Name: Hızlı Floresan In Situ Hibridizasyon Protokolü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Öğrenin hızlı floresan in situ hibridizasyon ve immünofloresan yöntemini, X kromozomu inaktivasyonu sırasında uzun kodlamayan RNA dinamiklerini ve epigenetik modifikasyonları incelemek için. Bu teknik tek hücre düzeyinde RNA ve kromatin yapısının görselleştirilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

RNA FISH'te oligonükleotid tasarımı için yararlı tavsiyeler için Hongjae Sunwoo'ya teşekkür ederiz. Ayrıca taslağı düzenlediği için Serenity Curtis'e teşekkür ederiz. NY, Japonya Bilimi Teşvik Derneği'nin (JSPS) Yurtdışı Araştırma Doktora Sonrası Bursu tarafından desteklendi. Bu çalışma NIH (RO1-GM102184), March of Dimes Araştırma Vakfı (#6-FY12-337) ve Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi'ndeki Gelişim Fonu ve Mütevelli Heyeti Hibesi tarafından YO'ya desteklenmiştir.

1. Prob Hazırlık <ol><li> 5&#39;-amino modifikasyon ile birden fazla benzersiz Xist oligonükleotitlerin (20-30 nükleotid uzunlukta oligonükleotitlerin, 63-65 ° C, erime sıcaklığı, Tablo 1) elde edilir ve su içinde askıya. </li><li> 5&#39;-amino modifikasyon (toplam 4.5 ug) ve imalatçının talimatları izlenerek, amin-reaktif bir floresan boya ile etiket ile oligonükleotidler havuzu, eşit molar miktarlarda. <ol><li> Nükleaz içermeyen suyun nihai 5 ul toplanmış oligonükleotidler çözülür ve oligonükleotit solüsyonuna 1 M sodyum bikarbonat ve 3 ul ekleyin. </li><li> Kısaca, amin-reaktif boya ve girdap şişeye 2 ul DMSO ekleyin. </li><li> DMSO içinde reaktif boya ile oligonükleotid çözeltisi karıştırılır ve karanlıkta 1 saat boyunca oda sıcaklığında karışım inkübe edin. </li></ol></li><li> Etanol ile çökeltme, ardından G-25 kolonu ile floresan etiketli oligonükleotid probları arındırın. <ol><li&gt; 750 xg 1 dakika süreyle Santrifüj G-25 sütunu fazla depolama tampon kaldırmak için. </li><li> Adım 1.2.3 üretilen etiketleme karışımına 40 ul nükleaz ücretsiz su ekleyin ve G-25 kolonuna uygulanır. 2 dakika boyunca 750 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Aşama 1.3.2 arıtılmış proba 50 ul nükleaz içermeyen su, 10 ul 3 M sodyum asetat (pH 5.2) ve 250 ul etanol ekleyin. 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 21,000 x g&#39;de 30 dakika santrifüj için -80 ° C&#39;de saklayın. </li><li> % 70 etanol, 1 ml ile bir kez çöktürülerek oligonükleotidler yıkayın. </li><li> 50 ul içinde yeniden askıya nükleaz içermeyen su veya TE (10 mM Tris-HCI, pH 7.5; 1 mM EDTA) içinde yaklaşık 10 uM bir nihai konsantrasyonu. </li></ol></li><li> Hibridizasyon tampon maddesi ile 250 nM arasında bir nihai konsantrasyona floresan etiketli oligonükleotit problar seyreltin (% 10 formamid, 2X SSC [300 mM NaCI, 30 mM sodyum sitrat] 2 mg / ml BSA;% 10 dekstran sülfat). NOT: Bu hızlı BALIK protokolü ile, oligonükleotid pXist elbiseler tasarlanmış ve hibridizasyon için kuluçka süresini kısaltmak için, oligonükleotit problar kullanılarak normal BALIK protokollerine göre daha yüksek bir konsantrasyonda kullanılmıştır. </li></ol> 2. Slayt Hazırlama NOT: Slaytlar fare embriyonik kök (ES) veya embriyoid gövdesini (EB) kullanarak bağışıklık FISH için hazırlanabilir ya poli-lizin-tedavi slayt üzerinde doğrudan büyüyen veya hücre süspansiyonu ile sitospin kullanarak hücreleri 20, 21 farklılaştırarak. Burada, Sitospin slayt hazırlama gösterilir. <ol><li> 6 gözlü tabak içinde kültür ortamı aspire. İyice PBS (oda sıcaklığı) ve aspirasyon ile yıkayın. </li><li> 37 ° C&#39;de 5-10 dakika süreyle inkübe, 6-çukurlu tabağa tripsin 0.5 ml ilave edilir. </li><li> Ortamın 5 ml ilave edilir ve bir kaç kez özenle aşağı yukarı pipetleme hücreleri dağıtılır. </li><li> Oda sıcaklığında, 200 x g&#39;de 5 dakika boyunca, bir 15 ml tüp santrifüj hücreleri aktarın. </li><li> Ortam, bir atınyavaşça 2 ml PBS içinde hücrelerin süspansiyonu d. </li><li> Hemasitometre kullanarak hücreleri sayın ve PBS ile 4 x 10 5 hücre / ml hücre süspansiyonu seyreltin. </li><li> Bir slayt, bir filtre kartı ve bir klip ile bir odayı birleştirin ve Sitospin rotor uygun