Name: Embriyonik Kök Hücreleri Kardiyak Progenitör Hücrelerinin türetilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Öğrenin, embriyonik kök hücrelerden kardiyak progenitör hücrelerin türetilmesini. Akış sitometrisi ile zenginleştirme ve büyüme faktörleri kullanılarak kalp hücreleri elde edilir. Bu yöntem rejeneratif tıp araştırmaları için uygundur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dr. Leonid Gnatovskiy'e makaleyi dikkatli ve eleştirel bir şekilde okuduğu için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (HL109054) ve Samuel ve Jean Frankel Kardiyovasküler Merkezi, Michigan Üniversitesi (Açılış Fonu) WZ'ye ve Leon H Charney Kardiyoloji Bölümü, New York Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden BL'ye verilen hibelerle desteklenmiştir.

Fare EKH adlı Fare Embriyonik TBMlerin 1. türetilmesi <ol><li> Fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) besleyici tabakası hazırlayın. <ol><li> Sıcak MEF ortam 37 ° C&#39;ye kadar (DMEM içinde% 10 FBS). </li><li> Jelatin kaplı tabak hazırlayın. <ol><li> 10 cm&#39;lik bir tabak içine bir 6-yuvalı plaka arasında bir çukur veya 5 ml su içinde,% 0.1 Jelatin 1 ml ilave edilir. </li><li> En az 30 dakika boyunca plakaları ya da yemekler, 37 ° C&#39;de ya da oda sıcaklığı bırakın. Kullanmadan önce jelatin talip. </li></ol></li><li> Çözülme hafifçe çalkalanarak, 37 ° C su banyosu içinde hızla MEFS maruz bırakıldı. </li><li> 15 ml veya 50 ml konik bir tüp yavaşça hücreler aktarın. Önceden ısıtılmış MEF ortam 5 ml. Yavaşça hücreler girdap ve 5 dakika için 200 x g&#39;de santrifüj. </li><li> MEF ortamda hücrelerin tekrar ve canlı hücreleri saymak. 10 cm&#39;lik bir tabak hücreleri 2 ml 6 yuvalı plakadan gelen başına hücre ve 10 ml: Aşağıdaki MEF ortam hacimleri kullanın. </li><li> 6-delikli plakalara Levha hücreleri veya 1-2 en az 10 cm yemeklerPlaka / tabak başına x 10 6. </li><li> 37 ° C&#39;de, MEF plakalar / tabaklar inkübe,% 5 CO2, en az 24 saat önce kullanımı. NOT: Bir haftadan daha eski MEF plakaları / yemekler atın. </li></ol></li><li> Fare EKH hazırlayın <ol><li> Kültür Isl1-CRE; Rosa26YFP / Mef2c-CRE; % 90 konfluent kadar MEF&#39;ler üzerinde Rosa26YFP fare EKH. Kullanım ES hücre ortamı 410 ml DMEM, 75 ml FBS, 0.1 mM MEM NEAA, 2 mM L-glutamin, 0.1 mM piruvat, 100 E Pen / Strep, ve 0.1 mM β-merkaptoetanol içermektedir. </li><li> 1.1.2 tarif edildiği gibi, jelatin kaplı 6 oyuklu plakalar hazırlamak. </li><li> Plakalardan aspire orta ve DPBS hücreleri durulayın. <ol><li> Aspire DPBS ve 6 oyuklu plakanın bir kuyuya 0.4 mi% 0.25 tripsin ekleyin. 5 dakika için 37 ° C,% 5 CO2 seviyesinde hücreleri inkübe edin. Tripsin reaksiyonu durdurmak için 1 ml önceden ısıtılmış ES ortamı ekleyin. </li></ol></li><li> Hasat hücreleri ve santrifüj hücreleri 200 xg ve aspire orta az. Süspanse 1 ml ES hücre ortamında hücre ve hücreleri saymak. &lt;/ Li&gt; <li> 3 x 10 4 / cm2 yoğunlukta, jelatin-kaplanmış plakalar üzerinde plaka EKH. EKH yaklaşık% 90 konfluent ulaştığında yaklaşık 2 gün boyunca 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 inkübe edin. Orta gün değiştirin. </li><li> EKH% 90 konfluent olduğunda, tekrar tamamen MEF besleyiciler kaldırmak için 1.2.2-1.2.5 adımları. </li></ol></li><li> EB formasyonu TBM farklılaşmasını teşvik <ol><li> Ardından farklılaştırma ortamı hazırlayın: 36 ml IMDM, 12 mi Ham F12, 2 mM L-glutamin, 0.34 ml BSA (% 7.5), 0.25 mi, N2, 0.5 mi B27, 50 ug / ml AA, ve 0.45 mM 1-tiogliserol. </li><li> Aspire hücrelerinden orta ve DPBS ile durulayın. Aspire DPBS ve 6 oyuklu plakanın bir kuyuya 0.4 mi% 0.25 tripsin ekleyin. 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Tek hücre içine hücre kümeleri dağıtmak için aşağı reaksiyon ve pipet yukarı durdurma ve 1 ml farklılaşma orta ekleyin. </li><li> Santrifüj EKH 5 dakika için 200 xg&#39;de ve orta atın. <ol><li> Süspanse 1 x 10 6 &lt;/ Sup&gt; 1 mi farklılaşma ortamında EKH. İlk EB toplama için 37 ° C &#39;de ayırt ortamında 1 x 10 5 hücre / ml&#39; lik bir konsantrasyonda, düşük sıyrılma Petri kabındaki hücrelere hücre sayımı ve kültür. </li></ol></li><li> İki gün EB oluşumundan sonra, 50 ml&#39;lik tüplere yemekleri EBS aktarmak. 