Name: Kullanımı Geleneksel Hikaye ve Roman Yerleşimi Sistemleri: Plak Tahliller sayesinde viral Konsantrasyon Tayini (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Öğrenin, plak tahlilleri ile viral konsantrasyon tayini yöntemini; sıvı mikrokristalin selüloz örtü kullanarak yüksek verimli uygulamalarda viral titrasyonu nasıl kolaylaştıracağınızı keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Avicel'in ürün numuneleri için FMC BioPolymer USA'ya teşekkür ederiz. Bu çalışma, Savunma Tehdidi Azaltma Ajansı'nın KK'ya HDTRA1-13-1-0005 hibesi ve KK'ya NIH araştırma hibesi 1R15AI100001-01A1 aracılığıyla desteklenmiştir.

Hücreler ve Reaktiflerin hazırlanması 1. <ol><li> % 100 konfluansa - bir gün önce, söz konusu virüs için tahlil, levha, uygun konakçı hücrelerde (Tablo 1 ve 2) kullanılarak, 90 için. </li><li> DH 2 O% 10 formaldehit tespit solüsyonu hazırlayın Örnekte, 14.44 ml damıtılmış H2O (DH 2 O) ile% 36 stok formaldehid 5.56 ml karıştırın. NOT: Uygun güvenli kullanım uygulamaları ve havalandırma formaldehit kullanılarak. </li><li> Kristal mor leke hazırlayın:% 1 Crystal Violet (CV)% 20 etanol ve dH 2 O </li><li> 2x plak ortam (2x konsantrasyonda bağımlı hücre tipi, Tablo 2 ye bakınız) hazırlayın. Herhangi reaktifler steril değilse 0.2 mikron filtre kullanarak filtre. </li><li> Hareketsizleştirir bindirmeleri hazırlanması (Tablo 3) <ol><li> Sıvı bindirmeleri için, dH 2 O Avicel&#39;e bir steril% 2.4 solüsyonu yapmak Kümeleşmesini önlemek üzere, inci su ihtiva eden bir şişeye tozu ilavehızlı bir karıştırma çubuğuna sahip olan karıştırma ile, yavaş yavaş Avicel dökün ve oda sıcaklığında (RT) hızlı bir şekilde karıştırıldı. Çözelti bir karıştırma çubuğu homojenize etmek için çok viskoz kaldığı zaman bile homojenleştirilme yoğun çalkalama ile&gt; 30 dakika boyunca bir şişeye bir karıştırıcı geçin. Not: stok çözeltileri daha düşük konsantrasyonlarda yapılabilir, fakat solüsyonlar ayrı olabilir ve homojen hale getirilmesini sağlamak için karıştırılmalıdır gerekecektir. Avicel çalışma solüsyonları 0.6-3% arasında değişen kullanılabilir. </li><li> Homojenizasyon sonra, oda sıcaklığında kapalı çözüm ve mağaza otoklav. </li><li> Agaroz ve karboksimetil selüloz (CMC), şablon için, dH 2% 2 CMC ya da% 0.6 agaroz O içinde bir stok çözelti hazırlayın. Çözüm haline getirmek için bir karıştırma çubuğu ve otoklav veya mikrodalga ile karıştırın. </li></ol></li></ol> 2. Seyreltmeler ve Enfeksiyonlar <ol><li> Günlük kuluçkadan sonra görsel olarak Deneye başlamadan önce, hücrelerin birleşik duruma ve yaşayabilirliğini de kontrol edin. Standart hücresel morfoloji a sağlamaknd ~% 90 sık tek tabaka mevcuttur. </li><li> Bulaşıcı örneklerin on kat seri seyreltme gerçekleştirin. Seyreltici (Tablo 2) gibi viral çoğalma için bir hücresel büyüme ortamı kullanın. Söz konusu virüsün beklenen titresi dayalı gerekli seyreltilerin sayısını Vary, ve her zaman bağımsız plak kimlik hücresel canlılığı ve yardım sağlamak için bir bulaşmamış kontrol örneği kullanın. </li><li> Seri seyreltiler kaynaktan, 1 saat karıştırıldı (Tablo 1) 45 dakika boyunca hücreleri enfekte etmektedir. Mümkün olduğu kadar düşük bir hacmini tutan tek tabaka (Tablo 4), viral temasını maksimize etmek için ise, hücreleri kapsayacak şekilde aşı yeterli bir hacmi kullanın. Yavaşça