yuvalara yerleştirin. Sitospin monte birimlerin her odasına adım 2.6 hazırlanan her numunenin 250 ul ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1500 rpm&#39;de santrifüj. </li><li> 40 ml buz-soğuğu PBS CSK tamponu her biri buz üzerinde 3 coplin kavanoz doldurun (10mM PIPES pH 6.8; 100 mM NaCI, 300 mM sakaroz, 3 mM MgCl2) ve CSKT tamponu (% 0.5 Triton CSK tampon X-100) idi. </li><li> Sitospin tamamlandıktan sonra hızla buz gibi soğuk PBS içine slayt aktarmak ve 5 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Buz soğukluğunda CSK tampon içine slayt aktarın ve 1 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Buz soğukluğunda CSKT arabelleğe slayt aktarın ve 5 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Buz-soğuk CSK buf geri slayt aktarınfer ve 1 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> PBS içinde% 4 paraformaldehid içinde slayt aktarın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. </li></ol> 3. İmmünofloresan <ol><li> Birkaç saniye (% 0.1 Tween-20 ile 1x PBS), PBST ile coplin kavanoza slaytlar yerleştirin. </li><li> Slayt aşağı akmasına tampon kalan izin eğik slaytlar yerleştirin. Dikkatle slayt kapalı aşırı sıvı silin ve su ile boş bir pipet ucu kutusuna yerleştirin. Yumuşak bir lamel, bloke etme çözeltisi 40 ul (1 x PBS,% 1 BSA,% 0.1 Tween-20) ile slayt Yerleşimi, ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. </li><li> Lamel Bloke etme çözeltisi uzaklaştırılır kaldırmak ve 1 bir konsantrasyona seyreltilmiştir Histon H3K27me3 birincil antikor 40 ul: 500 çözüm engelleme. Geri slayt lamel yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. Not: bloke çözeltisi içinde bir RNaz inhibitör bu RNA FIS RNA&#39;yı korumak için yararlı olabilirPoliklonal antikorlar kullanılmıştır lH protokolüdür. </li><li> Yıkama hafifçe yıkama sırasında sallayarak, 5 dakika her biri için, PBST ile dolu coplin kavanozlarda 2 kez kaydırın. </li><li> Slayt aşağı akmasına tampon kalan izin eğik slaytlar yerleştirin. Dikkatle aşırı sıvı silin ve tekrar ucu kutuya slayt yerleştirin. Ikincil antikor (1: 500) 40 ul Kaplama çözeltisi engelleme seyreltilmiş, bir lamel ve karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edin. Aşağıdaki adımları için, her zaman karanlıkta slayt tutun. </li><li> Adım 3.4 gibi PBST ile kavanoz Coplin 2 kez yıkayın. </li></ol> Oligonükleotid Probları 4. RNA BALIK <ol><li> Adım 4.3 RNA FISH için 37 ° C&#39;de kurumasını önlemek için slaytlar altındaki su ile boş bir pipet ucu kutusu Ön-sıcak. </li><li> Slayt aşağı akmasına tampon kalan izin eğik slaytlar yerleştirin. Dikkatle adım 3,6 slayt kapalı aşırı sıvı silin ve wat ile pipet ucu kutusu içine slayt yerleştirinalt er. Slayt üzerinde FISH yıkama tamponu (2x SSC,% 10 formamid) 500 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir. </li><li> FISH yıkama solüsyonu çıkarın slayt üzerine oligonükleotid prob 8 ul ekleyin, bir kapak kayma yerleştirin ve alt su ile önceden ısıtılmış pipet ucu kutusu slayt aktarmak; 1-2 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> BALIK yıkama tamponu, DAPI FISH yıkama tamponu ve 2 x SSC ile 37 ° C&#39;de bir su banyosu içinde 3 önceden ısıtılmış coplin kavanoz yerleştirin. </li><li> RNA FISH için 1-2 saat inkübasyondan sonra, önceden ısıtılmış BALIK yıkama tamponu içine slayt koydu. </li><li> Lamel slayt düşer kadar birkaç dakika için slayt inkübe. </li><li> Geri yıkama tamponu içine slayt yerleştirin ve 5 dakika inkübasyon devam ediyor. </li><li> 0.5 ng / ml DAPI ile önceden ısıtılmış BALIK yıkama tamponu ile bir coplin kavanoza slayt aktarın ve 5 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Önceden ısıtılmış 2x SSC ile başka coplin kavanoza slayt aktarın ve 5 mil inküben. </li><li> Slayt aşağı akmasına tampon kalan izin eğik slaytlar yerleştirin. Dikkatle aşırı sıvı silin ve kuru bir ucu kutuya geri slayt yerleştirin. Slayt üzerine DAPI ile antifade 4 ul ekleyin ve bir lamel yerleştirin. </li><li> Oje ile lamel Seal ve bir mikroskop altında gözlemlemek. Lam, bir kaç ay boyunca karanlıkta 4 ° C de muhafaza edilebilir. </li></ol>

