Name: Mika hazırlanması Yüksek Çözünürlüklü Optik Mikroskopi Görüntüleme için lipit tabakalarının Desteklenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Keşfedin mika destekli lipid çift katmanlarını yüksek çözünürlüklü optik mikroskopi için hazırlama yöntemini. Bu teknik tek molekül izleme çalışmalarına olanak tanır ve sadece 30 mikrolitre lipid vezikülü kullanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar herhangi bildirimleri var.

1.. Mica ve Slaytlar Hazırlık <ol><li> Sıra No: 1 ½ (0.17 mm) boyama rafa lamelleri. </li><li> 60 ° C&#39;de% 2 deterjan içinde 30 dakika boyunca sonikasyon </li><li> Iyonu giderilmiş su ile 20 kez yıkanır. </li><li> Forseps kullanarak slaytları çıkarın ve sıkıştırılmış hava veya nitrojen kullanarak kuru darbe. </li><li> Mika levha makas veya jilet kullanarak 10 x 10 mm kare parçalar halinde kesilir. </li><li> Jilet kullanarak 2-3 ince broşürler halinde her mika parça kesin. NOT: Bu adım keskin bıçak kullanımını gerektirir. </li></ol> 2.. Mika Montaj ve Montaj Odası <ol><li> Etanol ile temizleyin mikroskobik cam slayt. </li><li> Optik yapıştırıcı kullanılarak cam slayt adım 1.6 kesilmiş mika Tutkal broşür. Düşük viskoziteli yapıştırıcı iyi damla yaymak ve mika tutkal tavsiye edilir. </li><li> , UV lamba altında 10 dk Cure. Not: Yapışkan 380nm 350 aralığında maksimum emme ve requ önerilen enerji ile UV ışığı ile sertleştirilirTam tedavi için ired 4,5 J / cm 2 &#39;dir. Bununla birlikte, farklı ışık kaynakları (yapıştırıcı malzeme, satıcı tarafından sunulan bakınız) Bu adım için kullanılabilir. </li><li> Scotch bant ile ilk birkaç katmanları kaldırarak temiz bir mika yüzey Açığa. </li><li> Mika yüzeye optik yapıştırıcı küçük bir damla (~ 20 mikron) yerleştirin. NOT: Bu aşamada, düşük otofloresan düzeyi ile yüksek viskoziteli yapıştırıcı tavsiye edilir. Deneyimlerimiz düşük (adım 2.2) ve yüksek viskoziteli yapıştırıcı kombinasyonunu kullanarak mika bölme anlamlı etkinliği (adım 2.7) arttırdığını göstermiştir. </li><li> Yavaşça hava kabarcıkları kaçınarak, yapıştırıcı damla üzerine taze temizlenmiş lamel yerleştirin, 1 dakika razı olsun. </li><li> , UV lamba altında 10 dk Cure. NOT: Bu aşamadan sonra cam slayt, mika ve lamel sandviç (birkaç hafta kadar) bir zaman nispeten uzun bir süre boyunca saklanabilir. Mika yüzey taze olduğundan emin olmak için, sadece gerçek SLB öncesi hazırlık sonraki adıma geçin. NOTYapışkan 380nm 350 aralığında maksimum emme ve tam tedavisi için gerekli olan enerji ile önerilen UV ışığı ile sertleştirilir 4.5J/cm 2&#39;dir. Bununla birlikte, farklı ışık kaynakları (yapıştırıcı malzeme, satıcı tarafından sunulan bakınız) Bu adım için kullanılabilir. </li><li> Videoda gösterildiği gibi bir exacto bıçak kullanarak, hafifçe yan cam slayt lamel kaldırılıyor. Çoğu durumda, mika, ince ve düz bir tabaka lamel takılı kalır. (Adım 2.4 tekrarlayın) tekrar edilebilir Mika cam slayt bağlı. </li><li> Mika tabakası hala lamel yapıştırılmış ve adım 2.8 &#39;yarma sırasında tamamen kaldırıldı değildi emin olmak için, çıplak gözle ya da mikroskop altında yüzey kalitesini kontrol edin. Bir forseps ile küçük bir çizik yapma veya iğne diseksiyon mika algılanabilir, farklı bir tutarlılık vardır yapıştırıcı ayırt yardımcı olacaktır. </li><li> 1.5 ml şişe kapağından lastik conta çıkarın ve optik kullanarak yüzeye ters kapağı tutkalyapışkan veya tırnak cilası, ve UV lamba ile tedavi veya hava sırasıyla, 10 dakika kurumasını bekleyin. NOT: örnek AFM görüntüleme ile eş zamanlı optik (TIRFM veya konfokal) için hazırlanmış ise, bir 1.5 ml şişe kapağı mikroskop sahnede AFM baş bağlamaya çok küçük olabilir. Bu durumda, kapak AFM başlığı monte etmek için uygun olan daha büyük bir çapa sahip herhangi bir plastik O-halka ile ikame edilmiş olabilir. Deney mika yüzeye zarar vermeden kapağı çıkarmadan gerektiren bir durumda, silikon yağ yerine, yapıştırıcı veya oje kullanılabilir. </li></ol> 3.. Desteklenen çift katlı lipid (SLB) Oluşumu <ol><li> Yüzeyli odasına taze hazırlanmış lipozom solüsyonu yerleştirin. SLB oluşumu için gerekli olan minimum hacmi ~ 30 ul. NOT: lipozom ve SLB oluşumu hakkında daha fazla bilgi için, örneğin Çanta ark olarak yayınlanan protokolleri, bakınız, 2014 15... </li><li> İstenilen protokolü kullanılarak SLB oluşumu ile devam edin. İnkübasyon sırasında veGörüntüleme, odacık bir ısı-blok veya erime sıcaklığının üstünde kullanılan lipitleri tutmak için gerekli sıcaklığı sağlamak için ısıtıldı mikroskop aşamasında yerleştirilebilir. </li></ol>