kaya plakaları her 20 dk kapsama hatta sağlamak ve kuruma hücresel tek tabaka önlemek için. </li><li> 2x plak medya ve Hareketsizleştirme 1 karışımını: Enfeksiyondan sonra, 1 kullanılarak (Tablo 2) &#39;de mikroorganizma doğrudan ortam hareketsiz uygun bir hacim kaplamasıseçim kaplamasını ing (CMC, agaroz ya da Avicel®). Hafifçe karıştırın sallayın. <ol><li> 0,6-1,2% Avicel bindirme orta çalışan bir çözüm elde etmek için% 2.4 RT stok Avicel&#39;e - ısındı 2x plak medya ve 1.2 ile 1: Sıvı paylaşımları, 1 karıştırın. </li><li> 0.3 nihai bir agaroz / katlamalı konsantrasyonu elde sıcaklığına dengelenmeye 30 dakika için 56 ° C su banyosu içinde ısıtıldı 2x plak ortam 1 karışımını ısıtıldı% 0.6 agaroz içinde bir stok çözeltisi, yeri: bir agaroz bindirme için, 1 kullanın %. </li><li> CMC için, bir% 2 stok solüsyonu hazırlanır ve agaroz bindirme için tarif edildiği gibi muamele. </li><li> Tabakasına bindirme uygularken, her zaman tek tabaka zarar görmesini önlemek için 56 ° C su sıcak agarozun veya CMC dengelenmesi. Solüsyon sıcak olduğundan emin olun, ancak hücre ölümü ve düşük viral titreleri önlemek için dokunulmayacak kadar sıcak değil. En agaroz bindirmeleri, 42 ° C&#39;nin altında katılaşmaya başlar hızlı çalışır ve / veya taşıma sırasında katılaşma önlemek için küçük gruplar halinde hazırlayacaktır. </li></ol></li><li> Kaplamanın ilave edildikten sonra, açıkça sayılabilir olan ayrı plaklar üretmek üzere inkübe edin. Plak oluşumu, virüse bağlı olarak 2-14 gün analiz ediliyor Tablo 1 alabilir. NOT: Sıvı Kaplanmış plakalar inkübatör konduğunda, onları hareket yok. Kuluçka süresi boyunca sıvı bindirmeleri hareket smear istilanın neden olur. Agaroz ve CMC bindirmeleri yarı katı ve taşınır veya plak gelişimini izlemek için bir ışık mikroskobu altında periyodik olarak kontrol edilebilir. </li></ol> 3. Tespit ve Boyama Hücreler <ol><li> , Hücrelerin tespit edilmeleri dökülür ya da Avicel bindirme havalandırın, ve (6 delikli plaka için &lt;1 mi, her bir kuyucuk) bir karışımı, 30 dakika boyunca% 10 formaldehid çözeltisi kullanılarak hücreleri düzeltmek için. <ol><li> Agaroz veya CMC için, doğrudan 1 saat gecede için bindirme için formaldehit çözüm ekleyin. NOT: Örnekler sabitleştirici uzun süre muhafaza edilebilir yapar sağlananbuharlaşması ve bu tek tabaka bozabilir gibi kurumaz. </li></ol></li><li> Önceki boyama ve tespit sonrasında, formaldehit atmak ve bir spatula ile manuel akan su ya da biriyle agaroz ve CMC&#39;nin yarı katı fişlerini çıkarın. Boyamadan önce bakiye katlamalı / fiksatif çıkartılması için su ile Avicel® plaklar durulayın. </li><li> Boyama için, ~ 15 dakika boyunca kristal menekşe renkli çözelti bir az miktarda hücreleri kapsar. Rock plates gerekirse bile kapsama sağlamak. </li><li> Yavaşça su ile kristal mor leke yıkayın. Bir kez, sabit, lekeli ve gelecek analizi için süresiz, mağaza plaklar kurutulmuştur. </li></ol> 4. viral titreleri belirlenmesi <ol><li> Aynı seyreltme teknik kopya için ortalaması alınarak, herbir göz içindeki plaklar sayın. Büyük levha formatları için, 100 plaklardan çok daha 5 daha az veya daha büyük indirim kuyu. Plak boyutu ve morfolojisi not alın. Negatif kontrol düzgün bir tek tabaka olmalıdır vebir referans kontrol olarak kullanılabilir. </li><li> Bir seyreltme ve toplam seyreltme faktörü ters için plakların ortalama sayısı dikkate alınarak bir stok örneğinden viral titresi belirlenir. </li></ol><img alt="Denklem 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52065/52065eq1.jpg" width="300" /> NOT: Bir örnek olarak, 30 ve 32 plaklar, 1 x 10 -7 seyreltme [31 (ortalama) / 10 -7 (dilüsyon) x 0.4 mi (inokulum)] 7,75 arasında bir titreye oluşacaktır 8 x 10 pfu tekrarlar için sayılan / ml olmuştur.