<ol><li>Payer, B., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+chromosome+dosage+compensation%3A+how+mammals+keep+the+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance.</a> Annu Rev Genet. 42, 733-772 (2008).</li>
<li>Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gracefully+ageing+at+50%2C+X-chromosome+inactivation+becomes+a+paradigm+for+RNA+and+chromatin+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Gracefully ageing at 50, X-chromosome inactivation becomes a paradigm for RNA and chromatin control.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 815-826 (2011).</li>
<li>Gendrel, A. V., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fifty+years+of+X-inactivation+research%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fifty years of X-inactivation research.</a> Development. 138, 5049-5055 (2011).</li>
<li>Froberg, J. E., Yang, L., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+by+RNAs%3A+X-inactivation+as+a+model+for+lncRNA+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Guided by RNAs: X-inactivation as a model for lncRNA function.</a> J Mol Biol. 425, 3698-3706 (2013).</li>
<li>Penny, G. D., Kay, G. F., Sheardown, S. A., Rastan, S., Brockdorff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+Xist+in+X+chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Requirement for Xist in X chromosome inactivation.</a> Nature. 379, 131-137 (1996).</li>
<li>Marahrens, Y., Panning, B., Dausman, J., Strauss, W., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xist-deficient+mice+are+defective+in+dosage+compensation+but+not+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Xist-deficient mice are defective in dosage compensation but not spermatogenesis.</a> Genes Dev. 11, 156-166 (1997).</li>
<li>Clemson, C. M., McNeil, J. A., Willard, H. F., Lawrence, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XIST+RNA+paints+the+inactive+X+chromosome+at+interphase%3A+evidence+for+a+novel+RNA+involved+in+nuclear%2Fchromosome+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">XIST RNA paints the inactive X chromosome at interphase: evidence for a novel RNA involved in nuclear/chromosome structure.</a> J Cell Biol. 132, 259-275 (1996).</li>
<li>Sado, T., Brockdorff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+understanding+chromosome+silencing+by+the+long+non-coding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Xist.+Phil+Trans+R+Soc+B%22%5BJournal%5D)">Advances in understanding chromosome silencing by the long non-coding RNA.</a> Xist. Phil Trans R Soc B. 368, 20110325-20 (2013).</li>
<li>Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+proteins+targeted+by+a+short+repeat+RNA+to+the+mouse+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome.</a> Science. 322, 750-756 (2008).</li>
<li>Plath, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+histone+H3+lysine+27+methylation+in+X+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of histone H3 lysine 27 methylation in X inactivation.</a> Science. 300, 131-135 (2003).</li>
<li>Silva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+histone+h3+methylation+on+the+inactive+X+chromosome+requires+transient+recruitment+of+Eed-Enx1+polycomb+group+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Establishment of histone h3 methylation on the inactive X chromosome requires transient recruitment of Eed-Enx1 polycomb group complexes.</a> Dev Cell. 4, 481-495 (2003).</li>
<li>Gall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+synthesis+of+the+genes+for+ribosomal+RNA+during+amphibian+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Differential synthesis of the genes for ribosomal RNA during amphibian oogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 60, 553-560 (1968).</li>
<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280, 585-590 (1998).</li>
<li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat Methods. 5, 877-879 (2008).</li>
<li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+immunofluorescence%2C+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization%2C+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes%2C+transcriptional+activity%2C+nuclear+organization%2C+and+X-chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).</li>
<li>Katayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+transcription+in+the+mammalian+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Antisense transcription in the mammalian transcriptome.</a> Science. 309, 1564-1566 (2005).</li>
<li>Ogawa, Y., Xite Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-inactivation+intergenic+transcription+elements+that+regulate+the+probability+of+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">X-inactivation intergenic transcription elements that regulate the probability of choice.</a> Mol Cell. 11, 731-743 (2003).</li>
<li>Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+inactivation+in+mouse+ES+cells%3A+histone+modifications+and+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">X inactivation in mouse ES cells: histone modifications and FISH.</a> Methods Enzymol. 376, 419-428 (2004).</li>
<li>Khalil, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+associate+with+chromatin-modifying+complexes+and+affect+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11667-11672 (2009).</li>
<li>Martin, G. R., Evans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+clonal+lines+of+teratocarcinoma+cells%3A+formation+of+embryoid+bodies+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1441-1445 (1975).</li>
<li>Lee, J. T., Lu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+of+Tsix+leads+to+nonrandom+X+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis of Tsix leads to nonrandom X inactivation.</a> Cell. 99, 47-57 (1999).</li>
<li>Zhang, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeric+RNAs+mark+sex+chromosomes+in+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells.</a> Genetics. 182, 685-698 (2009).</li>
<li>Raj, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+individual+endogenous+RNA+transcripts+in+situ+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes.</a> Methods Enzymol. 472, 365-386 (2010).</li>
<li>Kimura, H., Hayashi-Takanaka, Y., Goto, Y., Takizawa, N., Nozaki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organization+of+histone+H3+modifications+as+revealed+by+a+panel+of+specific+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">The organization of histone H3 modifications as revealed by a panel of specific monoclonal antibodies.</a> Cell Struct Funct. 33, 61-73 (2008).</li>
<li>Ogawa, Y., Sun, B. K., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersection+of+the+RNA+interference+and+X-inactivation+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intersection of the RNA interference and X-inactivation pathways.</a> Science. 320, 1336-1341 (2008).</li>
<li>Kohlmaier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromosomal+memory+triggered+by+Xist+regulates+histone+methylation+in+X+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A chromosomal memory triggered by Xist regulates histone methylation in X inactivation.</a> PLoS Biol. 2, 171(2004).</li>
<li>Wang, K. C., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Mol Cell. 43, 904-914 (2011).</li>
</ol>