1 dakika için 200 xg&#39;de Spin. Orta çıkarın ve Ca 2+ ve Mg 2+ olmadan 10 ml DPBS ile EBS durulayın. </li><li> Aspire DPBS ve 1 mL% 0.25 tripsin ekleyin. 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. Reaksiyonu durdurmak için 4.5 mi farklılaşma orta ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı tek hücre içine EBS ayırmak. </li><li> 5 dakika süreyle 200 x g&#39;de hücreleri santrifüjleyin. 1 ml farklılaşma ortamda aspire orta ve tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Hücre sayımı ve farklılaşma ortamında 1 x 10 5 hücre / ml, 2 x 10 6 hücre seyreltin. 5 ng / ml, 0.8 ng / ml&#39;lik nihai konsantrasyonda ortama VEGF BMP4 ve aktivin A ilave edin ve 5 ng / ml idi. Cultu37 ° C &#39;de, ikinci EB formasyonu için Petri kabındaki hücrelere yeniden. </li><li> İkinci EB oluşumundan sonra 40 saat, 50 ml&#39;lik tüplere EBS aktarmak. 5 dakika için 37 ° C &#39;de, 1 ml% 0.25 tripsin ile EBS, ayırma DPBS ile bir kez yıkayın. Pipet yukarı ve aşağı tek hücre içine EBS ayırmak. </li><li> 5 ng / ml VEGF, 10 ng / ml bFGF ve 12.5 ng / ml FGF10 ile Stempro-34 ortamı içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Jelatin kaplı plakalara, 2 x 10 5 / cm2&#39;de, hücreler plaka. TBM izole edilmesinden önce 32 saat süre ile 37 ° C inkübatör içinde kültürü. </li></ol></li><li> MCPCs yalıtmak <ol><li> Aspire orta ve DPBS ile durulayın. 5 dakika için 37 ° C &#39;de kültür plakalarına 0.5 mi% 0.25 tripsin ekleyin. Reaksiyonu durdurmak için 4.5 mi farklılaşma orta ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı tek hücre içine EBS ayırmak. FACS-saflaştırılması için% 2 FBS / PBS santrifüj ve tekrar süspansiyon hücreleri hücreleri toplayın. </li><li> Negatif kontrol olarak sıralayıcı farklılaşmamış EKH çalıştırın. Değişim gerilimi ileri dışkılarını ayarlamak içinter (FSC) ve yan dağılım (SSC) istenen nüfus seçmek için. Enkaz ve dublet dışlamak için yan dağılım ve genişliği karşı ileri dağılım yüksekliği karşı dağılım ileri kullanın. Seçilen alt-popülasyonda, ESC kontrol dağılımına göre, hücre otofloresans ortadan kaldırmak için histogram üzerinde olumlu YFP bir kapı çizin. YFP + yolluk gelen YFP + TBM&#39;leri toplayın. </li><li> Farklılaştırma ortamının (1.3.1) &#39;e sahip 6-çukurlu plakalarda saflaştırılmış TBM (YFP + hücreleri) plaka. Kardiyomiyositler ve SMC&#39;lerin içine TBMlerin farklılaşması için 37 ° C&#39;de Kültür ek 3-5 gün. </li></ol></li></ol> İnsan EKH İnsan Embriyonik TBMlerin 2. türetilmesi <ol><li> Yemlikler hazırlayın <ol><li> 2 x 10 4 / cm2 yoğunluğunda, yukarıda tarif edildiği gibi, fare embriyonik fibroblastlar (MEF&#39;ler) besleyici tabaka hazırlanır. </li></ol></li><li> İnsan EKH koruyun <ol><li> CRE, M rutin pCAG-flox-STOP-flox-GFP veya RFP EKH: İnsan Isl1 koruyunNormal HESC ortamı (Nakavt DMEM / F-12 385 ml, Nakavt SR 100 mi, 2 mM L-glutamin, 0.1 mM NEAA, 0.1 mM β-merkaptoetanol, 10 ng / ml temel FGF) kullanılarak EF. Kalp farklılaşma önce, en az 2 pasajlar için besleyici serbest durumda insan EKH aktarmak. </li></ol></li><li> Besleyici serbest durumda insan EKH hazırlayın <ol><li> İnsan EKH kültür için kaplanmış tabak hazırlayın. <ol><li> Gece boyunca 4 ° C &#39;de Matrigel çözülme. Buz üzerinde 50 mi tüp koyun ve bir tüp içine, 30 ml soğuk DMEM / F12 ortamı ilave edin. </li><li> Soğuk ortama 1 ml Matrigel ekleyin ve iyice karıştırın. 10 cm&#39;lik bir tabak içine bir 6-yuvalı plaka oyuğuna ya da 5 ml &#39;si içerisine 1 ml soğuk Matrigel, DMEM / 12 orta ekleyin. </li><li> 2 saat boyunca levhalar / gece boyunca 4 ° C&#39;de yemekleri veya oda sıcaklığını bırakın. Orta aspire kullanmadan önce. </li></ol></li><li> MEF plaka aspire medya ve DPBS insan EKH durulayın: İnsan plakalar üzerine EKH bölün. Daha sonra 6-çukurlu plaka içinde bir kuyu 1 ml dispaz (1 mg / ml) ilave edilmektedir. 