<ol><li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plaque+assay+of+animal+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Virus+Res%22%5BJournal%5D)">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li>
<li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+problems+of+animal+virology+as+studied+by+the+plaque+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Symp.+Quant.+Biol%22%5BJournal%5D)">Some problems of animal virology as studied by the plaque technique.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).</li>
<li>Hartley, J. W., Rowe, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+culture+cytopathic+and+plaque+assays+for+mouse+hepatitis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Soc.+Exp.+Biol.+Med.+Soc.+Exp.+Biol.+Med.+N.+Y%22%5BJournal%5D)">Tissue culture cytopathic and plaque assays for mouse hepatitis viruses.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. Soc. Exp. Biol. Med. N. Y. 113, 403-406 (1963).</li>
<li>Juarez, D., Long, K. C., Aguilar, P., Kochel, T. J., Halsey, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+plaque+assay+methods+for+alphaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Assessment of plaque assay methods for alphaviruses.</a> J. Virol. Methods. 187, 185-189 (2013).</li>
<li>Shurtleff, A., Keuhne, A., Biggins, J., Keeney, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+alternative+overlays+in+plaque+assays%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Use of alternative overlays in plaque assays.</a> , USAMRIID. Fort Detrick, MD USA. (2011).</li>
<li>Shurtleff, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+the+Filovirus+Plaque+Assay+for+Use+in+Preclinical+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Standardization of the Filovirus Plaque Assay for Use in Preclinical Studies.</a> Viruses. 4, 3511-3530 (2012).</li>
<li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Virol.+J%22%5BJournal%5D)">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virol. J. 3, 63(2006).</li>
<li>Klebe, R. J., Harriss, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technically+simple+%E2%80%98non-lethal%E2%80%99+vital+staining+procedure+for+viral+plaque+and+cell+transformation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Virol%22%5BJournal%5D)">A technically simple ‘non-lethal’ vital staining procedure for viral plaque and cell transformation assays.</a> Arch. Virol. 81, 359-362 (1984).</li>
<li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+and+plaque+assay+of+influenza+virus+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells.</a> Appl. Microbiol. 16, 588-594 (1968).</li>