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

Bu yazıda, H3K27me3 için slayt hazırlama, Xist RNA FISH ve immünoflüoresans tamamlamak için en az 5 saat sürer hızlı bir bağışıklık BALIK protokolü sundu. Genellikle RNA FISH gecede inkübasyon ihtiyacı Xist RNA saptanması, genel bağışıklık FISH yaklaşımı ile karşılaştırıldığında, bu protokol önemli ölçüde harcanan zamanı azaltır, aynı zamanda oligonükleotid probları kullanılarak bağışıklık FISH duyarlılığını artırır sadece. Xist yüksek X-kromozomu inaktivasyonu sırasında transkripsiyonu ve y...

Memeli X-kromozomu inaktivasyonu (XCI) kadınlarda iki X-kromozomu biri transkripsiyonel 1 inaktive burada XX ve XY arasındaki X-bağlantılı gen doz dengesizliği telafi etmek için bir stratejidir. X-kromozomu inaktivasyonu uzun olmayan kodlama RNA (lncRNA) araştırma için harika bir model sistemidir. X-kromozomu inaktivasyonu birden lncRNAs tarafından düzenlenir ve yoğun lncRNAs, transkripsiyon, kromatin yapısı ve nükleer organizasyonu 2, 3 arasındaki karışma mekanizmaları ortaya çıkarmak için son birkaç yılda çalışılmıştır. X kromozomunda bulunan X inaktivasyon merkezi (XIC) kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar 4 üreten genlerin bir dizi içeren bir kompleks genetik lokus olduğu. X-aktif spesifik transkript (Xist) lncRNA eutherian memelilerde X kromozomu inaktivasyonu 5,6 çok önemli bir rol oynar böyle bir lncRNA olup. Xist transkript fu yerini çevreleyenTure Xi X-kromozomu inaktivasyonu başlatmak ve RNA FISH kullanılarak görüntülendi zaman bir bulut gibi görünmesini; Bu oluşum &quot;Xist Cloud&quot; 7 olarak adlandırılır. Xist RNA, çeşitli kromatin değiştirici enzimler ile etkileşim için, sessiz bir kromatin ve baskı transkripsiyon için farklı epigenetik değişiklikler ile Xist bulutlar eş-lokalizasyonu X kromozomu inaktivasyonu 8 süresince gözlenir. Örneğin, Xist RNA H3K27me3 sorumludur ve baskıcı bir kromatin devlet 9 uyaran Polycomb baskıcı kompleksi 2 (PRC2) ile etkileşime girer. Xi ve yoğun H3K27me3 modifikasyonu ile birlikte yerelleştirme Xist bulut oluşumu Xi 10,11 bir fakültatif heterokromatinin manzara temsil eder. Böyle DNA / RNA FISH gibi sitogenetik teknikler, gelişmiş hassasiyet ile son ve gelişmiş teknikler, radyoaktif işaretli problar 12 kullanılarak geleneksel yöntemle uzun bir yol katettikBirden fazla oligonükleotid sondaları 13,14 kullanılarak flüoresan görüntüleme. Immünofloresan ile birleştiğinde DNA / RNA BALIK rutin Spatiotemporal nükleer organizasyonu, RNA lokalizasyonu, kromatin yapısını ve değişiklikleri anlamak için bir sitolojik araç olarak kullanılmıştır. RNA, FISH için pek çok standart prob hazırlama plazmid ya da bakteriyel yapay kromozom (BAC) klonu ve çentik translasyonu veya rastgele prime 15 ya da daha sonraki etiketi kullanılmasını içerir. Bununla birlikte, farelerde genlerin yaklaşık% 70 ve insanlarda genlerin% 40 sens ve antisens transkriptleri ayırmak için bu nedenle bir büküm özel FISH yöntem gerektiren, sens ve antisens transkriptleri 16 bir üst üste göstermektedir. İn vitro transkribe RNA sondaları (riboprob ) genellikle iplik-spesifik RNA FISH 17,18 için kullanılır; bununla birlikte, bu, T7, SP6 veya T3 promoteri ve sentezlenmesi riboprobes bir plazmid klonu ya da PCR ürün hazırlama içerir. Ayrıca, genomunun elde riboproblarıic DNA veya cDNA sık sık yüksek arka plan gürültüsü neden non-spesifik bölgeleri ve tekrarlayan unsurlar içerir. Diğer konu da, uzunluğu bir kaç yüz nükleotidlerdir ve birden florofor içeren riboprobları, etkili bir çekirdek içine girmek edemezler. Bu aşmak için, ucunda tek bir florofor ile işaretlenmiş çok sayıda daha kısa oligonükleotid probları iyi hassasiyet, düzgün sinyal kuvveti ve saflaştırma kolaylığı ve 14 taşıma olduğu geliştirilmiştir. Buna ek olarak, DNA oligonükleotidleri, genel olarak RNA daha stabildir. Bu X kromozomu etkisizleştirme işlemi sırasında Xist lncRNA neden Xi epigenetik dinamiklerini anlamak için immünofloresan ile Xist RNA, FISH 19 oligonükleotidleri kullanılarak benzer bir strateji uygulanır. Bu protokol, oligonükleotid prob ve hücrelerin uygun hazırlama oluşturma, hem de bağışıklık ve RNA FISH kullanımını tarif etmektedir. Birden oligonucle kullanarak Xist RNA BALIKXist RNA BALIK kişinin laboratuvarında rutin olarak ise, SEK, uzun vadede maliyet etkin bir yaklaşımdır. Bu teknik aynı zamanda epigenetik değişiklikler ya da faktörleri ile birlikte-lokalizasyonunu haritalama ise hücrelerinde lncRNAs tanımlamak için kullanılabilir. Protokolün bir büyük avantajı kolayca kişinin araştırma çıkarlarına uygun şekilde değiştirmek için yeteneğidir.