<ol><li>Giocondi, M. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+topography+of+membrane+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Surface topography of membrane domains.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 703-718 (2010).</li>
<li>Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+analysis+of+membrane+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Surface analysis of membrane dynamics.</a> Biochim Biophys Acta. 1798, 766-776 (2010).</li>
<li>Plochberger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+slows+down+the+lateral+mobility+of+an+oxidized+phospholipid+in+a+supported+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Cholesterol slows down the lateral mobility of an oxidized phospholipid in a supported lipid bilayer.</a> Langmuir. 26, 17322-17329 (2010).</li>
<li>El Kirat, K., Morandat, S., Dufrêne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+analysis+of+supported+lipid+bilayers+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 750-765 (2010).</li>
<li>Szmodis, A. W., Blanchette, C. D., Longo, M. L., Orme, C. A., Parikh, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermally+induced+phase+separation+in+supported+bilayers+of+glycosphingolipid+and+phospholipid+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">Thermally induced phase separation in supported bilayers of glycosphingolipid and phospholipid mixtures.</a> Biointerphases. 5, 120-130 (2010).</li>
<li>Strulson, M. K., Maurer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+printing+for+creation+of+patterned+lipid+bilayers+on+tetraethylene+glycol+self-assembled+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Microcontact printing for creation of patterned lipid bilayers on tetraethylene glycol self-assembled monolayers.</a> Langmuir. 27, 12052-12057 (2011).</li>
<li>Satriano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+oxidized+polyhydroxymethylsiloxane--a+new+smooth+surface+for+supported+lipid+bilayer+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Plasma oxidized polyhydroxymethylsiloxane--a new smooth surface for supported lipid bilayer formation.</a> Langmuir. 26, 5715-5725 (2010).</li>
<li>Bag, N., Sankaran, J., Paul, A., Kraut, R. S., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+and+limits+of+camera-based+fluorescence+correlation+spectroscopy%3A+a+supported+lipid+bilayer+study%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%3A+a+European+Journal+of+Chemical+Physics+and+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Calibration and limits of camera-based fluorescence correlation spectroscopy: a supported lipid bilayer study.</a> Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13, 2784-2794 (2012).</li>
<li>Singh, S., Keller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+of+supported+planar+membrane+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy of supported planar membrane bilayers.</a> Biophysical Journal. 60, 1401-1410 (1991).</li>
<li>Przybylo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Diffusion+in+Giant+Unilamellar+Vesicles+Is+More+than+2+Times+Faster+than+in+Supported+Phospholipid+Bilayers+under+Identical+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Lipid Diffusion in Giant Unilamellar Vesicles Is More than 2 Times Faster than in Supported Phospholipid Bilayers under Identical Conditions.</a> Langmuir. 22, 9096-9099 (2006).</li>
<li>Scomparin, C., Lecuyer, S., Ferreira, M., Charitat, T., Tinland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+in+supported+lipid+bilayers%3A+influence+of+substrate+and+preparation+technique+on+the+internal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Phys+J+E+Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Diffusion in supported lipid bilayers: influence of substrate and preparation technique on the internal dynamics.</a> Eur Phys J E Soft Matter. 28, 211-220 (2009).</li>
<li>Oreopoulos, J., Yip, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+scanning+probe+and+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Combined scanning probe and total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods. 46, 2-10 (2008).</li>
<li>Shaw, J. E., Slade, A., Yip, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+in+situ+total+internal+reflectance+fluorescence%2Fatomic+force+microscopy+studies+of+DPPC%2FdPOPC+microdomains+in+supported+planar+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Simultaneous in situ total internal reflectance fluorescence/atomic force microscopy studies of DPPC/dPOPC microdomains in supported planar lipid bilayers.</a> J Am Chem Soc. 125, 11838-11839 (2003).</li>
<li>Skaug, M. J., Faller, R., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlating+anomalous+diffusion+with+lipid+bilayer+membrane+structure+using+single+molecule+tracking+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Correlating anomalous diffusion with lipid bilayer membrane structure using single molecule tracking and atomic force microscopy.</a> J Chem Phys. 134, (2011).</li>
<li>Bag, N., Yap, D. H., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+dependence+of+diffusion+in+model+and+live+cell+membranes+characterized+by+imaging+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Temperature dependence of diffusion in model and live cell membranes characterized by imaging fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta. , (2013).</li>
<li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> J Struct Biol. 151, 182-195 (2005).</li>
<li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metadata+matters%3A+access+to+image+data+in+the+real+world%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).</li>
<li>Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+microscopy+on+model+membranes+reveals+anomalous+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion.</a> Biophys J. 73, 1073-1080 (1997).</li>
<li>Matysik, A., Kraut, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackArt%3A+the+user+friendly+interface+for+single+molecule+tracking+data+analysis+and+simulation+applied+to+complex+diffusion+in+mica+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers.</a> BMC Research Notes. 7, (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokol, lipid iki katmanlı birikimi ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme için düz ve ince mika yüzeylerin hazırlanması için bir yöntemi tarif etmektedir. Bu teknik, çok yüksek kalitede bir yüzey elde etmek için mika kritik olan cam mika cam sandviç (adım 2.8), dikkatli sökme sınırlı az manuel beceri gerektirir. Mika yaran olmadan optik yapıştırıcı ayırmak için mümkün olduğu Taze kırılmış mika Denetim zaman optik yapıştırıcı maruz kalan bölgeleri bırakarak, bu noktada gereklidir. Bu, yapıştırıcıya yerine mika üzerinde...