<li>Abiko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreak+of+Human+Metapneumovirus+Detected+by+Use+of+the+Vero+E6+Cell+Line+in+Isolates+Collected+in+Yamagata%2C+Japan%2C+in+2004+and+2005%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Outbreak of Human Metapneumovirus Detected by Use of the Vero E6 Cell Line in Isolates Collected in Yamagata, Japan, in 2004 and 2005.</a> J. Clin. Microbiol. 45, 1912-1919 (2004).</li>
<li>Baer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+DNA+damage+signaling+upon+Rift+Valley+fever+virus+infection+results+in+cell+cycle+arrest+and+increased+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Induction of DNA damage signaling upon Rift Valley fever virus infection results in cell cycle arrest and increased viral replication.</a> J. Biol. Chem. 287, 7399-7410 (2012).</li>
<li>Austin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Activation+following+Rift+Valley+Fever+Virus+Infection+Contributes+to+Cell+Death+and+Viral+Production%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">p53 Activation following Rift Valley Fever Virus Infection Contributes to Cell Death and Viral Production.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Böttcher-Friebertshäuser, E., Stein, D. A., Klenk, H. -D., Garten, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+influenza+virus+infection+in+human+airway+cell+cultures+by+an+antisense+peptide-conjugated+morpholino+oligomer+targeting+the+hemagglutinin-activating+protease+TMPRSS2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2.</a> J. Virol. 85, 1554-1562 (2011).</li>
<li>Youil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+influenza+virus+replication+in+Vero+and+MDCK+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines.</a> J. Virol. Methods. 120, 23-31 (2004).</li>
<li>Tobita, K., Sugiura, A., Enomoto, C., Furuyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plaque+assay+and+primary+isolation+of+influenza+a+viruses+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells+%28MDCK%29+in+the+presence+of+trypsin%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Microbiol.+Immunol.+%28Berl.%29%22%5BJournal%5D)">Plaque assay and primary isolation of influenza a viruses in an established line of canine kidney cells (MDCK) in the presence of trypsin.</a> Med. Microbiol. Immunol. (Berl.). 162, 9-14 (1975).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur ve açıklanan protokol veya ürünlerle ilgili herhangi bir rakip veya mali çıkarı yoktur.

Koşulları önemli ölçüde değişebilir gibi başarılı bir plak tahlili için en kritik faktör söz belirli viral kültür için protokol optimizasyon yatıyor. Dikkate almak temel noktalar şunlardır: açıkça plaklar farklılaştırmak için söz konusu virüs, uygun viral büyüme koşulları, yeterli seyreltme aralıkları ile hücresel uyumluluk ev sahipliği, ve söz konusu hücreler ve virüs için doğru bindirme seçimi ve boyama. VEEV ve RVFV hem aynı konak hücre tiplerinin çok kullanan çok benzer koşullar altında büyürken, plak morfolojisi ve büyüme kinetiği farklılıklar büyük ölçüde değişmektedir. Geleneksel hemorajik ateş virüsleri ve alfavirüsler bir yayılım ve endikatör hücre hattı olarak kullanılmıştır Plak analizi için, Vero hücreleri kullanıldığında, tipik haliyle VEEV RVFV daha yüksek titrelere kadar büyür ve 48 HPI 4 de büyük düzgün plaklar, geliştirme, çoğaltma kinetik artış ortaya koyduğunu, 10-12. VEEV aksine, RVFV 72 HPI gerektirir ve tipik olarak boyut