<table><tbody><tr><td>5'-amino modifikasyonlu oligonükleotidler</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Reaktif Boya</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A32750</td><td></td></tr><tr><td>MicroSpin G-25 sütunları</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 2</td><td>Shandon</td><td>59900102</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini, Moleküler Biyoloji Sınıfı (hibridizasyon tamponu için)</td> <td>Roche</td><td></td><td></td>10715859103</tr><tr><td>Histon H3K27me3 antikoru</td><td>Aktif Motif</td><td>61017</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Keçi Anti-Fare, yüksek oranda çapraz adsorbe edilmiş</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Altın antifade reaktifi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>P36931</td><td></td></tr></tbody></table>

hızlı floresan in situ hibridizasyon protokolü

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

Immünfloresans (immün-FISH) ile in situ hibridizasyon (FISH) RNA floresan proteinleri birleştiren, epigenetik değişiklikler ve diğer detaylar lokalizasyonu içine eşzamanlı bir bakış açısı ile RNA lokalizasyonu mekansal dinamiklerini tespit etmek için tek hücre düzeyinde istihdam edilebilir bir teknik oluşturur hangi immünofloresan vurgulanmış olabilir. X-kromozomu inaktivasyonu uzun olmayan kodlama RNA (lncRNA) aracılı gen susturulması için bir paradigma olduğunu. Memeli kadınlarda iki X-kromozom birinde (bir Xist bulut denir) X-inaktif özel transkript (Xist) lncRNA birikimi X-kromozomu inaktivasyonu başlatmak için kritik bir adımdır. Xist RNA doğrudan veya dolaylı olarak çeşitli kromatin-modifiye enzimler ile etkileşim ve inaktif X-kromozomu (Xi) için ayrı epigenetik manzara tanıttı. Xi biri bilinen epigenetik damgasını Histone H3 trimetil-lizin 27 (H3K27me3) değişiklik. Burada, biz basit ve hızlı bir immün FISH tarifXist RNA lokalizasyonu ve ilişkili epigenetik değişiklikleri incelemek için H3K27me3 immünofloransı ile birleştiğinde birden oligonükleotid probları ile RNA FISH kullanarak Xist RNA tespiti için protokol. Oligonükleotid probları daha kısa bir kuluçkalama süresi sonuçları in vitro ötelenmiş RNA probları (riboprobları) göre Xist RNA daha hassas algılama kullanılması. Bu protokol lncRNAs dinamiklerini ve ilgili epigenetik değişiklik, kromatin yapısı, nükleer organizasyon ve transkripsiyon düzenleme anlamak için güçlü bir araç sağlar.

Pratik immüno-FISH temsili görüntüleri Şekil 1A'da gösterilmiştir. Xi Xist RNA bulut ve H3K27me3 sinyalinin Eş-lokalizasyonu kadın hücrelerin ayırt saptandı. Farklılaşması üzerine 12. günde EB hücrelerinin% 90'dan daha fazla bir Xist bulut (Şekil 1B) vardı. (; 150% 97, n = Şekil 1C) Kısa oligonükleotid probları etkin bir şekilde neredeyse tüm H3K27me3 sinyalleri Xist RNA ile birlikte lokalize bir görselleştirme yol, çekirdeklerin içine nüfuz. <p class="jove_content"...

İmmünofloresan ile birlikte kolayca özelleştirilebilen bir ipliğe özgü floresan in situ hibridizasyon (FISH) protokolü geliştirdik. Bu, tek hücre düzeyinde kromatin yapısı, nükleer organizasyon ve transkripsiyonel düzenleme hakkında eşzamanlı bilgi ile RNA dinamiklerinin ayrıntılı bir şekilde incelenmesine olanak tanır.

