Hızlı Floresan In Situ Hibridizasyon Protokolü

Bu prosedürün genel amacı, immünofloresan ile birlikte hızlı bir floresan in situ hibridizasyon kullanarak X kromozomu inaktivasyonu sırasında uzun kodlamayan varlık, RNA ve bununla ilişkili epigenetik modifikasyonun dinamiklerini araştırmaktır. Bu protokol, nüfuz eden ve daha sonra boyama için sabitlenen farklılaşan embriyo vücut hücreleri ile slaytların sitozin hazırlanmasını gerektirir. Daha sonra, histon H'ye karşı bir antikor tarafından lokalize edilen floresan markör, üç trimetil lizin 27, aktif olmayan X kromozomu üzerinde birikir.

Son adım, beş asal amino modifikasyonu içeren ve var olmak için bir ortalama reaktif florofor ile etiketlenmiş oligonükleotid problarını kullanır. RNA balığı. Sonuç olarak, floresan mikroskobu, E Es hücrelerinin farklılaşması sırasında mevcut RNA bulutunun lokalizasyonunu ve histon modifikasyonunu göstermek için kullanılır.

Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, tek bir floro dörtlü ile etiketlenmiş birden fazla benzersiz oligonükleotid kullanmamızdır. Bu bize arka planı azaltan trans spesifik algılama sağlar ve bu aynı zamanda çekirdeğe penetrasyonu artırır ve sinyallerin yoğunluğunu artırır veya geliştirir. Ek olarak, probların konsantrasyonunu arttırdığımızda, bu immüno-balık deneyini tamamlamak için gereken süreyi önemli ölçüde azaltabiliriz.

Bu yöntem, aktif olmayan eski kromozom üzerindeki mevcut RA'nın lokalizasyonu ve bununla ilişkili kromo modifikasyonu hakkında fikir verebilir. RA'ların tespiti için diğer biyolojik sistemlere de uygulanabilir ve bununla ilişkili epigenetik modifikasyon, nükleer lokalizasyon ve nesiller arası düzenleme. Önce probları hazırlamak için, erime sıcaklığı 63 ila 65 santigrat derece olan ve mevcut bir RNA'ya benzersiz bir antisens dizisi ve beş asal amino modifikasyonu içeren birden fazla 20 ila 30 nükleotid uzunluk oligosu elde edin.

Bu oligoları, toplam 4.5 mikrogram DNA için çeşitli oligoların eş molar miktarlarında saf su havuzunda süspanse edin. Ardından, üreticinin talimatlarını izleyerek, oligoların etiketlenmesini takiben oligoları ortalama reaktif bir floresan boya ile etiketleyin. Bunları bir G 25 sütunundan geçirin.

Daha sonra etanol ve sodyum asetat kullanarak oligoları çökeltin. Bu, dört santigrat derecede 21.000 G'lik bir dönüşten önce eksi 80 santigrat derecede yarım saatlik bir süre gerektirir. Ardından, yıkamadan sonra peleti bir kez %70 etanol ile yıkayın.

Resus, oligoları 50 mikrolitre nükleaz içermeyen su veya tris EDTA içinde 10 mikromolar DNA'nın nihai konsantrasyonuna kadar süspanse eder. Bu, prob stoğu çözeltisinin probu kullanmasını sağlar, hibridizasyon tamponunda 250 nano molar'a yeniden konsantre eder. Başlamak için, altı kuyucuklu tabakta büyüyen ES veya EB farklılaşan hücrelere sahip olun, kültür ortamını kuyucuklardan aspire edin ve ardından hücreleri oda sıcaklığında yıkayın.

PBS, PBS'yi iyice aspire eder. Daha sonra, her bir oyuğa 0,5 mililitre tripsin çözeltisi ekleyin ve plakayı beş ila 10 dakika inkübe edin. Her bir oyuğa beş mililitre ortam ekleyerek ve bunları nazikçe pipetleyerek tripsin reaksiyonunu durdurun.

Daha sonra hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Şimdi hücreleri oda sıcaklığında 200 Gs'de beş dakika boyunca döndürün, tüm süpernatanı çıkarın ve hücre paletini iki mililitre PBS'de yeniden askıya alın. Daha sonra hücreleri sayın ve süspansiyonu PBS'de mililitre başına 400.000 hücreye seyreltin.

Şimdi, her slaydı bir filtre kartı, bir hazne ve bir klips ile birleştirin. Gerektiği kadar yapın ve bunları bir cyto spininin rotoruna yerleştirin. Her slayta 250 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin ve slaytları oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1500 RPM'de döndürün.

Sonra perme yapın ve düzeltin. İlk olarak, slaytları durulama adımı olarak beş dakika boyunca hızlı bir şekilde buz gibi soğuk PBS'ye aktarın. İkinci olarak, slaytları şişirmek için bir dakika boyunca buz gibi soğuk CSK tamponuna aktarın, üçüncüsü, hücrelere nüfuz etmek için slaytları beş dakika boyunca CSKT tamponuna taşıyın.

Dördüncüsü, hücreleri bir dakika boyunca buz gibi soğuk CSK tamponunda yıkayın. Ve son olarak, bunları 10 dakika boyunca PBS'de% 4 paraform aldehit oda sıcaklığında sabitleyin. İlk olarak, slaytları PFA çözeltisinden çıkarın.

