Floresan Nanopartiküller Uygulama Hücre içi Bakteri tarafından Endo-lizozomal Sistemi Modelleme Eğitim için

Bu prosedürün genel amacı, izleyici olarak floresan nanopartiküller kullanarak hücre içi bakteriler tarafından uç lizozomal sistemin yeniden şekillenmesini incelemektir. Bu, ilk olarak topuk hücrelerinin sekiz kuyulu bir odacıklı slaytta tohumlanması ve gece boyunca inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, hücreleri salmonella ve tarica ile enfekte etmektir.

Daha sonra, enfekte olmuş konakçı hücrelerin bir darbe takip etiketlemesi, altın BSA Rumine nanopartikülleri ile inkübasyon yoluyla gerçekleştirilir. Son adım, konfokal mikroskopi ile konak hücre endozomal sistemindeki değişiklikleri gözlemlemektir. Sonuç olarak, nanopartiküllerin hücre içi dağılımının nicelleştirilmesi, MRS yazılım paketi kullanılarak gerçekleştirilir.

Bu tekniğin immünomikroskobik gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, enfekte olmuş n hücrenin yöntemle analiz edilmesi, terika'nın hücre içi yaşam tarzı hakkında fikir vermesidir. Bununla birlikte, Gaia türleri, Ella Prolia veya mycobacterium tuberculosis gibi diğer hücre içi patojenlere de uygulanabilir. Mikro feh, hücre hatları veya birincil hücreler gibi diğer konakçı hücre tiplerine de uygulanabilir.

10 nanometre altın nano parçacıklarının veya NPS'nin sentezi, çözelti A'B.To çözelti ve çözelti A'yı hazırlamak için iki çözelti gerektirir, 160 mililitre mili Q suya iki mililitre% 1 sulu altın klorür ekleyin. 32 mililitre mili Q suya sekiz mililitre% 1 trisodyum sitrat dihidrat ve% 160 mikrolitre% 1 tanik asit ekleyerek B çözeltisini hazırlayın. Çözelti A ve B'yi 60 santigrat dereceye ısıtın ve karıştırırken karıştırın.

Yaklaşık 15 dakika sonra hemen koyu mavi bir renk gözlenmelidir. Çözelti bu noktada kırmızı renkte olmalıdır. Çözeltiyi 95 santigrat dereceye ısıtın.

Beş dakika boyunca 95 santigrat derecede tutun ve ardından çözeltiyi oda sıcaklığına soğutun. 1,5 mililitrelik bir einor tüpüne 900 mikrolitre altın MPS ekleyerek ve 30 dakika boyunca 15.000 Gs'de santrifüjleyerek altın parçayı kaplama ve etiketleme için hazırlayın. Süpernatanı atın ve peleti 900 mikrolitre sterilize edilmiş MQ suda yeniden süspanse edin.

100 mikrolitre A BSA çözeltisi ekleyin ve 30 dakika boyunca 800 RPM'de bir girdap üzerinde karıştırın. Preparatı dört santigrat derecede 60 dakika boyunca 15.000 Gs'de santrifüjleyerek fazla BSA'yı çıkarın. Süpernatanı atın ve altın BSA NPS'yi ve 125 mikrolitre PBS'yi yeniden askıya alın.

12,5 mikrolitre bir molar bikarbonat ekleyin. R domine n hidroksi CIN esteri veya NHS çözeltisi, hemen önce DMSO'da hazırlanır. 15 mikrolitre R DOMINE N-H-S-D-M-S-O çözeltisinde 0,5 mililitre altın BSA NP süspansiyonu kullanın.

800 RPM'de karıştırırken ve ışığa maruz kalmaktan kaçınırken reaksiyonu oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Daha sonra, saflaştırmadan sonra 36 ila 48 saatlik bir süre boyunca beş tampon değişikliği ile dört santigrat derecede PBS'ye karşı diyaliz yoluyla altın BSA rumine NPS'yi saflaştırın, her bir mililitre altın BSA RUMINE NPS'ye 10 mikrolitre B-S-A-P-B-S ekleyerek NPS'yi stabilize edin ve 15'te serbest bırakılan veya serbest bırakılan BSA Rumine santrifüjünü çıkarın, Dört santigrat derecede 000 dakika boyunca 16 GS. Resus, optik yoğunluğu 520 nanometrede veya OD beş 20'de ölçtükten sonra peleti mililitre B-S-A-P-B-S mililitre başına iki miligram olarak askıya alır.

Altın BSA Rod Domine NPS'yi dört santigrat derecede saklayın, ışığa maruz kalmaktan kaçının, bu deney için hücreler kalıcı olarak lizozomal glikoprotein lambası bir GFP etiketli yeşil bir floresan proteini eksprese eder ve% 5 karbondioksit içeren bir atmosferde 37 santigrat derecede% 10 fetal buzağı serumu ile DMEM'de kültürlenir, hücreleri 50 ° C'lik bir yoğunlukta tohumlar, Sekiz kuyulu bir oda slaytında kuyu başına 000 ve gece boyunca inkübe edin. Hela hücrelerini enfekte eden bakteri, insan gastrointestinal patojeni, salmonella ve tarica'dır. Karşılaştırma için iki mutant suş kullanılır.

Her üç suş da, gelişmiş GFP'nin yapısal ekspresyonu için bir plazmit barındırır ve her suş için plazmitleri korumak için uygun antibiyotiklerle LB suyunda kültürlenir. Tek bir bakteri kolonisini üç mililitre LB suyuna uygun antibiyotikle aşılayın ve gece boyunca 37 santigrat derecede büyütün. Ertesi gün havalandırma için çalkalama koşulları altında, her kültürü taze LB suyunda bir ila 31 oranında seyreltin ve üç buçuk saat boyunca büyümeye devam edin.

Bu prosedüre başlamak için, alt kültür bakterilerinin OD 600'ünü ölçün ve 0.2'lik bir OD 600'e seyreltin. Bir mililitre PBS'de, 100'lük bir enfeksiyon çokluğu elde etmek için A 12 odacıklı slayttaki hela hücrelerine uygun miktarlarda bakteri ekleyin. Hücre inkübatöründe 30 dakika inkübe edin.

İçselleştirilmemiş bakterileri uzaklaştırmak için hela hücrelerini PBS ile üç kez yıkayın. Bu zaman noktası, enfeksiyon sonrası sıfır saat veya sıfır saat pi olarak ayarlanır. Hücrelere mililitre gentamisin başına 100 mikrogram içeren 300 mikrolitre taze kültür ortamı ekleyin ve bir saat bekletin.

Bir saat sonra. Ortamı, mililitre gentamisin başına 10 mikrogram içeren görüntüleme ortamıyla değiştirin. 0.1'lik OD beş 20'lik nihai bir konsantrasyon elde etmek için hela hücrelerine altın BSA rumin NPS ekleyin.

Bir saat sonra bir saat inkübe edin. Ortamı çıkarın ve PBS ile üç kez yıkayın. Son olarak,% 10 FCS ve mililitre gentamisin başına 10 mikrogram içeren 300 mikrolitre taze görüntüleme ortamı ekleyin.

İnkübasyon süresinin geri kalanı için, hücrelerin farklı zaman noktalarında yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi, nemlendirilmiş bir ortam odası ile konfokal lazer tarama veya dönen disk mikroskobu gibi bir konfokal görüntüleme sistemi kullanılarak gerçekleştirilir. Büyütme, tarama, hız, çözünürlük ve Z adım boyutu gibi görüntüleme ayarlarını optimize edin. Enfeksiyon sonrası belirtilen zaman noktalarında GFP ve altın BSA rumine NPS için uygun uyarma emisyon ayarlarını kullanın.

Enfekte hücreleri içeren A 12 odacıklı slaytı mikroskop sahnesine monte edin ve görüntüleri analiz etmek ve hücre içi salmonella ile endozomal sistemin yeniden şekillenmesini incelemek için görüntüleri kaydedin. Görüntü analiz yazılımı kullanın. Aç'ı tıklatarak ve aşma görünümünün nesneler araç çubuğunda dosyayı seçerek verileri açın.

Yeni bir yüzey öğesi eklemek için simgeye tıklayın. Bir ilgi alanını veya yatırım getirisini analiz etmek için yalnızca ilgilenilen bir bölgeyi segmentlere ayırın'ı seçin, ardından kaynak kanal olarak ileri'yi tıklayın. Üçüncü kanalı seçin.

Ortaya çıkan alanın düzgünlüğünü ayarlamak için düzgün seçeneğini işaretleyin. Manuel olarak bir değer tanımlayın veya otomatik olarak oluşturulan değeri kabul edin. Eşik için.

Eşik ayarı için mutlak yoğunluk seçeneğini seçin. Manuel seçeneğini seçin ve görüntüleme alanında bir değer ayarlayın. Yüzey eşiği önizlemesi gri renkte görüntülenir.

Sekmede ileri'ye tıklayın Yüzeyleri sınıflandırır. Elde edilen yüzey çeşitli kriterlere göre filtrelenebilir. Varsayılan filtre, 10'dan büyük V deliklerinin sayısıdır, diğer filtreler de ekle'ye tıklanarak dahil edilebilir.

Bu örnekte, yüzey oluşturma işlemini tamamlamak için varsayılan filtre kullanılmıştır. Nesne listesinde bitir'e tıklayın. Öğe hacminin kutusunun işaretini kaldırın.

Yeni oluşturulan bir yüzey artık görüntüleme alanında görüntüleniyor. Kırmızı renkte, kaydet'e tıklayarak istatistikleri bir Excel dosyasına aktarın. Bu protokol tarafından sentezlenen altın NPS, yarı küresel bir şekle ve yaklaşık 10 nanometre boyuttaydı.

BSA kaplama ve rho domine etiketlemesi, morfolojilerini veya boyutlarını etkilemedi. Konak hücresel endozomal sistemin intrasellüler salmonella ile yeniden şekillenmesini incelemek. Hela hücreleri sahte enfekte edildi veya vahşi tip salmonella veya iki mutant suş ile enfekte edildi ve nabız 10 nanometre altınla kovalandı.

BSA, enfekte olmayan hücrelerde bezelye çubuğunu domine eder, NPS geç endozomlarda veya lizozomlarda eşit olarak dağıtılır. Buna karşılık, vahşi tip salmonella ile enfekte olmuş hücrelerdeki NPS, enfeksiyondan sekiz saat sonra büyük ölçüde yeniden düzenlendi. Salmonella'nın neden olduğu filamentler veya eleklerden oluşan stabilize bir ağ oluşturuldu ve çoğu mp'nin tübüler yapılar içinde biriktiği bulundu.

Mutant suşlar, enfeksiyondan sekiz saat sonra farklı davranışlar sergiledi. SSAV mutant suşu, VAE veya SCV içeren salmonella içinde hapsedildi. Hiçbir elek oluşmamış olsa da, mp'lerin çoğunluğu hala sif için serbest geç endozomlarda veya lizozomlarda bulunuyordu.

Salmonella'nın sitoplazmaya mutant bir suş kaçışı meydana geldi ve NPS ile bakteriler arasında bir ilişki gözlenmedi. Salmonella enfeksiyonunun çeşitli evrelerinde son lizozomal sistemin erişilebilirliği incelendiğinde, sonuçlar, tüm vakalarda, içselleştirilmiş NPS'nin çoğunun bu prosedürü takiben SCV veya SIF'lerde biriktiğini göstermektedir. Diğer yöntemlerde ise mikroskobik boyundan iletim yapılabilir.

Bu, bazı nano enfekte konakçı hücrelerde ultra yapı veya zar bölmeleri gibi ek soruları yanıtlayabilir. Bu videoyu izledikten sonra, floresan nanopartiküllerin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız. Bunlar, hücre içi salmonella tarafından modifiye edilmiş konak bölmelerini etiketlemek için kullanılabilir.