Hızlı Floresan In Situ Hibridizasyon Protokolü

Combining RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) with immunofluorescence (immuno-FISH) creates a technique that can be employed at the single cell ...

Bu prosedürün genel amacı, immünofloresan ile birlikte hızlı bir floresan in situ hibridizasyon kullanarak X kromozomu inaktivasyonu sırasında uzun kodlamayan varlık, RNA ve bununla ilişkili epigenetik modifikasyonun dinamiklerini araştırmaktır. Bu protokol, nüfuz eden ve daha sonra boyama için sabitlenen farklılaşan embriyo vücut hücreleri ile slaytların sitozin hazırlanmasını gerektirir. Daha sonra, histon H'ye karşı bir antikor tarafından lokalize edilen floresan markör, üç trimetil lizin 27, aktif olmayan X kromozomu üzerinde birikir.Son adım, beş asal amino modifikasyonu içeren ve var olmak için bir ortalama reaktif florofor ile etiketlenmiş oligonükleotid problarını kullanır. RNA balığı. Sonuç olarak, floresan mikroskobu, E Es hücrelerinin farklılaşması sırasında mevcut RNA bulutunun lokalizasyonunu ve histon modifikasyonunu göstermek için kullanılır.Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, tek bir floro dörtlü ile etiketlenmiş birden fazla benzersiz oligonükleotid kullanmamızdır. Bu bize arka planı azaltan trans spesifik algılama sağlar ve bu aynı zamanda çekirdeğe penetrasyonu artırır ve sinyallerin yoğunluğunu artırır veya geliştirir. Ek olarak, probların konsantrasyonunu arttırdığımızda, bu immüno-balık deneyini tamamlamak için gereken süreyi önemli ölçüde azaltabiliriz.Bu yöntem, aktif olmayan eski kromozom üzerindeki mevcut RA'nın lokalizasyonu ve bununla ilişkili kromo modifikasyonu hakkında fikir verebilir. RA'ların tespiti için diğer biyolojik sistemlere de uygulanabilir ve bununla ilişkili epigenetik modifikasyon, nükleer lokalizasyon ve nesiller arası düzenleme. Önce probları hazırlamak için, erime sıcaklığı 63 ila 65 santigrat derece olan ve mevcut bir RNA'ya benzersiz bir antisens dizisi ve beş asal amino modifikasyonu içeren birden fazla 20 ila 30 nükleotid uzunluk oligosu elde edin.Bu oligoları, toplam 4.5 mikrogram DNA için çeşitli oligoların eş molar miktarlarında saf su havuzunda süspanse edin. Ardından, üreticinin talimatlarını izleyerek, oligoların etiketlenmesini takiben oligoları ortalama reaktif bir floresan boya ile etiketleyin. Bunları bir G 25 sütunundan geçirin.Daha sonra etanol ve sodyum asetat kullanarak oligoları çökeltin. Bu, dört santigrat derecede 21.000 G'lik bir dönüşten önce eksi 80 santigrat derecede yarım saatlik bir süre gerektirir. Ardından, yıkamadan sonra peleti bir kez %70 etanol ile yıkayın.Resus, oligoları 50 mikrolitre nükleaz içermeyen su veya tris EDTA içinde 10 mikromolar DNA'nın nihai konsantrasyonuna kadar süspanse eder. Bu, prob stoğu çözeltisinin probu kullanmasını sağlar, hibridizasyon tamponunda 250 nano molar'a yeniden konsantre eder. Başlamak için, altı kuyucuklu tabakta büyüyen ES veya EB farklılaşan hücrelere sahip olun, kültür ortamını kuyucuklardan aspire edin ve ardından hücreleri oda sıcaklığında yıkayın.PBS, PBS'yi iyice aspire eder. Daha sonra, her bir oyuğa 0,5 mililitre tripsin çözeltisi ekleyin ve plakayı beş ila 10 dakika inkübe edin. Her bir oyuğa beş mililitre ortam ekleyerek ve bunları nazikçe pipetleyerek tripsin reaksiyonunu durdurun.Daha sonra hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Şimdi hücreleri oda sıcaklığında 200 Gs'de beş dakika boyunca döndürün, tüm süpernatanı çıkarın ve hücre paletini iki mililitre PBS'de yeniden askıya alın. Daha sonra hücreleri sayın ve süspansiyonu PBS'de mililitre başına 400.000 hücreye seyreltin.Şimdi, her slaydı bir filtre kartı, bir hazne ve bir klips ile birleştirin. Gerektiği kadar yapın ve bunları bir cyto spininin rotoruna yerleştirin. Her slayta 250 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin ve slaytları oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1500 RPM'de döndürün.Sonra perme yapın ve düzeltin. İlk olarak, slaytları durulama adımı olarak beş dakika boyunca hızlı bir şekilde buz gibi soğuk PBS'ye aktarın. İkinci olarak, slaytları şişirmek için bir dakika boyunca buz gibi soğuk CSK tamponuna aktarın, üçüncüsü, hücrelere nüfuz etmek için slaytları beş dakika boyunca CSKT tamponuna taşıyın.Dördüncüsü, hücreleri bir dakika boyunca buz gibi soğuk CSK tamponunda yıkayın. Ve son olarak, bunları 10 dakika boyunca PBS'de% 4 paraform aldehit oda sıcaklığında sabitleyin. İlk olarak, slaytları PFA çözeltisinden çıkarın.Daha sonra bunları birkaç saniye PBST'li bir ortak plan kavanozuna aktarın, ardından boşaltmaları için eğimli bir konuma getirin. Ardından, uç tutucu yuvasının altına su dolu boş bir pipet ucu kutusu yükleyin. Daha sonra slaytların arka taraflarını silin ve bu kutuya aktarın.