Mevcut protokolün genel amacı da atomik kuvvet ile kombine edilebilir optik toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) veya konfokal mikroskopi kullanılarak mika desteklenen lipit tabakalarının (SLBS) yüksek çözünürlüklü görüntüleme için mika yüzeyleri hazırlamak için bir yöntem göstermektir mikroskobu (AFM). SLBS lipid kümeleme, faz ayrılması, peptidler, proteinler veya diğer bileşikler 1-5 ile iki tabakalı bileşenler veya bunların etkileşimleri ve dinamikleri çok sayıda çalışmalar için yaygın olarak kullanılan bir model vardır. Farklı alt tabakalar SLB oluşumu çalışmanın 4,6-8 doğasına bağlı olarak, (örneğin, cam, mika, silikon dioksit, polimerler) için kullanılabilir. Tipik membran çalışmalar, TIRFM ve AFM gibi mikroskopi tabanlı görüntüleme teknikleri, güveniyor. Cam şeffaf olduğu için Böylece TIRFM görüntüleme için, bir cam yüzeyi, tipik bir seçimdir. Cam imalatı nispeten kolay ve sonuçların kalitesi öncelikleönce lipid veziküllerin çökeltilmesinden temizleme ayrıntılı yüzey tarafından belirlenir. Yüksek çözünürlük nedeniyle eksenel AFM mika yüzeyleri gerektirir. Mika mükemmel bazal bölünme yakın olan, bir silikat mineraldir. Böylece, taze yarılmış mika hatta alt-nanometre ölçeğinde 9 zar yükseklik farklarının gözlem sağlayan atomik düz. Örneğin flüoresan korelasyon spektroskopisi (FCS), izleme tek bir molekül (SMT) ve (sıkı bağlamak) ışıkla ağartma sonra floresan kurtarma gibi yöntemler kullanılarak difüzyon çalışmalar, lipid zarı dinamikleri tevdi hangi üzerine yüzey tipine, burada cam büyük ölçüde bağlıdır, ancak gösterdi ve mika yaygın olarak farklı sonuçlar 10,11 verebilir. Bu farklılıklar membran sondaların difüzyon katsayıları, aynı zamanda farklı oranları ile difüzyon parçacıkların ayrı popülasyonlarının algılama ve muhtemelen farklı durumları arasında geçiş sadece içerir. Bu durumda,Aynı yüzey (bu durumda mika) kullanılmadıkça TIRFM ve AFM teknikleri kullanılarak elde edilen sonuçların doğrudan bir karşılaştırma, genellikle sorunludur. TIRFM ve AFM bilayeri görüntüleme aynı mika yüzeye 12,13 yürütülmüştür bazı çalışmalar olmasına karşın, mika nadiren çoğunlukla nedeniyle taşıma problemleri, optik mikroskopi için kullanılır. Mika hazırlık sonra optik yapıştırıcı 12 kullanarak lamel yapıştırılmış ince broşürler, içine elle kesim gerektirir. Bu yöntem, bununla birlikte tatmin edici sonuçlar elde etmek için bazı pratik gerektirir. Dahası, elde yüzeyleri onları zor düşük çalışma mesafesi, yüksek sayısal diyafram lensler ile kullanmak için yapım, genellikle dalgalı ve kalın. Bu protokolde tarif edildiği gibi hazırlanmıştır mika yüzeyler çok ince (170 um lamel kalınlığı dahil ~ 220 um) ve son derece düz, başarılı bir yüksek çözünürlüklü görüntüleme için kritik olan &quot;saç, dalgalı&quot; önlenir. Bunlar kullanılabilirTIRFM veya konfokal kurulumları için. Ayrıca, aynı örnekler AFM transfer edilebilir ve hatta TIRFM / konfokal ve AFM ile eş zamanlı olarak görüntülenebilir. Bu iki teknik birleştiren iki katmanlı zar yapısı 14 ile difüzyon davranışı doğrudan bir ilişki sağlar. Mika yüzeyleri taze yarılır, çünkü onlar temiz ve (cam temizleme protokollerinin genellikle Piranha çözüm, sülfürik asit, sodyum / potasyum hidroksit gibi kimyasallar dahil) zaman alıcı, kötü tekrarlanabilir, ve potansiyel olarak tehlikeli temizlik prosedürlerini gerekmez. De tarif edilen bir protokol küçük odası, montajı, en az 50 ul için etkili iki katmanlı oluşumu için gerekli veziküllerin hacmini azaltır. Son olarak, yüzey montaj tüm süreç zaman tüketen geleneksel mika bölünme ve tutkallama işlemi yaptığı gibi, (hazırlık az 30 dakika sürer), ve manuel beceri yüksek derecede gerektirmez değildir.