37 ° C de kuluçkaya bırakılırinkübatör kolonilerinin kenarları ayırmak başlayana kadar. </li><li> Dispase çözüm çıkarın. Daha sonra 2,5 ml / add iyi mTeSR orta veya MEF-klimalı ortamda başına plaka, iki kez DPBS ile durulayın. </li><li> Küçük öbekler halinde insan ESC kolonileri yıkmak için bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri kazıyın ve dikkatlice pipetlemeyin ve. </li><li> ESC kümeleri aktarın ve 1 sulandırmak: 3 kaplanmış plakalar halinde. </li><li> 2 ml / kuyu mTeSR orta veya MEF-klimalı orta ekleyin ve günlük orta değiştirin. </li><li> MTeSR ortam veya en az 2 pasaj ile kaplanmış plakalar üzerine, MEF-şartlandırılmış ortam içinde kültür insan EKH. </li></ol></li><li> İnsan EKH TBM farklılaşmasını teşvik <ol><li> Hücreler ~% 90 konfluent olduğunda, orta aspire ve DPBS ile durulayın. Daha sonra 20 dakika boyunca 37 ° C&#39;de 0.5 mg / ml dispaz içinde HESC inkübe edin. </li><li> Hücre kaldırıcı plakalardan hücreleri çıkarmak iki kez DPBS HESC durulayın, sonra, DMEM / F12% 18 FBS, 0.1 mM NEAA, 2 mM ihtiva eden (farklılaştırma ortamının hücre kelepçeler tekrar süspansiyonL-glutamin, 0.1 mM β-merkaptoetanol ve 50 ug / ml askorbik asit). </li><li> EB oluşumu için 6-kuyu, ultra-düşük bağlantı plakaları içine hücreleri aktarın. </li><li> Ertesi gün farklılaşma ortamı değiştirin. </li><li> Her 3 günde bir orta takın ve süspansiyon kültürü içinde EBS korumak. </li></ol></li><li> HCPCS yalıtmak <ol><li> Geç insan TBM izolasyonu için farklılaşma 9 gün daha EBS toplayın. </li><li> Aspire orta ve iki kez DPBS ile EBS durulayın. 5 dakika için 37 ° C &#39;de 6-çukurlu kültür plakalarının her bir oyuğuna 0.5 mi% 0.25 tripsin ekleyin. </li><li> Reaksiyonu durdurmak için farklılaştırma ortamının eşit hacim. Pipet yukarı ve aşağı tek hücre içine EBS ayırmak. % 2 FBS / DPBS&#39;de 5 dk ve tekrar süspansiyon hücreleri için 200 xg&#39;de santrifüj hücreleri toplayın. 40 mikron hücre süzgeç ve FACS-saflaştırılmış RFP + TBM hücreleri ile Filtre hücreleri olarak 1.4.3 de anlatıldığı. </li><li> Plaka geltin kaplı plakalar üzerine HCPCS sıralanır. 7 için farklılaşma ortam içinde kültür HCPCS-9 Gün kardiyomiyosit ve düz kas hücrelerine ayırt etmek. 7 gün kuluçkadan sonra kültür, DMEM / F12 ortamı içinde% 5 Nakavt SR farklılaşmış hücreleri. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Garbern, J. C., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+stem+cell+therapy+and+the+promise+of+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).</li>
<li>Passier, R., van Laake, L. W., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-based+therapy+and+lessons+from+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-based therapy and lessons from the heart.</a> Nature. 453 (7193), 322-329 (2008).</li>
<li>Bondue, A., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesp1%3A+a+key+regulator+of+cardiovascular+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Mesp1: a key regulator of cardiovascular lineage commitment.</a> Circulation Research. 107 (12), 1414-1427 (2010).</li>
<li>Bondue, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesp1+acts+as+a+master+regulator+of+multipotent+cardiovascular+progenitor+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesp1 acts as a master regulator of multipotent cardiovascular progenitor specification.</a> Cell Stem Cell. 3 (1), 69-84 (2008).</li>
<li>Bu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ISL1+heart+progenitors+generate+diverse+multipotent+cardiovascular+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages.</a> Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).</li>
<li>Lei, I., Gao, X., Sham, M. H., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF+protein+component+BAF250a+regulates+cardiac+progenitor+cell+differentiation+by+modulating+chromatin+accessibility+during+second+heart+field+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF protein component BAF250a regulates cardiac progenitor cell differentiation by modulating chromatin accessibility during second heart field development.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (29), 24255-24262 (2012).</li>