olarak daha küçük ve değişken olan plaklar gösterir. RVFV karşı ve VEEV olarak, influenza virüsü yüksek konakçı hücre spesifiktir ve doku kültürü yoluyla yaymak için zor olabilir. Grip virüsü için viral giriş ve füzyon normal olarak ev sahibi hücrenin α-sialik asit yüzey reseptörüne bağlanma yoluyla hedef hücreye girişini aracılık viral glikoprotein hamagglutinin (HA) ile hücre yüzey reseptörünün bağlanması ile başlatılır. HA tüm influenza virüsleri membran zarfı içinde mevcut olan ve spesifik bir konakçı hücre proteazı ile alt birimi HA1 ve HA2 bölünme gerektirir trimerik glikoproteinidir. Ayrıca sorunu karmaşık hale getirmektedir, bu bölünme siteleri genellikle viral suşlar 13 arasında değişebilir. Belirli bir doku ile sınırlı olduğunu HA bölebilen proteazların ekspresyonu gibi, ar proteazlarE, genellikle, seçilen konakçı hücrede 13 viral füzyonu ve girişi kolaylaştırmak için, hücre kültür ortamına ilave edildi. Viral HA 14,15 proteolitik aktivasyonu ile (herhangi bir tripsin inaktive serum yokluğunda) çoklu-döngü replikasyonu kolaylaştıran: deneme için TPCK-tripsin MDCK ve Vero hücreleri hem de hücre kültüründe kullanıldığı yaygın olarak kullanılan bir proteazın bir örnektir. Bu çalışma ve diğerlerinin de gösterildiği gibi, virüs yaşam döngüsünün farklılıklar farklı sınıfları ve virüsleri türler arasında büyük farklılıklar göstermek üzere katlamalı seçimleri, levha biçimleri ve toplama süreleri etkileyebilir. Bizim çalışmamızda, agaroz kaplamaları virüs ve hücre tiplerinin geniş bir yelpazede arasında yararını takviye edici, CMC ya da RVFV ve grip B virüsü, hem sıvı, şablon ya da daha yüksek titrelerde açık plaklar gösterdi. Büyük ölçüde katı fişleri ve basitleştirilmiş lekelenmeye giderilmesinde destekli agaroz düşük bir nihai konsantrasyon kullanma. CMC Genel p gösterdiİnfluenza B virüsü için her üç test virüsler ve üretilen çok küçük ve belirsiz plaklar için bir kaplama olarak oorest etkinlik. Genel CMC, en az arzu edilen özellikleri göstermesine rağmen, hızla büyüyen ve titresi sadece minimal bir azalma ile plak boyutunu azaltmak için görünür olduğu gibi son derece öldürücü virüsler, avantajlı olabilecek kullanımı. Sıvı kaplama bunun kullanım kolaylığı artan hazırlamak son derece basit olduğunu en çok yönlü olduğunu kanıtladı, ve seçilen virüslerin tamamında agarosa karşılaştırılabilir. Daha yüksek geçirimli bir 96 kuyucuklu bir plaka biçiminde, uygulama ve çıkarmaya geleneksel bindirmeleri ile olduğu gibi, katılaşma nedeniyle engellenmiştir, doğru ve tutarlı sonuçlar verilmemiştir. Plakalar daha önce karakterize çoğaltma kinetik olan virüslere bu uyarlamayı sınırlayıcı, toplama noktasına kadar hareket olamaz gibi sıvı bindirmeleri kullanan bir göz opak renk ve plak oluşumunu izlemek için yetersizlik yatıyor. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; plak deney koşullarında küçük değişiklikler sonuçlar önemli ölçüde değiştirebilir ve herhangi bir yeni sistem veya teknik değerlendirme ve performans her zaman garanti edilir. Optimize edilmiş ve standardize plak tahlil protokolü her durum için mevcut değil iken daha fazla kullanıcı değişiklikler için yeterli altyapıya sağlarken, bizim rapor, çok yönlülük ve geleneksel kullanım yanı sıra plak deneyleri için yeni sıvı bindirmeleri kolaylığı göstermek.

