için her zaman küçük sayılar enjekte edin.

Gelişmekte olan embriyoları deforme etme eğiliminde olan polilisin zamanı. Sitleri mümkün olduğunca yarı saydam hale getirmek için karanlık alan aydınlatmasını kullanın. Daha sonra kaba hareket düğmesi ile enjeksiyon iğnesini ince forseps ile bir sirke yaklaştırın. Kesmek.

Enjektör ile darbe atarak ucun kıvrılmaya başladığı seviyede iğneyi açın. Kırmızı enjeksiyon karışımının 200 x büyütmede iğneden dışarı aktığını doğrulayın. Ve ince hareket düğmesi ile enjeksiyon iğnesini sitin çekirdeğinin içine yavaşça hareket ettirin.

Yüzeysel olarak iki tane yerleştirilirse, enjekte edilen çözelti UO bölgesi içinde kalmayacaktır. Çok uzağa yerleştirilirse, UO sitesi yok edilir. Bir ila üç darbe ile enjekte edin.

İğne yeterince inceyse, sabit basınçta sürekli akışla enjekte edin. Enjeksiyonu takiben enjeksiyon hacminin tek bir oosit hacminin beşte biri ila üçte birine karşılık geldiğinden emin olun. Sızıntıyı önlemek için iğneyi hızla dışarı çekin.

Enjekte edilen solüsyonun sit içinde kaldığını ve birkaç saniye sonra enjekte edilen solüsyonun sit boyunca yayıldığını doğrulayın. Sıradaki bir sonraki siteye geçin. Enjekte edilen embriyoları tararken arka plan floresansını tahmin etmek için her serinin enjekte edilmemiş embriyolarını negatif kontroller olarak saklayın, seri enjekte edilir edilmez oositleri dölleyin.

Oosit kalitesi zamanla düştüğü için, sitleri bir saat içinde enjekte edin ve dölleyin. Yumurtlamadan sonra. Sperm konsantrasyonuna bağlı olarak, UY'ye bir ila beş damla sperm ekleyin ve tabağı döndürün.

Döllenme zarfı embriyolar üzerinde belirgin hale gelmelidir. Yaklaşık bir dakika sonra, başka bir dizi oosit enjekte ederken embriyoların polilisin kaplı tabaktan ayrılmasına izin verin. Ayrıldıktan sonra, embriyoları aros kaplı bir Petri kabına aktarın.

Mümkünse embriyoları polilisin kaplı tabaktan çıkarın. İki hücre aşamasından önce. İki hücreden dört hücreye kadar olan aşamada, bir floresan diseksiyon kapsamı yardımıyla başarıyla enjekte edilen embriyoları seçin.

Bir DSR filtresi ile, başarılı bir enjeksiyon, fenol kırmızısından türetilmiş bir kırmızı floresan sinyali sergileyen normal morfoloji ile gösterilir. Embriyoları ve filtrelenmiş bir SW'yi, istenen aşamaya kadar 19 santigrat derecede agros kaplı Petri kaplarında tutun in vivo görüntüleme, bronşların bu temsili görüntüleri, mRNA'ların mikroenjeksiyonu ve floresan proteinlerinin kaplanmasından sonra bronş stoma lancia lato embriyoları alındı. Bu ilk görüntü, bir H iki B-E-G-F-P yapısının mikroenjeksiyonu ile elde edilen nükleer EGFP ekspresyonunun embriyolarda 16 hücre aşaması kadar erken bir aşamada tespit edilebileceğini göstermektedir.

Bu gastro evre embriyo, nükleer m kiraz ve zar hedefli EGFP'nin her yerde birlikte ekspresyonu için bir örnektir. Nükleer sinyal, bir H iki BM kiraz yapısının mikroenjeksiyonundan kaynaklanırken, hücre zarlarındaki floresan, bir EEG FP CAAX kutu yapısının mikro enjeksiyonu ile elde edilir. Bu gastro evre embriyonun optik bir bölümü, çekirdek ve hücre ana hatlarının sırasıyla nükleer hedefli mCherry ve zarla ilişkili EGFP ile nasıl vurgulandığını gösterir.

Bu mikroenjeksiyon tekniğinin görsel gösterimi, biyoloji topluluğunun evrimsel gelişimindeki araştırmacıları, hayvan evrimini anlamak için önemli bir model olan bireysel görüntüleme, gene özgü manipülasyon ve afi'de kararlı hale getirmek için mevcut ve yeni yaklaşımlar geliştirmek için destekleyecektir.