<table><tbody><tr><td>Banyo Sonikatör</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB15051</td><td></td></tr><tr><td>Lamelleri 24 x 50 mm - H1.5 Hayır</td><td>Marienfeld</td><td>102222</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850357</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III (deterjan)</td><td>Hellma Analytics</td><td>320.003</td><td></td></tr><tr><td>Mika V-1 Sınıfı</td><td>SPI Tedarikçileri</td><td>1872-CA</td><td></td></tr><tr><td>Optik Yapıştırıcı (yüksek viskozite)</td> <td>Norland Ürünleri</td><td>NOA63</td><td></td></tr><tr><td>Optik Yapıştırıcı (düşük viskoziteli)</td> <td>Norland Ürünleri</td><td>NOA60</td><td></td></tr><tr><td>Sfingomyelin-ATTO647N</td><td>AttoTec</td><td>AD 647N-171</td><td></td></tr><tr><td>UV lambası</td><td>Sinoptikler Ltd.</td><td>GelVue GVM20</td><td>Lamba %100 güce ayarlandı</td></tr></tbody></table>

mika hazırlanması yüksek Çözünürlüklü optik mikroskopi görüntüleme için lipit tabakalarının desteklenen

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Desteklenen ikili lipid tabakalarıdır (SLBS) yaygın membran özellikleri (faz ayrımı, kümeleme dinamikleri) ve bu tür ilaçların veya peptidler gibi başka bileşikler ile etkileşimi incelemek için bir model olarak kullanılır. Ancak SLB özellikleri, kullanılan desteğine bağlı olarak farklılık gösterir. SLB görüntüleme ve ölçümler için yaygın olarak kullanılan teknikler tek bir molekülün floresan mikroskopi, FCS ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) vardır. AFM son derece düz bir yüzeye (genellikle mika) gerektirir ise en çok optik görüntüleme çalışmaları, bir cam destek üzerinde gerçekleştirildiği için bu maddelerin şarj ve yumuşaklık özellikleri güçlü difüzyon etkileyebilir, çünkü bu teknikleri sonuçları, doğrudan karşılaştırılamaz. Ne yazık ki, cam slayt kesme ve mika ince dilim yapıştırma için gerekli olan el becerisi yüksek SLB hazırlanması için mika rutin kullanımı için bir engel oluşturur. Bu tercih edilen bir yöntem, bu tür hazır mika olmasına karşınyüzeyleri sık sık özellikle küçük çalışma mesafesi, yüksek sayısal diyafram lensler ile, düzensiz (dalgalı) ve görüntü zor olarak bitirmek. Burada vezikül lipid birikimi ve SLB hazırlanması için, ince, düz bir mika yüzeylerin hazırlanması için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem sunarlar. Ayrıca, bizim ölçüye oda SLB veziküller formasyonu için sadece çok küçük miktarlar gerektirir. AFM çalışmalarda kullanılan doğrudan karşılaştırılabilir olan yüksek kaliteli lipid iki katmanlı yüzeylerin, etkili, basit ve ucuz bir üretim genel prosedürü ile sonuçlanır.

SLBS floresan lipid sondaların difüzyon davranışı alt maddeye bağlı olarak farklıdır. SMT tekniği ile birleştirilmiş TIRFM parçacık hareketleri görselleştirme ve difüzyon katsayıları ayıklamak için değerli bir yöntemdir. Bir DOPC cam ve mika üzerinde desteklenen (1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin) iki katmanlı olarak bir difüzyon Sfingomiyelin-ATTO647N prob tek molekül sinyalleri bağlı hareketli şekilde gösterilir. Burada yer yüzeyi mika edilen protokole göre hazırlandı. Optik sapmaları tahmin etmek için, ya...

Biz yüksek çözünürlüklü mikroskopi için mika desteklenen lipit katmanlarını hazırlamanın bir yöntem mevcut. Mica bir atomik ölçekte şeffaf ve düz, ancak nadiren nedeniyle zorluklar ele görüntülenmesinde kullanılan; bizim hazırlık mika tabakanın da birikimi ile sonuçlanır, ve iki katmanlı hazırlanmasında kullanılan malzemeyi azaltır.

Mika hazırlanması Yüksek Çözünürlüklü Optik Mikroskopi Görüntüleme için lipit tabakalarının Desteklenen

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Burada sunulan prosedür, tek molekül izleme çalışmaları gibi yüksek çözünürlüklü görüntülemeye uygun katmanlar tarafından MICA® destekli lipid hazırlamanın kolay bir yöntemini göstermektedir. MICA® yüzeyi, düz ve son derece ince taze bir mika yüzeyini açığa çıkaran optik yapıştırıcı kullanılarak cam mikroskop lamı ile kapak lamı arasına yapıştırılmış tek bir MICA® tabakasından oluşan bir sandviçin ayrılmasıyla hazırlanır. Bir buçuk mililitrelik bir flakon kabından yapılmış küçük bir plastik hazne monte edilerek, iki tabaka oluşumu için gereken lipit veziküllerinin hacmi 30 mikrolitre kadar düşük olabilir.İlk adım olarak, tedarikçiden gelen çok katmanlı MICA® tabakasını alın ve makasla daha küçük parçalar halinde kesin. Yeni bir bıçak bıçağı kullanarak broşürü iki veya üç ince broşür haline getirin. Şimdi temizleyin, kapak iyice uyur.Bu, 0.17 milimetre kapak yerleştirmeyi içerir. Her kapağı bir cam eğitim kavanozuna sığar. Ayrı bir yuvada uyuyun ve 60 santigrat derecede 30 dakika boyunca deterjan içinde sonikasyon yapın.Kapağı yıkayın. Mini anahtar suyu ile 10 ila 20 kez uyur ve hava akımı veya nitrojen ile fön çeker. Bir mikroskop cam lam alın ve yerinde temizleyin.Daha önce mikroskop patlaması ve küre üzerinde yaklaşık 15 mikrolitre düşük viskoziteli optik ahe küçük bir damla. Bir UV ışık kutusu üzerinde birkaç dakika boyunca broşür hasif'i kesin. Birkaç kat mika soymak için viski bandı kullanın.İlk birkaç katman parçalanacaktır, bu yüzden viskiye bağlı katmanları görene kadar yapın. Bant düzgün ve tamdır. Bandı kapatın.Micah Yüzeyine bir damla yüksek viskoziteli optik yapıştırıcı yerleştirin. Orada hava kabarcığı olmadığından emin olun. Saldırgan damlacığın üzerine nazikçe temiz kapak uykusu yerleştirin.Ahe'yi yaymak için camı hafifçe vurmak için cımbız kullanın. Yine, yapıştırıcıyı UV ışığı ile birkaç dakika kürleyin. Camdan oluşan sandviçi bölmek için bıçak kullanın.MICA'yı kaydırın ve uyku durumunu örtün. Çoğu durumda, yalnızca çok ince bir MICA tabakası örtü uykusuna yapışmış kalacaktır. Bir iğne veya cımbız ucuyla küçük çizikler yaparak MICA® yüzeyinizi incelemek için diseksiyon mikroskobu kullanın.Yüzeyin gerçekten mika olup olmadığını, yüzeyin düzgün bir şekilde çizildiği yerde, burada olduğu gibi veya optik yapıştırıcı üzerinde, yüzeyin parlak olduğu yerde olduğu gibi kolayca söyleyebilirsiniz. Bir buçuk mililitrelik cam şişeden bir bardak alın, gaz kabını çıkarın ve kapağı oje kullanarak MICA® yüzeyine yapıştırın. Birkaç dakika kurumasını bekleyin.