Şimdi her slaytı 40 mikrolitre engelleme solüsyonu ile kaplayın ve slaytları kapak fişleri ile nazikçe kapatın. Bankta 10 dakika kutuda kuluçkaya yatmalarına izin verin. Ardından kapak fişlerini çıkarın ve slaytları bir eğim üzerine yerleştirin.Şimdi 40 mikrolitre birincil antikor çözeltisi ekleyin. Kapak fişlerini değiştirin ve slaytları yarım saat sonra 30 dakika tezgahta inkübe bırakın. Slaytları koplan kavanozlarında PBST'de iki kez yıkayarak bağlanmamış antikorları çıkarın.Hafifçe çalkalayın ve her yıkamanın beş dakika sürmesine izin verin. Ardından slaytları eğimli bir konuma getirin ve PBST'nin boşalmasına izin verin. Slaytın arka taraflarındaki fazla solüsyonu silerek ve ardından slaytları kutuya geri koyarak devam edin.Şimdi her slayta 40 mikrolitre bir ila 500 ikincil antikor çözeltisi uygulayın. Slaytları kapak fişleri ile örtün ve ileriye doğru ışıktan koruyarak 15 dakika bankta kuluçkaya yatırın. Kaydıraklar her zaman ışıktan korunmalıdır.Daha önce olduğu gibi PBST kullanarak antikorları çıkarın ve ardından slaytları boşaltmak için eğimli bir yere ayarlayın. İmmünofloresan yaparken, su içeren bir kutuyu 37 santigrat dereceye ısıtın. Yıkama tamponunu sürgü arkalarından sildikten sonra, bunları sıcaklıkta su içeren bir pipet ucu kutusuna koyun ve her slayta 500 mikrolitre balık yıkama tamponu uygulayın.Beş dakika kuluçkaya yatmalarına izin verin. Beş dakika sonra, oda sıcaklığında çalışma probunun sekiz mikrolitresinde her bir slaytın yanındaki slaytlardan çözeltiyi aspire edin ve bir kapak fişi uygulayın. Şimdi slaytları ön ısıtma slayt kutusuna aktarın ve 37 santigrat derecede bir ila iki saat inkübe edin.Kuluçkadan sonra, slaytları balık yıkama tamponunda 37 santigrat derecede bir coplan kavanozunda yıkayın. Kapak fişleri düştüğünde, ki bu genellikle birkaç dakika sürer, kapak fişlerini çıkarın ve slaytların beş dakika inkübe kalmasına izin verin. Daha sonra slaytları, yine 37 santigrat derecede, mililitre başına 0,5 nanogram nemli leke içeren balık yıkama tamponu içeren bir kavanoza aktarın.Slaytların bu çözeltide beş dakika inkübe etmesine izin verin. Şimdi slaydı iki XSSC'de beş dakika 37 santigrat derecede yıkayın. Bitirmek için, slaytları iki XSSC'den fazla eğimli bir tahliye üzerine ayarlayın.Bunları silin ve dpi içeren dört mikrolitre Antifa solüsyonu ile monte edin. Mevcut RNA'nın lokalizasyonunu ve histon modifikasyonunu gözlemlemek için hızlı immün balık kullanıldı. Dişi EB hücrelerinin ayırt edilmesinde, RNA, inaktive edilmiş bir X kromozomunun tüm uzunluğunu kaplayan yeşil bir bulut gibi görünür Bu hücrelerde, histon H üç trimetil lizin 27 modifikasyonu kırmızı renkte görüntülenir ve çekirdekler mavi renkte DPI ile karşı boyanır.Farklılaşan dişi fare EB hücreleri, farklılaşmanın 12. gününde işlendi. Şu anda, hücrelerin %90'ından fazlası hücrelerde mevcut bir bulut gösterdi Çekirdekler kısa oligonükleotid probları verimli bir şekilde nüfuz edebildi ve bu da neredeyse tüm histon H'nin üç trimetil lizin 27 sinyalinin boyanmasına neden oldu 150 çekirdekte mevcut RNA bulutları ile, mevcut RNA sinyallerinin %97'sinin bu metillenmiş histonlarla birlikte lokalize olduğu bulundu. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, hafif hazırlık hazırlığını tamamlamak için beş saatten daha kısa sürede yapılabilir.Onun için immünoimmün floresan 27'de üç trimesterdir ve RA mevcuttur. Düzgün bir şekilde gerçekleştirirsek, bu immünobalık protokolü diğer RNA epigenetik modifikasyonlarına ve ilgilenilen proteinlere uygulanabilir. Bu protokolü farklı bir biyolojik sisteme uygulamak için bazı optimizasyonlara ihtiyacınız olabilir. Deneylerinizde iyi şanslar.

