Kırmızı Un Beetle Larva RNA Girişim, Tribolium castaneum

Bu prosedürün genel amacı, larva vücut boşluğuna çift sarmallı RNA çözeltisi enjekte ederek kırmızı çiçek böceği trium cadium'daki RNA girişimi yoluyla ilgilenilen bir geni parçalamaktır. Bu, ilk olarak kültür çiçeğini eleyerek ve larvaları bir tohum tavasında böceklerin diğer aşamalarından ayırarak larvaların uygun aşamasını kültürden izole ederek gerçekleştirilir. İkinci adım, iğnenin ucunu kırarak, bir iğne tutucuya yerleştirerek ve önden yüklemeli, istenen konsantrasyonda çift sarmallı RNA solüsyonunu iğneye yükleyerek bir enjeksiyon iğnesi hazırlamaktır.

Daha sonra, izole edilmiş larvaları yetkilendirin ve larvaları yapışkan bir cam slayt üzerine yerleştirin. Son adım, larvalara diseksiyon mikroskobu altında çift sarmallı bir RNA çözeltisi enjekte etmektir. Sonuçta, hedeflenen genin işlevini belirlemek için istenen aşamadaki RNAi ile ilişkili fenotipler analiz edilir.

Bu tekniğin nörojenez veya transgenez gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, böceklerin vücut boşluğuna sadece basit bir çift sarmallı RNA çözeltisi enjeksiyonunun, bedo gelişiminin istenen herhangi bir aşamasında verimli ve uzun süreli gen yıkımını indükleyebilmesidir. Burada açıklanan protokol, bazı modifikasyonlarla trium castin larvalarına odaklanacak olsa da, enjeksiyon prosedürleri trium, castin ve diğer böceklerin diğer aşamalarına uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler, iyi bir iğne yapmak ve larvaları öldürmeden uygun miktarda çift sarmallı RNA solüsyonu enjekte etmek ile mücadele edeceklerdir.

Bu tekniğin görsel gösterimi kritiktir, çünkü çift sarmallı RNA enjeksiyonu ve iğne hazırlama adımlarının tanımlanması zordur ve yalnızca gözlem ve uygulama kültürü yoluyla öğrenilebilir. Ekteki metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi tercih edilen çay döküm türü. Böceklerin bir kültür şişesini hemen 25 numaralı bir elek üzerine boşaltın ve yaşlı larvaları, pupileri ve yetişkinleri toplamak için agresif bir şekilde eleyin.

Daha sonra böcekleri exus ile birlikte bir tohum tavasına aktarın ve böceklerin kaçmasını önlemek için hafifçe vurun. Şimdi, ekzusu ve çiçek parçacıklarını böceklerin yüzeyinden çıkarmak için tohum tavasının üzerine hafifçe üfleyin. Yerleşmek için tohum tavasına dokunun.

İçindekiler. Daha hareketli yetişkinlerin yığından çıkmasını bekleyin ve pupi açısını ayırmak için onları çıkarın, tava hafifçe aşağı bakacak şekilde. Pupi'yi yuvarlamak ve çıkarmak için hafifçe vurun, tohum tavasında sadece larvaları bırakın.

Şimdi izole edilmiş larvaları temiz bir Petri kabına yerleştirin. Mikroskop altında enjeksiyon için istenen larva aşamasını seçin ve yetkilendirmeye kadar bir Petri kabında tutun. Böceklerin kalan aşamalarını birleştirin ve tekrar bir kültür şişesine koyun.

Çekilmiş bir cam iğneyi bir cam mikroskoba takın. Diseksiyon mikroskobu altında kaydırın. Ucun büküldüğü yeri bulun.

Alanı hafifçe uç tarafına doğru tutun ve larva kütikülünün optimum penetrasyonu için kırmak için bükün, çapı yaklaşık 0,05 milimetre olan açılı bir açıklığa sahip bir iğne seçin. Şimdi iğne tutucunun ucunu sökün. İğnenin arka ucunu tutucu uca ve lastik contayı tutucu ucun altına yerleştirin.

Ardından, lastik contanın açıklığa yerleştirildiğinden emin olarak iğnenin arkasını tutucuya yerleştirin. Ucu tekrar tutucuya vidalayın. Şimdi monte edilmiş iğne tutucuyu iğne manipülatörüne yerleştirin.

Konumu, iğnenin ucu mikroskop görüş alanı altında ortalanacak şekilde ayarlayın. Enjeksiyondan hemen önce çift sarmallı RNA çözeltisini hazırlayın. 20 mikrolitrelik tek kullanımlık pipet ucunun ucunu kesin.

Şimdi 10 mikrolitre solüsyonu kesilmiş pipet ucuna pipetleyin. Karşı basınç sağlayarak sıvıyı uçta tutarken pipet ucunu pipetten dikkatlice çıkarın. Çift sarmallı RNA çözeltisi ile pipet ucunu mikroskop aşamasına yerleştirin.

Mikroskoptan bakarak, iğnenin ucu yüklenen pipet ucunun hemen içine ve çözeltinin içine gelene kadar yüklü ucu yavaşça iğneye doğru hareket ettirin. Ardından, iğneyi aşırı yüklemeden çözeltiyi iğneye yavaşça çekmek için enjeksiyon şırıngasının pistonunu yavaşça geri çekin. DS RNA çözeltisinin ucu iğnenin ucuna yaklaşırken, iğne tutucusuna hızlı bir şekilde alınmasını önlemek için iğnenin ucu havaya ulaşmadan önce çekme hızını yavaşlatın ve çözeltiyi yüklemeyi durdurun.

Enjeksiyon şırıngası ve iğne tutucusundan basıncı çıkarmak için durdurma musluğunu açın. Ardından pipet ucunu iğnenin ucundan uzaklaştırın. Şimdi iğneyi tablaya kaldırın ve boşalan pipet ucunu mikroskop tablasından çıkarın.

Larvaları e yetkilendirme sepetine yerleştirin ve ardından sepeti eter şişesine yerleştirin ve kapağı kapatın. Üç dakika sonra larvaların hareket edip etmediğini kontrol edin. Hala hareket ediyorlarsa, 30 saniye daha eter şişesine geri koyun.

E yetkili larvaları sepetten yapışkan bir cam sürgünün yapışmaz kenarına aktarın. Larvaları sırayla slayta aktarın. Her birini yanlamasına yerleştirin.

Forseps ile gövdeyi baştan kuyruğa hafifçe vurun ve larvaları slayta sabitlemek için hafifçe gerin. Şimdi hazırlanan slaydı mikroskop tablasına yerleştirin. Çift sarmallı RNA yüklü iğneyi, larvaları iğneye doğru hareket ettirmek için aşamayı kullanarak larvaların sırt tarafına nazikçe yerleştirin.

Ardından DS RNA için iğneyi hafifçe geri çekin. Larva vücut boşluğuna girmek için, larvalar yeşile dönene ve gergin ve dolu görünene kadar enjeksiyon şırıngasını hafifçe itin. Daha sonra, enjeksiyon şırıngasını hafifçe geri çekerken iğneyi larvalardan çıkarın.

Slayttaki tüm larvaları enjekte edin. Başarılı bir şekilde enjekte edilmeyen larvaları çıkardığınızdan emin olun. Enjekte edilen larvaları, tüm larvalar E yetkilendirmesinden kurtulana kadar bir kenara koyun.

Şimdi larvaları baştan kuyruğa nazikçe kaldırın, temiz bir Petri kabına aktarın ve enjeksiyon yarasının pıhtılaşmasına izin vermek için en az 10 dakika bırakın. Daha sonra kültür, enjekte edilen larvaları% 70 nem ile 30 santigrat derecede kültürleyin. RNAI fenotipleri için larvaları düzenli olarak gözlemleyin.

Bu örnekler, yeşil çift sarmallı RNA solüsyonu ile uygun boyutta bir enjeksiyon iğnesi ile son instar larvaya yapılan enjeksiyonların değişen başarı seviyelerini göstermektedir. İğne ucu larva kütikülüne minimum dirençle nüfuz eder ve yeşil DS RNA çözeltisi herhangi bir sızıntı olmadan larvalara akar. PU 11 suşunda, geliştirilmiş sarı floresan proteini, çift sarmallı RNA enjeksiyon deneyleri için iyi bir pozitif kontrol görevi görebilir.

Son larva aşamasında EYFP DS RNA enjekte edildiğinde, gelecekteki kanat ilkelinde EYFP sinyalinde önemli bir azalma, enjeksiyondan bir gün sonra gözlemlenebilir. EYFP ekspresyonunun yıkılması genellikle enjeksiyondan iki gün sonra gözlemlenebilir ve DS RNA konsantrasyonu yeterince yüksekse, öğrenci aşaması boyunca ve böceğin ömrü boyunca devam edecektir. EYFP endojen olmayan bir gen dizisi olduğundan, bu gen morfolojik veya fizyolojik bozulmalara neden olmaması gereken negatif bir kontrol olarak da kullanılabilir.

Bu deneyde, kritik bir kanat geni olan körelmiş çift sarmallı RNA, sondan bir önceki aşama larvalara enjekte edildi. Kanat yapılarının tamamen kaybının öğrenci aşamasında gözlenebileceğini unutmayın. Ortaya çıkan yetişkin ayrıca kanat yapılarından tamamen yoksundur.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu prosedür sonrasında düzgün bir şekilde yapılırsa bu teknik iki saatten daha kısa sürede yapılabilir. Kantitatif gerçek zamanlı PCR, in situ hibridizasyon veya immünohistokimya gibi diğer yöntemler, hedeflenen gen tarafından hangi genlerin düzenlendiği gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Bu teknik, araştırmacıların karmaşık genetik teknikler kullanmadan traum kastında fonksiyon kaybı analizi ve embriyonik sonrası aşamaları gerçekleştirmelerinin yolunu açtı.

Bu yöntemin basit doğası, onu bir öğretim ortamına da oldukça uygulanabilir kılar. Bu videoyu izledikten sonra, enjeksiyon için uygun sevgi aşamasının nasıl seçileceğini, bir enjeksiyon iğnesinin nasıl yapılacağını ve çift standart RNA'nın izin verilen enjeksiyonunu başarıyla nasıl gerçekleştireceğinizi iyi anlamalısınız. Bu protokol, Gen'in işlevini Trium'daki RNI seviyesi aracılığıyla değerlendirmenize izin verecektir.