Şimdi burada standart bir protokol kullanarak bir lipit çift katmanlı onarım lipidi katman katman hazırlayabilirsiniz. 30 mikrolitrelik bir damla lipit vezikül, flakon kapağı haznesine yerleştirilir ve tamponunuzu yıkamadan önce 60 dakika inkübe edilir. Yıkandıktan sonra numune görüntüleme için hazırdır.Bu durumda, özel yapım numune tutucuya monte edilir. Bu tür hazırlanmış MICA® yüzeyinde tek moleküller kolayca gözlemlenebilir. Burada A-D-O-P-C'yi cam ve mika üzerinde desteklenen katmana göre karşılaştırıyoruz.Hareket türünün bu iki yüzey arasında önemli ölçüde farklılık gösterdiğine dikkat edin. Sağ panellerde renklerle izlenen tek moleküllerin yolu, MICA® üzerindeki difüzyon davranışının cam üzerindekinden farklı olduğunu açıkça göstermektedir. Bununla birlikte, görüntüleme kalitesinde önemli bir fark yoktur.20 nokta için yarı maksimum yoğunlukta düz fonksiyonun ortalama örgüsü, her iki alt tabaka için hemen hemen aynıdır, bu da MICA® yüzeyinin gözle görülür optik sapmalar oluşturmadan ışıkla tamamen nüfuz edebileceğini gösterir. Genel olarak, MSDS difüzyon davranışında bariz bir fark gösterir. Bununla birlikte, her durum için, farklı oranlarda yayılan iki parçacık popülasyonu gözlemlenebilir.Hızlı ve yavaş olmak üzere iki farklı difüzyon katsayısı, çift üstel beslemeden kare yer değiştirmenin kümülatif olasılığına çıkarıldı. Bu DOPC çift tabakası için, her iki difüzyon bileşeni de MICA yüzeyinde daha hızlıdır, MICA® üzerindeki yavaş hareket eden parçacıklar hızlı olandan yaklaşık 10 ila 20 kat daha yavaştır. Bununla birlikte, cam üzerindeki yavaş nüfus, burada hareketsiz olmaya yakındır.Yüzey tipinin lipid çift tabakalarının difüzyon davranışında bir fark yaratabileceğini gösterdik. Bu nedenle, MICA® gibi farklı substratlar üzerinde desteklenen çift tabakalar üzerindeki çalışmalar arasındaki sonuçları karşılaştırırken dikkatli olmak gerekir ve MICA'daki cam çift tabakaları görüntülemek, gösterdiğimiz karmaşık hazırlık nedeniyle genellikle oldukça zordur, ancak bu kadar yüksek kaliteli yüzeyleri hazırlamanın basit ama etkili bir yoludur.

preparation-mica-supported-lipid-bilayers-for-high-resolution-optical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Desteklenen düzlemsel bilayers immünolojik sinaps moleküler etkileşimleri modellemek için kullanılabilir güçlü araçlardır. Burada, lipid bilyer üst broşür sinaps oluşumunu modüle ve sinaps oluşumu TIRF mikroskobu kullanarak görselleştirmek için bilinen hücre adezyon proteinleri demirleme için yöntemler göstermektedir.

İmmünolojik Sinapslar ve Kinapse Eğitim Oluşumu için desteklenen Düzlemsel Bilayers

Bu videoda, toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak in vitro olarak cam destekli bir lipid çift tabakası üzerinde septin organizasyonunu araştırmak için bir prosedür gösteriyoruz.

Düzlemsel Destekli Lipid Bilayer Deneyi: Biyolojik Membran Mimiklerinde Septin Montajını Araştırmak İçin Mikroskopi Tabanlı İn Vitro Teknik

Desteklenen lipid çift katmanlarının hazırlanması ve atomik kuvvet mikroskobu ve kuvvet spektroskopisi kullanılarak karakterizasyonu için bir protokol açıklıyoruz.

Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme ve Desteklenen Lipid Bilayers Kuvvet Spektroskopisi

Biz lipid veziküller kullanmadan katı yüzeyler üzerinde desteklenen lipid çift oluşturmak için deneysel bir protokol mevcut. Çeşitli biyolojik uygulamalarda, kolesterol açısından zengin bir etki ile, bir lipid, silikon dioksit ve altın iki tabakalı olarak desteklenen zarları meydana getirmek üzere, bir aşamalı bir yöntemi göstermektedir.

Solvent destekli çift katlı lipid (SALB) Yöntemi ile biyomembran Fabrikasyon

Protein fonksiyonelleştirilmiş düzlemsel cam destekli lipid çift katmanlarının hazırlanması, içindeki protein hareketliliğinin belirlenmesi ve protein yoğunluklarının ölçülmesi burada gösterilmiştir. Yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe sahip tek çift katmanlı yerleşik florokromların görselleştirilmesine olanak tanıyan, gürültüsü azaltılmış bir Toplam İç Yansıma mikroskobu oluşturmak için bir yol haritası özetlenmiştir.

Planar on Tek Molekül Floresans Mikroskopi bilayers Desteklenen

Bu protokolde tek lipid ve multi-lipid vesicles, desteklenen lipid bilayerler ve askıda lipid bilayerleri taklit eden hücre oluşumu açıklanmaktadır. Bu in vitro modeller çeşitli lipit tiplerini içerecek şekilde uyarlanabilir ve çeşitli molekül ve makromolekül etkileşimlerini araştırmak için kullanılabilir.

Moleküler Etkileşimlerin Çalışması için Desteklenen ve Askıya Alınan Lipid Bilayer Modellerinin Hücre Taklit Montajı

Lipid monolayerler, on yıllardır yapısal çalışmalar için iki boyutlu (2D) protein kristalleri oluşturmak için bir temel olarak kullanılmaktadır. Hava-su arayüzünde stabildirler ve elektron görüntüleme için ince bir destekleyici malzeme olarak hizmet verebilirler. Burada lipid monolayerlerinin biyolojik çalışmalara hazırlanması konusunda kanıtlanmış adımları sunuyoruz.

Elektron Kristalografik Çalışmaları için Lipid Monolayer Yöntemi Kullanılarak Numune Hazırlama

Bu protokol, floresan mikroskobu kullanılarak yeniden oluşturulmuş, membrana bağlı sitoiskelet ağlarının dinamiklerini incelemek için desteklenen lipid çift katmanlarının oluşumunu ve hücre iskeleti filamentlerinin ve motor proteinlerin eklenmesini açıklar.

Membrana Bağlı Minimal Aktin Kortekslerinin Desteklenen Lipid Çift Katmanlı Üzerinde Yeniden Sulandırılması

Burada, tek moleküllü toplam iç yansıma floresan (smTIRF) mikroskobu kullanılarak yapay kalabalık lipit membranları üzerindeki tek moleküllerin bağlanma, hareketlilik ve montajını gerçekleştirmek ve analiz etmek için bir protokol sunulmaktadır.

Tek Moleküllü Difüzyon ve Polimer Kalabalık Lipid Membranlara Montaj

Bu protokol, bireysel iyon kanallarını izlemek ve desteklenen lipit membranlarındaki aktivitelerini belirlemek için TIRF mikroskopisinin nasıl kullanılacağını açıklar, böylece yanal membran hareketi ile kanal fonksiyonu arasındaki etkileşimi tanımlar. Membranların nasıl hazırlanacağını, verilerin nasıl kaydedileceğini ve sonuçların nasıl analiz edileceğini açıklar.

Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu Kullanılarak Lipid Çift Katmanlarında Yanal Mobilite ve İyon Kanalı Aktivitesinin Tek Moleküllü Görüntülenmesi

Bu makale, katı destekli lipid çift katmanlarında tek protein izleme için örnekler nasıl oluşturulacağına dair ayrıntılı bir açıklama sunmaktadır. Ayrıca, tek molekül hassasiyeti ve hızlı kare hızına sahip basit bir floresan mikroskobu da açıklar. Son olarak, tek protein yörüngelerinin çıkarılması prosedürünü özetliyoruz.

Lipid çift katmanlarında tek proteinlerin floresan mikroskopisi kullanılarak takibi

Keşfedin mika destekli lipid çift katmanlarını yüksek çözünürlüklü optik mikroskopi için hazırlama yöntemini. Bu teknik tek molekül izleme çalışmalarına olanak tanır ve sadece 30 mikrolitre lipid vezikülü kullanır.

Mika hazırlanması Yüksek Çözünürlüklü Optik Mikroskopi Görüntüleme için lipit tabakalarının Desteklenen

Daha fazla video keşfet