quick-fluorescent-situ-hybridization-protocol-for-xist-rna-combined

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

In situ hibridizasyon Tüm montaj, gelişim biyolojisi en yaygın olarak kullanılan teknikleri biridir. Burada, tek bir genin kesin ifadelerde desen analiz ve iki genin ifadesi etki çakışma belirlenmesi için çift floresan in situ hibridizasyon protokol yüksek çözünürlüklü sunuyoruz. Biz bir doku organizasyon vurgulamak için propidium iyodür nükleer karşı leke içerir.

Zebra balığı Tüm Dağı Yüksek Çözünürlüklü Çift Floresan Yerinde Hibridizasyon

Kromozom replikasyonu zamanlama analizi için nicel bir yöntem tarif edilmektedir. Yöntem floresan ile kombinasyon halinde BrdU eklenmesi...

Floresan ile birlikte Kromozom çoğaltılıyor Zamanlama<em&gt; Yerinde</em&gt; Hibridizasyon

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

In situ hibridizasyon (FISH) floresan hücre içinde kendi doğal ortamında nükleik asitlerin saptanmasını sağlar. Burada fare embriyonik kök hücreleri X kromozomu inaktivasyon incelemek için kullanılabilir FISH vasıtasıyla RNA ve DNA birleşik, eş zamanlı olarak saptanması için bir protokol açıklar.

Kombine DNA-RNA Floresan<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH) Farklılaştırılmış Kadın Fare Embriyonik Kök Hücreleri X kromozomu inaktivasyonu Eğitim için

Burada, slayta monte kromozomlar üzerinde tekrarlayan heterokromatik dizileri görselleştirmek için floresan DNA in situ hibridizasyon (DNA ISH) gerçekleştirmek için basit bir yöntem sunuyoruz. Yöntem minimal reaktifler gerektirir ve kısa veya uzun problarla, farklı dokularla kullanım ve floresan veya floresan bazlı olmayan sinyallerle algılama için çok yönlüdür.

Floresan DNA için Basit Bir Yöntem<em&gt; In Situ</em&gt; Ezilmiş Kromozomlar için Hibridizasyon

Gen ekspresyonunu spesifik hücre tiplerine lokalize etmek, spesifik antikorların eksikliği nedeniyle zor olabilir. Burada, çift floresan RNA'nın yerinde hibridizasyonunun immün boyama ile birleştirilmesiyle gen ekspresyonunun eşzamanlı üçlü tespiti için bir protokol açıklıyoruz.

Çift Floresan birleştiren<em&gt; In Situ</em&gt; Fare Beyin Bölüm Üç Genlerin İfade tespiti için immünoişaretleme ile Hibridizasyon

Açıklanan RNA in situ hibridizasyon Protokolü RNA algılama bütün Drosophila embriyo veya disseke doku sağlar. 96-de microtiter plakaları ve tyramide sinyal Güçlendirme kullanma, yüksek kararlılık, duyarlılık ve işlem hacmi ve nispeten düşük bir maliyetle transkript tespit edilebilir.

Yüksek çözünürlüklü Floresan Situ hibridizasyon Drosophila embriyo ve Tyramide sinyal güçlendirme kullanarak doku

Floresan kalsiyum görüntülemeile in situ hibridizasyonunu birleştiren ve deneycinin kalsiyum aktivitesi modellerini tek hücreli düzeyde gen ekspresyonu profilleriyle ilişkilendirmesine olanak tanıyan iki parçalı bir protokol salıyoruz.

Xenopus laevis'te Nöronal Öncül Karakterizasyonu için Floresan Kalsiyum Görüntüleme ve Daha Sonra Yerinde Hibridizasyon

Bu makalede, X kromozomal anomalileri olan kadınlardan aşılanmamış ve aşılanmış over korteks dokusundaki over hücrelerinin X kromozomal içeriğini belirlemek için floresan in situ hibridizasyona dayalı iki yöntem sunulmaktadır.

Floresan In Situ Hibridizasyon Kullanarak Yumurtalık Hücrelerinde X Kromozomal Anormalliklerinin Araştırılması

Bu video in situ hibridizasyon, 2 farklı genler mekansal ve zamansal ifade desen genç civciv embriyolarında görüntülenebilmekte hangi bir yöntem 2-renk tüm montaj göstermektedir. Bu yöntem başlangıçta David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham ve David Ish-Horowicz tarafından tanıtıldı.

Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

Öğrenin hızlı floresan in situ hibridizasyon ve immünofloresan yöntemini, X kromozomu inaktivasyonu sırasında uzun kodlamayan RNA dinamiklerini ve epigenetik modifikasyonları incelemek için. Bu teknik tek hücre düzeyinde RNA ve kromatin yapısının görselleştirilmesini sağlar.

Hızlı Floresan In Situ Hibridizasyon Protokolü

Daha fazla video keşfet