Daha sonra bunları birkaç saniye PBST'li bir ortak plan kavanozuna aktarın, ardından boşaltmaları için eğimli bir konuma getirin. Ardından, uç tutucu yuvasının altına su dolu boş bir pipet ucu kutusu yükleyin. Daha sonra slaytların arka taraflarını silin ve bu kutuya aktarın.

Şimdi her slaytı 40 mikrolitre engelleme solüsyonu ile kaplayın ve slaytları kapak fişleri ile nazikçe kapatın. Bankta 10 dakika kutuda kuluçkaya yatmalarına izin verin. Ardından kapak fişlerini çıkarın ve slaytları bir eğim üzerine yerleştirin.

Şimdi 40 mikrolitre birincil antikor çözeltisi ekleyin. Kapak fişlerini değiştirin ve slaytları yarım saat sonra 30 dakika tezgahta inkübe bırakın. Slaytları koplan kavanozlarında PBST'de iki kez yıkayarak bağlanmamış antikorları çıkarın.

Hafifçe çalkalayın ve her yıkamanın beş dakika sürmesine izin verin. Ardından slaytları eğimli bir konuma getirin ve PBST'nin boşalmasına izin verin. Slaytın arka taraflarındaki fazla solüsyonu silerek ve ardından slaytları kutuya geri koyarak devam edin.

Şimdi her slayta 40 mikrolitre bir ila 500 ikincil antikor çözeltisi uygulayın. Slaytları kapak fişleri ile örtün ve ileriye doğru ışıktan koruyarak 15 dakika bankta kuluçkaya yatırın. Kaydıraklar her zaman ışıktan korunmalıdır.

Daha önce olduğu gibi PBST kullanarak antikorları çıkarın ve ardından slaytları boşaltmak için eğimli bir yere ayarlayın. İmmünofloresan yaparken, su içeren bir kutuyu 37 santigrat dereceye ısıtın. Yıkama tamponunu sürgü arkalarından sildikten sonra, bunları sıcaklıkta su içeren bir pipet ucu kutusuna koyun ve her slayta 500 mikrolitre balık yıkama tamponu uygulayın.

Beş dakika kuluçkaya yatmalarına izin verin. Beş dakika sonra, oda sıcaklığında çalışma probunun sekiz mikrolitresinde her bir slaytın yanındaki slaytlardan çözeltiyi aspire edin ve bir kapak fişi uygulayın. Şimdi slaytları ön ısıtma slayt kutusuna aktarın ve 37 santigrat derecede bir ila iki saat inkübe edin.

Kuluçkadan sonra, slaytları balık yıkama tamponunda 37 santigrat derecede bir coplan kavanozunda yıkayın. Kapak fişleri düştüğünde, ki bu genellikle birkaç dakika sürer, kapak fişlerini çıkarın ve slaytların beş dakika inkübe kalmasına izin verin. Daha sonra slaytları, yine 37 santigrat derecede, mililitre başına 0,5 nanogram nemli leke içeren balık yıkama tamponu içeren bir kavanoza aktarın.

Slaytların bu çözeltide beş dakika inkübe etmesine izin verin. Şimdi slaydı iki XSSC'de beş dakika 37 santigrat derecede yıkayın. Bitirmek için, slaytları iki XSSC'den fazla eğimli bir tahliye üzerine ayarlayın.

Bunları silin ve dpi içeren dört mikrolitre Antifa solüsyonu ile monte edin. Mevcut RNA'nın lokalizasyonunu ve histon modifikasyonunu gözlemlemek için hızlı immün balık kullanıldı. Dişi EB hücrelerinin ayırt edilmesinde, RNA, inaktive edilmiş bir X kromozomunun tüm uzunluğunu kaplayan yeşil bir bulut gibi görünür Bu hücrelerde, histon H üç trimetil lizin 27 modifikasyonu kırmızı renkte görüntülenir ve çekirdekler mavi renkte DPI ile karşı boyanır.

Farklılaşan dişi fare EB hücreleri, farklılaşmanın 12. gününde işlendi. Şu anda, hücrelerin %90'ından fazlası hücrelerde mevcut bir bulut gösterdi Çekirdekler kısa oligonükleotid probları verimli bir şekilde nüfuz edebildi ve bu da neredeyse tüm histon H'nin üç trimetil lizin 27 sinyalinin boyanmasına neden oldu 150 çekirdekte mevcut RNA bulutları ile, mevcut RNA sinyallerinin %97'sinin bu metillenmiş histonlarla birlikte lokalize olduğu bulundu. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, hafif hazırlık hazırlığını tamamlamak için beş saatten daha kısa sürede yapılabilir.

Onun için immünoimmün floresan 27'de üç trimesterdir ve RA mevcuttur. Düzgün bir şekilde gerçekleştirirsek, bu immünobalık protokolü diğer RNA epigenetik modifikasyonlarına ve ilgilenilen proteinlere uygulanabilir. Bu protokolü farklı bir biyolojik sisteme uygulamak için bazı optimizasyonlara ihtiyacınız olabilir. Deneylerinizde iyi şanslar.