Canlı viral örneklerin doğru izolasyon ve miktar tutarlı viroloji devam eden bir araştırma hedefi olmuştur. İlk 1,2 geliştirilen bir araç nicelik ve nitelik hayvan viral titreleri hesaplamak için 1952 yılında plak denemesinin gelişiyle kadar değildi. Bu teknik ilk olarak adapte ve daha önce bitki biyolojisi 1,2 stok bakteriyofajların titreleri hesaplamak için kullanılır olmuştu faj deneyleri, modifiye edildi. Viral tayini için alternatif vasıtalar bu yana bu tür bağışıklık, floresans ve transmisyon elektron mikroskopisi, ayarlanabilir darbe dirençli algılama (TRPS) olarak geliştirilmiş ve adapte edilmiş olmakla beraber, sitometrisi yeniden birleşmiş muhbir sistemleri, akış ve kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) bu yöntemler, kopyelemeye yetkin Virionlar 1,3 tanımlama ve miktarını belirlemede başarısız olur. Teknolojiler ve teknikler gelişmeler rafine ve görünümünü değiştirecek devam ederken; plaque deneyleri bulaşıcı litik Virionlar 1,4 viral konsantrasyonlarını belirlemede altın standardı temsil etmeye devam. Bir plak deneyi esnasında, konakçı hücrelerinin konfluent tek tabaka seri 5-100 virionlann arasında tipik haliyle, bir sayılabilir dizi seyreltildikten bilinmeyen bir konsantrasyonda bir litik virüs ile enfekte edilir. Enfekte tek tabakalar daha sonra gelişigüzel virüs yayılması sırasında, sıvı ortamın mekanik ya da konveksiyon akımı ya da yayılan viral enfeksiyonunu önlemek için bir hareketsizleştirme katlamalı ortamı ile kaplıdır. Örneğin agaroz, metil selüloz ya da karboksimetil selüloz (CMC) gibi katı veya yarı-katı kaplamalar geleneksel olarak kullanılmış olsa da, sıvı kaplamalar, Avicel 5 ila 7 olarak yararlı olan yeni bir sıvı bindirmeleri gelişmesiyle giderek daha çekici bir alternatif haline gelmiştir. Bindirme olabilir gibi geleneksel bindirmeleri karşı sıvı kullanan plaka tahlilleri appl çeşitli avantajları vardırOda sıcaklığında, ve uygulama ve boşaltılması esnasında ied önemli ölçüde daha kolaydır. Sıvı bindirmeleri ısınma gerekmez gibi, hassas ve ısıya dayanıksız virüsler de plak daha kolay ortaya çıkabilir. Ilk enfeksiyon ve hareketsizleştirici yerleşimi, tek tek plaklar veya hücre ölümü bölgeleri uygulanmasından sonra, viral enfeksiyon ve replikasyon çevreleyen tek tabaka ile sınırlı olan geliştirmeye başlar. Enfekte hücreler, replikasyon parçalama Enfeksiyondan döngüsü devam ayrıca artan bir ayrı ve farklı plaklar ile sonuçlanan, enfeksiyon ilerleyen olacaktır. Kullanılan viral büyüme kinetikleri ve konakçı hücreye bağlı olarak, görünür bir leke, normal olarak 2-14 gün içinde oluşturacaktır. Hücresel monokatmanlar kolayca çıplak gözle plaklar tanımlamak için daha sonra standart bir aydınlık alan mikroskobu ile sayılabilir, ya da daha tipik nötr kırmızı veya şiddet kristal sabit ve zıt olabilir. Mevcut plak karşı lekeleri çok çeşitli, her sunan inci varEIR özgü avantajları ve dezavantajları. Kristal viyole tipik haliyle karışım yapısındaki mevcut olduğu zaman, çok küçük plaklar belirlenmesine izin veren bir hızlı ve farklı karşı leke sağlayan toplama noktasında ve bindirmenin sabitleme / çıkarılmasından sonra ilave edilir. Nötr kırmızı, bilinmeyen bir virüs ya da çoğaltma kinetiği ile çalışırken yararlıdır plak oluşumu, özellikle gelişmekte olan canlı izlenmesi için izin erken uygulanması ve bir kaplama ile sürekli temas avantajına sahiptir. Biz ancak nötr kırmızı ile lekeleme, tipik bir biçimde farklı olmadığını bulduk. Sarı renkli boya lekeler koyu mavi ve viral plaklar kaplamanın kaldırılması gibi olmadan sayılabilir hücrelerin canlı olarak 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolyum bromürde (MTT), birkaç avantaj sunar nötr kırmızı. MTT ile elde canlı ve ölü hücreleri arasındaki yüksek kontrastlı, daha erken bir zaman noktası, enfeksiyondan sonraki küçük plaklar tespit edilmesine izin verir, Depolama hala bindirme 8 çıkarılmasını gerektirecek olsa da. Kristal mor basit olarak su ve alkol çözeltisi yapılmış ve karışık Plak için yüksek bir hassasiyet derecesi içerir üzere protokol biz de çok sayıda yapı kullanılarak olarak gösterdi sağlamak için, tercih edilen ve basitleştirilmiş karşı leke olarak seçti özelliği virüsleri bulunmaktadır. Enfekte hücresel mono-katman, sabitleme ve boyama sonrasında, plakalar mililitre başına plak oluşturucu birim (pfu) cinsinden viral stok numuneleri titre etmek için sayılmıştır. 5-100, plaklar bir referans olarak kullanılan bir negatif kontrol grubuna, sayılan arasında bir günlük damla, plaka boyutuna bağlı olarak, seri seyreltileri ile not edilmelidir. İstatistiksel örnekleri örnek karşılaştırarak 3 çoğaltır sayılır, her 100 plaklar için% 10 oranında değişir. Viral titreleri belirlemek için plak tahliller kullanılarak avantajı ağırlık Bulaşıcı viral parçacıkların fiili sayısı miktarını belirlemek için kendi yatmaktadırörnek ithin. Birden çok virionları ve potansiyel olarak tek bir hücre enfekte olabilir zamanda, Virionlar karşı birimleri terminolojisi plak titrasyonu ya da 1,2 sırasında kullanılır. Plak önemli ölçüde farklı gelişim koşulları altında ve viral türler arasında değişebilir. Onlar söz konusu virüsün büyüme ve virülans faktörleri hakkında değerli bilgiler sağlayabilir olarak plak boyut, berraklık, sınır tanımı ve dağıtım tüm unutulmamalıdır. Temel plak deneyi ilkelerin aynı zamanda uyarlanmış ve fokus oluşturucu tahlillerde (SYA) olarak kullanılmasında olduğu gibi, farklı şekillerde, bir dizi modifiye edilebilir. SYA&#39;leri plak oluşumunu tespit etmek için hücre erimesi ve counterstaining güveniyor değil, doğrudan doğruya etiketli antikorlar aracılığıyla hücre içi viral proteinleri tespit teknikleri immünboyama istihdam yok. Artan hassasiyet, en önemlisi litik olmayan virüsleri, her farklı olan miktarını belirlemek için yeteneği, enfeksiyondan sonra bir bekleme süresi azalmış veavantajlar SYAleri kullanıldığında. Yaygın olarak kullanılmakla beraber, geleneksel bir plak deneyi kıyasla FFAs olarak kritik sınırlayıcı faktörler, uygun antikorlar için ihtiyaç ve fiili enfeksiyon Virionlar 4 karşısında virüs protein alt-birimleri, yalnızca sondaya yatmaktadır. Bu çalışmanın amacı sağlamak için, klasik Plak analizi için kısıtlayacağız ve yeni sıvı mikrokristal selüloz bindirmeleri ile birlikte geleneksel katı ve yan katı bindirmeleri (agaroz CMC) kullanımını tarif etmektedir.

<table><tbody><tr><td>Doku kültürü için 6 oyuklu CellStar plakası</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658 160</td><td></td></tr><tr><td>Doku kültürü için 12 oyuklu CellStar plakası</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665 180</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu Doku kültürü için CellStar plakası</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655 180</td><td></td></tr><tr><td>96-2ml derin kuyu plakası</td><td>Seri dilüsyonlar için</td><td>ABD Bilimsel</td><td>C15046314</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Kalitesi Biyolojikler</td><td>112 013 101</td><td>Hücre Ortamı/Seyreltici</td></tr><tr><td>Plaklar için 2x EMEM</td><td>Kaliteli Biyolojikler</td><td>115 073 101</td><td>37 & # 176'ya sıcak; C</td></tr><tr><td>MEM 100x&nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>25 025 Cl</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Piruvat&nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>25 000 Cl</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140 122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030 081</td><td></td></tr><tr><td>HyClone FBS&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30910.03</td><td>62 & # 176'da kullanmadan önce ısı inaktive edilir; 30 dakika için C</td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Sigma Aldritch</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin TPCK</td><td>Sigma Aldritch</td><td>T1426-50mg</td><td>Alikotlar yapın / Donarak çözülmeyi önleyin</td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Dextran</td><td>Sigma Aldritch</td><td>D9885-10G</td><td></td></tr><tr><td>Kristal Menekşe</td><td>Sigma Aldritch</td><td>C3886-25G</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit Çözeltisi</td><td>Sigma Aldritch</td><td>F8775-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Etanol denatüre Reaktif Sınıfı</td><td>Sigma Aldritch</td><td>362808-1L</td><td></td></tr><tr><td>Avicel RC-591 NF</td><td>FMC BiyoPolimer ABD</td><td>RC-591 NF</td><td>UltraPure Agarozu homojenize etmek için yeniden yapılandırırken >30 dakika kuvvetlice çalkalayın</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>Karboksimetil selüloz, Sodyum Tuzu Orta Viskozite&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4888</td><td></td></tr></tbody></table>

kullanımı geleneksel hikaye ve roman yerleşimi sistemleri: plak tahliller sayesinde viral konsantrasyon tayini

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plak deneyleri, hücre kültüründe ayrı plaklar (bulaşıcı birimleri ve hücresel ölü bölgeler) olarak sayma ile bulaşıcı Virionlar ve antiviral maddelerin doğrudan ölçümü için en doğru yöntemlerden biri olmaya devam etmektedir. Burada biz bir temel plak deneyi gerçekleştirmek için nasıl göstermek, ve ayrılan bindirmeleri ve teknikleri plak oluşumunu ve üretimini etkileyebilir nasıl. Tipik haliyle, örneğin agaroz ya da karboksimetil selüloz gibi bir katı veya yarı-katı katlamalı alt-tabakalar, likit büyüme ortam içinden geçerek gelişigüzel enfeksiyonun önlenmesi, viral yayılmayı sınırlandırmak için kullanılmaktadır. Hareketsizleştirilmiş kaplamalar ayrık sayılabilir odakları ve daha sonra, plak oluşumunun oluşumuna izin hemen saran tek tabaka hücresel enfeksiyonu kısıtlar. Geleneksel kapaklar kullanıldığında doğasında zorlukların üstesinden gelmek için, mikrokristalin selüloz ve karboksimetil selüloz sodyum kullanan yeni bir sıvı kaplama artan standart bir yedek olarak kullanılmaktadırplak deneyi. Sıvı bindirme plak tahlilleri kolayca geleneksel tekniklerine göre standart 6 veya 12 sıra plaka biçimlerinden birinde yapılan ve hiçbir özel ekipman gerektirmez edilebilir. Nedeniyle sıvı bir halde ve uygulanması ve kaldırılması daha sonra çok kolay olduğu için mikro-plak formatlarını alternatif büyük ölçekli bir viral titrasyon için, doğru, hızlı ve yüksek kapasiteli bir alternatif olarak kullanılabilir. Isıtılmayan viskoz sıvı polimer kullanımı, çalışmalarını düzene fırsatı sunuyor reaktifleri, kuluçka alanı, ve hiçbir reaktif ısıtma veya cam gibi geleneksel ya da yüksek tutma laboratuvarlarında kullanılan operasyonel güvenlik gereklidir artar korur. Sıvı bindirmeleri de belirli ısıya dayanıksız virüsler için geleneksel bindirmeleri daha duyarlı ispat edebilir.

Doğru viral titreleri değerlendirmek için Plak analizi yeteneği, çok sayıda faktöre dayanır: uygun bir konakçı hücre seçimi, uygun bir ortam ve hücre ve virüs canlılığı, büyümesi koşulları, hareketsizleştirilmiş virüs yayılması ve virüs Kuluçka süresinin doğru belirlenmesi farklı için yeterli zaman sağlamak için ve sayılabilir plak oluşumu. Örnek türleri farklı karşısında kaplama, seçimin, kuluçka dönemleri ve plak morfolojisi: Bu çalışma için, üç temsilci ailelerin virüsler farklılıkları göstermek için seçildi. Venezüella at ensefalit (VEEV) at tür ve insanlarda ciddi hastalığa neden Togaviridae ailesindendir bir (+) ssRNA, viral modeli olarak seçildi. Influenza B Tayvan suşu, bir segmente (-) öncelikle insanlara bulaşmasını ssRNA virüs, