Orofasial fenotipleri Niceleme Xenopus

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, xap Levis embriyolarının oral yüz fenotiplerini kantitatif istatistiksel bir şekilde tanımlamaktır. Bu, önce görüntüleri kullanarak fotoğraf dokümantasyonu için ayrılmış xip embriyo kafalarının bir kil kalıba monte edilmesiyle elde edilir. Ağız yüz bölgesinin büyüklüğü hakkında bilgi vermek için yüz ölçüleri ölçülür.

Daha sonraki yer işaretleri, oral yüz bölgesinin şeklini değerlendirmek için geometrik morfometri yoluyla uygulanır. Sonuçlar, yüz boyutlarının ve göreceli dönüm noktası konumunun istatistiksel analizlerine dayalı olarak Opus oral yüz bölgesinde önemli boyut ve şekil değişiklikleri göstermektedir. Bu yöntem opus veya yüz gelişimi hakkında fikir verebilse de, evrimsel veya ekolojik amaçlar için yakından ilişkili türlerin karşılaştırılması gibi diğer omurgalı morfolojisi çalışmalarına da uygulanabilir.

Bu bölüm, fotoğraf dokümantasyonu için embriyo kafalarını tutmak için kil çizgi tabaklarının nasıl yapılacağını özetlemektedir. İlk olarak, herhangi bir boyutta yapılacak bir tabağa biraz modelleme kilini düzleştirin ve tüm plakayı kaplayacak şekilde düzeltin. Ardından düz bir alay iğnesini kile 45 derecelik bir açıyla hafifçe bastırın.

İğneyi sıkıca tutun ve bastırılmış bir çizgi oluşturmak için tabağı yavaşça hareket ettirin. Ardından, her çizgi boyunca sığ dairesel çöküntüler yapmak için bir cam pipet kullanın. Her çöküntüde, yüklemeden önce bir embriyo başı yerleştirilebilir.

Kafalar tabağı PBT ile doldurdu. Zap çişinin kültürlenmesine ilişkin ayrıntılar, embriyoların sabitlenmesine ilişkin ayrıntıların yanı sıra metin protokolünde özetlenmiştir. Bu protokol için embriyoları 42. ve 45. aşamalar arasında sabitleyin.

İlk olarak, sabit embriyoları yaklaşık 100 mililitre PBT içeren 150 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Şimdi onların kafalarını kes. İlk olarak, bir çift forseps ile bir embriyo tutun ve bağırsağın arka tarafında bir kesi yapmak için bir neşter kullanın.

İkinci olarak, başı tamamen çıkarmak için bağırsağın ön tarafında kalbe yakın bir kesi yapın. Bir pipet kullanarak kafaları kil çizgi kabına aktarın. Embriyo kafalarının kile fotoğrafçılık için tam olarak aynı yönde yerleştirilmesi çok önemlidir.

Başarıyı sağlamak için, kilde çizilen sıraları kılavuz olarak kullanın. Aynı kişinin tüm görüntüleri aynı gün içinde çekmesi de faydalıdır. Önden görünüm için, fotoğraflar çöküntülerde başları arka tarafa aşağı doğru konumlandırır.

Kafaları ve çevresindeki kili manipüle etmek için forseps kullanın, böylece kafalar kameraya bakacak şekilde sabitlenir ve yanal görünüm için eğilmez. Fotoğraflar, kafaları, yanları aynı yöne bakacak şekilde konumlandırır. Kafaları ve çevresindeki kili manipüle edin, böylece çimento bezlerinin hepsi aynı açıyla aşağı bakar.

Şimdi görüntü yakalama özelliğine sahip herhangi bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, kurbağa yavrusu kafalarının görüntülerini toplayın. Aşırı gölgelenmeyi önlemek için birkaç ışık kullanın ve mümkün olan en yüksek büyütmeyi kullanın. Her kafayı aynı şekilde fotoğraflayın.

Ardından görüntüleri sıkıştırılmamış ve mümkün olan en yüksek çözünürlükte kaydedin. Görüntülerden ağız yüz boyutlarını ölçün. İlk olarak, yüz genişliğini belirleyin.

Her bir gözün ventral kısmının yüzün çevresiyle buluştuğu noktaları belirleyin ve bu noktalar arasındaki mesafeyi ölçün. Yüz yüksekliğinin ve oral yüz alanının ölçülmesiyle ilgili ayrıntılar metin protokolünde bulunabilir. Burun uzunluğunun belirlenmesine özellikle dikkat edin Yanal görüntülerde, gözün ön tarafını işaretleyen dikey bir çizgi yapın.

Ardından, yüzün çimento bezinin dorsal kenarı ile buluştuğu en ön noktadan gözün ön tarafını işaretleyen dikey çizgiye kadar olan yatay mesafeyi ölçün. Ağız genişliği ve yuvarlaklık gibi diğer boyutlar bu analiz için metin protokolünde açıklanmıştır, yüz yer işareti koordinatları standartlaştırılmalı ve bir dosyaya kaydedilmelidir. Yer işaretleri görüntünün şeklini yakalamalı ve tüm görüntülerde kullanılabilir olmalıdır.

Bu nedenle, tüm örneklerde bulunmayabilecek yapıları kullanmayın. Şimdi ilk görüntü dosyasını açın. Değerlendirmek için ana araç çubuğundaki eklentiler sekmesini seçin ve nokta seçiciyi seçin.

Açılır menüden nokta ekle sekmesini seçin ve yer işareti noktalarını görüntünün üzerine yerleştirin. Çok renkli olarak görünürler. Haçlar, haç taşıma aracını kullanarak yer işareti noktaları arasında geçiş yapar.

Hepsi yerleştirildikten sonra, ana araç çubuğundaki sonuçları görüntüle sekmesini seçin ve göster seçeneğini seçin. Bu, yer işareti koordinatlarını görüntüler. Ardından, koordinatları, yapıştırılan LM eşittir veri türünün üzerindeki boş bir satırda bir elektronik tablo programına kopyalayın ve ardından aşağıdaki satırda yer alan örnekteki yer işaretlerinin sayısını kopyalayın.

Yapıştırılan veri türü kimliği eşittir ve ardından örneği tanımlayan ad gelir. Her örneğin benzersiz bir tanımlayıcısı olmalıdır. Tüm örnek görüntüler eşlenene ve elektronik tabloya girilene kadar bu işlemi tekrarlayın.

Ardından, her bir yer işaretinin örnek bir kimliği ve koordinatları ile sütunları kopyalayın ve bir metin belgesine kaydedin. Ardından morfometrik yazılım programını açın. Bu yazılımda, ana menüden yeni veri kümesi oluştur'u seçin.

Açılan ekranda dosyayı ve veri kümesini adlandırın ve dosyayı TPS olarak içe aktarın. Şimdi veri kümesini oluşturmak için koordinatlardan oluşan bir metin dosyası seçin. Ardından, bir procrustes uyumu ve hizalaması gerçekleştirin.

İlk olarak, proje ağacı sekmesindeki veri kümesini vurgulayın. Ardından ana araç çubuğunda ön hazırlıkları seçin ve açılır menüden yeni procrustes sığdırın. Mevcut seçimlerden İlke eksenine göre hizalanmış'ı seçin.

Ardından, ön hazırlıklar açılır menüsünde crusty's fit back gerçekleştirme seçeneğini seçin, Covance matrisi oluştur'u seçin ve Yürüt'ü seçin. Şimdi sonuçlar sekmesinden Covance matrisinin korelasyonlarını görüntüleyin. Deney ve kontrol grubu örneklerini ayırt etmek için, veri kümesindeki her bir örneği uygun sınıflandırıcı değişkene atayarak bir sınıflandırıcı dosyası oluşturun.

Bir e-tabloda, kimlik etiketli bir sütun oluşturun ve tedavi etiketli bir sütun oluşturun. Ardından her bir örneği Kimlik sütununda listeleyin ve bir gruba atayın. Tedavi sütununun altında, bunu bir metin dosyası olarak kaydedin ve morfometrik yazılım programında, tanımlayıcıya göre eşleşmeyi seç seçeneği aracılığıyla içe aktarın.

Şimdi karşılaştırma sekmesinin altında, açılır menüde bir diskriminant fonksiyon analizi dönüşümü oluşturun. Bu fonksiyon altında, uygun veri setinin seçildiğinden ve veri türünün procrustes fit koordinatları olduğundan emin olun. Karşılaştırılacak grup çiftlerini vurgulayın ve ardından 1000 permütasyon testi yapın.

Koordinatların vektör haritasını görüntülemek için grafikler menüsüne gidin ve şekil farkı sekmesini seçin. Görüntü ters çevrilmişse, diyagramı doğru yöne çevirmek için çizim alanındaki açılır menüyü açın. Ayrıca, açılır menüde, vektörleri bir ızgara üzerine bindirmek için grafiği bir dönüştürme ızgarasına dönüştürün, bir ilke bileşen analizi oluşturmaya ilişkin ayrıntılar.

Dağılım grafiği ilkesi bileşen analizi. Dönüşüm ızgaraları CVA, dağılım grafiği ve CVA dönüşüm ızgaralarının tümü metin protokolünde sağlanır. Embriyolar, gelişimsel evre 24'ten evre 30'a kadar bir mikromolar retinoik asit reseptörü veya RAR inhibitörü ile tedavi edildi ve daha sonra evre 42'de sabitlendi ve DMSO ile tedavi edilen fotoğraflanmış kontrol embriyoları geliştirildi.

Normalde, RAR inhibitörü tedavisi yüz, göz anormalliklerinin daralması ve hatalı biçimlendirilmiş üçgen şekilli bir ağız ile sonuçlandı. Geometrik morfometrik bir analiz yapıldıktan sonra, varyans temel bileşen analizi ile değerlendirildi. Tedavi edilen embriyolar kontrollerden açıkça ayırt edildi.

PC'nin bir ekseni boyunca, oklar bir grup içindeki istatistiksel aykırı değerleri tanımlar. Morfolojik farklılıklar daha sonra bir diskriminant fonksiyon analizi ile değerlendirildi. Yanal yer işaretlerinin konumundaki dramatik değişimler, yüz şeklinin daraldığını gösterir.

Burun deliği pozisyonunda dışa doğru hafif bir kayma oklarla not edilir. Orta yüz bölgesinde de dikkat çekici bir eğrilik vardır. Bu videoyu izledikten sonra, Theus embriyonik yüzünün boyutunu ve şeklini değerlendirmek için geleneksel boyut ölçümleri ve geometrik morfometrinin bir kombinasyonunun nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.