<li>Lei, I., Liu, L., Sham, M. H., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF+in+cardiac+progenitor+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF in cardiac progenitor cell differentiation.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 114 (11), 2437-2445 (2013).</li>
<li>Wu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+origin+of+a+bipotential+myocardial+and+smooth+muscle+cell+precursor+in+the+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental origin of a bipotential myocardial and smooth muscle cell precursor in the mammalian heart.</a> Cell. 127 (6), 1137-1150 (2006).</li>
<li>Spater, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+HCN4%2B+cardiomyogenic+progenitor+derived+from+the+first+heart+field+and+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).</li>
<li>Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+right+ventricle%2C+outflow+tract%2C+and+ventricular+septum+comprise+a+restricted+expression+domain+within+the+secondary%2Fanterior+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field.</a> Developmental Biology. 287 (1), 134-145 (2005).</li>
<li>Boheler, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+into+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).</li>
<li>Wada, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+human+cardiomyocyte-like+cells+from+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Induction of human cardiomyocyte-like cells from fibroblasts by defined factors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12667-12672 (2013).</li>
<li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+optimization+of+activin%2Fnodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li>
<li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+enhances+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes.</a> Circulation. 107 (14), 1912-1916 (2003).</li>
<li>Wamstad, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+coordinated+epigenetic+regulation+of+developmental+transitions+in+the+cardiac+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage.</a> Cell. 151 (1), 206-220 (2012).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li>
<li>Gaj, T., Gersbach, C. S. 3rd, Barbas, T. A. L. E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN%2C+TALEN%2C+CRISPR%2FCas-based+methods+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li>
<li>Joung, J. K., Sander, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALENs%3A+a+widely+applicable+technology+for+targeted+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Laflamme, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infarcted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts.</a> Nature. biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PloS One. 6 (4), e18293(2011).</li>
<li>Kouskoff, V., Lacaud, G., Schwantz, S., Fehling, H. J., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+development+of+hematopoietic+and+cardiac+mesoderm+during+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sequential development of hematopoietic and cardiac mesoderm during embryonic stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (37), 13170-13175 (2005).</li>
<li>Xu, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+medium+supporting+cardiomyocyte+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%3A+Research+in+Biological+Diversity%22%5BJournal%5D)">Chemically defined medium supporting cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells.</a> Differentiation: Research in Biological Diversity. 76 (9), 958-970 (2008).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-1857 (2012).</li>
<li>Bizy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+light+chain+2-based+selection+of+human+iPSC-derived+early+ventricular+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Myosin light chain 2-based selection of human iPSC-derived early ventricular cardiac myocytes.</a> Stem Cell Research. 11 (3), 1335-1347 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.

Bu protokol, mESC'lerin farklılaşmasına ve insan ESC'lerinin CPC'lere kendiliğinden farklılaşmasına rehberlik etmek için büyüme faktörlerini kullanan bir yöntemi birleştirir. Floresan raportör ile işaretlenmiş CPC soyu, CPC'leri FACS tarafından verimli bir şekilde tanımlamak ve izole etmek için kullanılır. FACS ile saflaştırılmış CPC'ler, kardiyomiyositlere, düz kaslara ve endotel hücrelerine farklılaşma kapasitesini korur ve in vivo hücrelerle karşılaştırılabilir bir ekspresyon profiline sahiptir. Bu nedenle, bu CPC'ler...

A correction to the author list was made to: <a href="http://www.jove.com/video/52047/derivation-of-cardiac-progenitor-cells-from-embryonic-stem-cells">Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells</a>.
The following author is now listed as a co-corresponding author:
Lei Bu

A correction to the author list was made to: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells.

Erratum: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Kalp hastalığı dünyanın önde gelen nedeni, bugün kalır ve ölüm oranları son iki yılda (Amerikan Kalp Derneği) hemen hemen değişmeden kalmıştır. Etkili bir şekilde engellemek veya kalp yetmezliği ters yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için önemli bir ihtiyaç vardır. Bir umut verici bir strateji kök hücre biyolojisi 1 hızlı gelişimi aşağıdaki hücre tabanlı tedavi yöntemidir. Bu bağlamda, multipotent TBM bağlı olarak çoğalır, ancak sadece kalp dizi farklılaşma kararlı etme kabiliyetleri tedavisi için mükemmel bir hücre kaynağı olabilir. Bu nedenle, verimli ve sağlam bir yöntem oluşturmak ve kalp hücre tedavisi çalışmaları için büyük önem taşımaktadır TBM&#39;lerini izole etmek. Bu protokol, erken embriyogenezin ve nasıl EKH kendi üretim sırasında belirlenen embriyonik TBM&#39;lerle üzerinde duruluyor. Çeşitli TBM da kemik iliği 2, embriyonik ve yetişkin kalplerinden izole edilmiştir. Embriyo gelişimi sırasında, kemik morphogemanyetik proteinleri (BMP), kanatsız-tipi MMTV entegrasyon sitesi aile üyeleri (Wnts) ve Düğüm sinyaller Mesp1 + Multipotent mezoderm 3 bağlılığını neden. Mesp1 + hücreleri, daha sonra embriyonik TBM 4 içinde farklılık gösterir. Bu TBMler genellikle NK2 homeobox 5 (Nkx2-5), Isl LIM homeobox 1 (Isl1), T-box 5 (Tbx5), ve miyosit arttırıcı faktör 2C (Mef2c), birincil ve ikinci kalp alanları oluşturmak, HCN4 tarafından işaretlendiği ve cardiogenesis 5-10 sırasında kalbin ana bölümden katkıda bulunur. Nkx2-5 + ve Isl1 + / Mef2c + Her iki TBM kardiyomiyositlere ayırt edebiliyoruz, düz kas hücreleri (SMC&#39;lere) ve endotel hücreleri 5-8. Bu nedenle, bu TBM kalp damar yanı sıra kardiyak dokulara doğuran ve hücre bazlı kalp tedavisi için ideal bir hücre kaynağıdır olacaktır. Sonuç olarak, in vitro TBM&#39;leri üreten kardiyovasküler çalışmalarda önemli bir araştırma odağı olmuştur. EKH sınırsız genişleme kapasitesi a sahip olduğundannd blastosist aşamasında ICM hücreleri temsil doğal embriyogenez aşağıdaki embriyonik TBM&#39;lerle içine EKH farklılaşması TBM&#39;lerini elde etmek mantıklı ve etkili bir yaklaşım olarak kabul edilir. EKH gelen TBM&#39;ler elde etmek için bir çok uygulamalı bir yaklaşım EBS 11 içine EKH bir araya etmektir. Farklılaşma verimliliğini artırmak için, kardiyak gelişme bilgiye dayalı tanımlanmış kimyasal ve büyüme faktörleri 12-14 kullanılmıştır. Ancak, yaygın olarak alanda kabul edilen kesin TBM belirteçler, özellikle de herhangi bir hücre yüzeyi işaretleri vardır. Bu sorunu gidermek için, EKH Isl1 + veya Mef2c + TBM ve Cre / loxP sistemi kullanılarak floresan gazetecilere türevleri işaretlemek için tasarlanmıştır. CRE rekombinaz Isl1 / Mef2c promotör / güçlendirici kontrolü altında çaldı. Bir kurucu promoteri tarafından tahrik edilen modifiye floresan protein RFP veya YFP gen CRE rekombinaz ile flox durdurma kodonu çıkarılması ile aktive edilebilir(Isl1: CRE;-pCAG-flox-STOP-flox GFP veya RFP / Isl1-CRE; Rosa26YFP / Mef2c-CRE; Rosa26YFP) 5,6. EKH ikinci kalp alan TBM&#39;ler ayrılırlar sonra, Isl1 / Mef2c promotör / güçlendirici tahrik CRE floresan gazetecilere aktive edecek ve TBM FACS-saflaştırma ile zenginleştirilmiş olabilir. Kısaca, EB toplama yöntemi ESC farklılaşma başlatmak için kullanılır. Farklılaşma verimliliğini artırmak için, farklılaşmış hücreler, askorbik asit (AA) ve BMP4, aktivin A ve VEGF 13,15 gibi büyüme faktörleri ile muamele edilir. Bu protokol fare ve insan EKH her ikisini de kullanarak sağlam ve verimli TBM farklılaşmasını sağlar.

<table><tbody><tr><td>FBS</td><td>Thermo scentific</td><td>SH30070.03E</td><td></td></tr><tr><td>Knockout SR</td><td>Life teknolojisi</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life teknolojisi</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life teknolojisi</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life teknolojisi</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life teknolojisi</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Life teknolojisi</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Life teknolojisi</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Jambon' s F12</td><td>Life teknolojisi</td><td>11765062</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life teknolojisi</td><td>12440061</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life teknolojisi</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Life teknolojisi</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life teknolojisi</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Stempro-34</td><td>Life teknolojisi</td><td>10639011</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/ F12</td><td>Life teknolojisi</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>BSA&nbsp;</td><td>Yaşam teknolojisi</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin&nbsp;</td><td>Yaşam teknolojisi</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Askolik Asit&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>1-Tiyogliserol</td><td>Sigma</td><td>M1753</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>VEGF</td><td>Ar-Ge D</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>Bmp4</td><td>Ar-Ge D</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>ActivinA Ar-Ge</td><td> D</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>bFgf</td><td>Ar-Ge D</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>Fgf10</td><td>Ar-Ge D</td><td>345-FG</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR</td><td>Kök hücre teknolojileri</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr></tbody></table>

embriyonik kök hücreleri kardiyak progenitör hücrelerinin türetilmesi

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Kardiyak progenitör hücreler (CPC'ler), kardiyomiyositlere, düz kas hücrelerine (SMC) ve endotel hücrelerine farklılaşma kapasitesine sahiptir ve kalp hastalığına karşı hücre tedavisinde büyük umut vaat eder. KKG'leri izole etmek için çeşitli yöntemler arasında, embriyonik kök hücrenin (ESC) KKG'lere farklılaşması, ESC'lerin sınırsız hücre kaynağı sağlayabilmesi nedeniyle bu alanda büyük ilgi görmektedir. Sonuç olarak, ESC'lerden TBM'ler türetmek için çok sayıda strateji geliştirilmiştir. Bu protokolde, embriyonik KKG'lerin hem fare hem de insan ESC'lerinden farklılaşması ve saflaştırılması anlatılmaktadır. Embriyonik KKG'leri izole etmek için hücre yüzeyi belirteçlerini kullanmanın zorluğu nedeniyle, ESC'ler, KKG'ye özgü kre rekombinaz ekspresyonu ile aktive edilen floresan raportörlerle tasarlanmıştır. Böylece, TBM'ler floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) ile zenginleştirilebilir. Bu protokol, CPC spesifikasyonu ve zenginleştirme için ESC'lerden embriyoid cisimleri (EB'ler) oluşturma prosedürlerini gösterir. İzole edilen CPC'ler daha sonra kardiyak soy farklılaşması ve diğer biyolojik testler için kültürlenebilir. Bu protokol, hem fare hem de insan ESC'lerinden CPC'lerin sağlam ve verimli bir şekilde türetilmesi için optimize edilmiştir.

Protokol pek çok ES hücre hatları TBM türetilmesini göstermektedir. EKH TBM'leri içine ayırt etmek için EBS oluşturmak için toplanır. EKH rutin MEF besleyiciler (Şekil 1A, F) tutulur ve besleyiciler farklılaşma önce kaldırılır. Farklılaşma ortamında EBS (Şekil 1B, G) içine EKH agregasyonu üzerine, ikinci oluşan EBS fare hücre hatları (Şekil 1C) içinde mezoderm farklılaşmasını geliştirmek için BMP4 ve aktivin A ile işleme tabi tutulur. Floresan proteini YFP / RFP <strong...

Bu protokolde, hem fare hem de insan embriyonik kök hücrelerinden kardiyak progenitör hücrelerin türetilmesi gösterilecektir. Bu protokoldeki ana strateji, embriyonik kök hücre hatlarına tasarlanmış floresan raportörler kullanarak kardiyak progenitör hücreleri akış sitometrisi ile zenginleştirmektir.

Embriyonik Kök Hücreleri Kardiyak Progenitör Hücrelerinin türetilmesi

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Bu prosedürün genel amacı, embriyonik kök hücrelerden insan veya fare kardiyak progenitör hücreleri üretmektir. Bu, yüksek kaliteli embriyonik kök hücrelerde veya e ESC'lerde veya fare embriyonik besleyici hücrelerinde veya mitlerinde ilk kültür ile gerçekleştirilir. İkinci adımda, ilk embriyo cisimciklerinin oluşumunu kolaylaştırmak için hücreler jelatin kaplı petri kaplarına aktarılır.Daha sonra, hücreler birleştirilir ve ikinci form embriyo cisimciklerini indüklemek için kültürlere büyüme faktörleri eklenir. Son adımda, embriyo cisimleri tekrar ayrıştırılır ve elde edilen hücreler ek büyüme faktörleri ile tedavi edilir. Sonuç olarak, kardiyak döl hücreleri, kardiyomiyosit ve düz kas hücresi farklılaşması için daha fazla kültürlenebilir.Bu prosedürü denerken, en iyi kardiyojenik potansiyele sahip hücrelerin seçimine izin vermek için her bir hücre hattının farklılaşma verimliliğini test etmek önemlidir. Şimdi, laboratuvarda doktora sonrası araştırmacı olan Dr.Inland Lamb, fare embriyo cisimlerinden kardiyak progenitör hücre farklılaşmasını indüklemek için prosedürü gösterecek Hücreler %90 uyumlu olana kadar fare e ESC'lerini veya MES'i ESC ortamında kültürleyerek başlayın. Daha so

derivation-of-cardiac-progenitor-cells-from-embryonic-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu protokol detayları fare embriyonik kök hücreler (ESC) ve ölümcül ışınlanmış alıcı farelere sonraki enjeksiyon transplante hematopoietik kök hücre türetme. Kısaca ESC embriyoid organları, sonra retroviral HoxB4 ve OP9 stromal hücreler ve hematopoetik sitokinlerin birlikte kültürlü ile enfekte olarak ayırt edilirler.

Murin Embriyonik Kök Hücre Hematopoetik Kök Hücre türetilmesi

Biz büyük bir tedarik kardiyovasküler onarım için insan kalp atalarıdır ve fonksiyonel kardiyomiyositlerde türetilmesi sağlayan küçük moleküller ile tanımlanmış koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan cardioblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

Pluripotent kök hücreler, embriyonik veya uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri ya, kardiyomiyositler dahil olmak üzere insan farklılaşmış hücrelerin, değerli bir kaynak oluşturmaktadır. Burada, bir embriyoid organları tabanlı protokol ile fonksiyonel insan kardiyomiyositlerin elde etmek için bunları nasıl kullanacağınızı gösteren, iPS hücrelerin kalp indüksiyon üzerinde durulacak.

İnsan kardiyomiyositleri Üretimi: Besleyici-ücretsiz İnsan Bağlı Pluripotent Kök Hücre A Farklılaşma Protokolü

Makale verimli seçici referans belirteçlerinin analizi nüfusun homojenliği ve kimliğini değerlendirmek için flow sitometri ile takip Wnt yolu, modüle göre kardiyomiyositlere insan pluripotent kök hücreleri ayırt etmek için ayrıntılı yöntem anlatılmaktadır.

Sitometrisi ile Yüksek Verim kardiyomiyositlerde İnsan pluripotent kök hücrelerin Farklılaşma ve Karakterizasyonu

Burada, fonksiyonel, sözleşme, cardiomyocyte benzeri hücreler üretmek için kardiyak farklılaşma potansiyeli insan Mezenkimal kök hücrelerin genç kaynaklarının verimli koşum için bir yöntem mevcut tüp bebek.

Vitro İnsan Mezenkimal Kök hücre farklılaşma fonksiyonel Cardiomyocyte benzeri hücre içine

Burada ilk kalp alan benzeri kardiyak ataları ve ventrikül benzeri cardiomyocytes insan pluripotent kök hücre üretmek için aktivin A ve lentivirus-aracılı ID1-overexpression, basit bir birleşimini kullanarak ölçeklenebilir bir yöntem açıklanmaktadır.

İlk kalp alan benzeri kardiyak ataları ve ventrikül benzeri Cardiomyocytes insan Pluripotent kök hücrelerden nesil

Bu iletişim kuralı bir endotel farklılaşma tekniği kalp progenitör hücreler için açıklar. Bu özellikle serum konsantrasyonu ve hücre tohum yoğunluğu endotel farklılaşma potansiyeli etkilemesi üzerinde duruluyor.

İndüksiyon düşük Serum koşullar altında kalp Progenitor hücreler endotel farklılaşma

Bu makalede genel izolasyon, karakterizasyonu ve kardiyak kök hücreleri (CSCs) Yetişkin fare kalp farklılaşma için protokolü standartlaştırmak için hedeftir. Burada, fare CSCs yalıtmak için bir yoğunluk degrade Santrifüjü yöntemi ve CSC kültür, yayılmasını önleme ve farklılaşma cardiomyocytes içine hazırlanmış yöntemlerini açıklar.

Yalıtım, karakterizasyonu ve yetişkin fare kalp kalp kök hücre farklılaşma

Burada, bir analiz DNA bütünlük içinde kök hücre hücre transplantasyonu önce değerlendirme için deneysel bir kurulumuna ilişkin ayrıntılı bir açıklama sağlamak.

Kardiyak hücre tedavisi için kök hücre DNA bütünlük değerlendirilmesi

Bu yöntemin amacı, progenitör hücre spesifikasyonu ve fonksiyonel özelliklerini incelemek ve kalp hastalığı modelleme için oda spesifik kardiyak hücreler oluşturmak için, in vitro kalp alanına özgü kardiyak progenitör hücreleri oluşturmadır.

In vitro Generation fare kalp alanı-spesifik kardiyak progenitor hücreler

Öğrenin, embriyonik kök hücrelerden kardiyak progenitör hücrelerin türetilmesini. Akış sitometrisi ile zenginleştirme ve büyüme faktörleri kullanılarak kalp hücreleri elde edilir. Bu yöntem rejeneratif tıp araştırmaları için uygundur.

Embriyonik Kök Hücreleri Kardiyak Progenitör Hücrelerinin türetilmesi

Daha fazla video keşfet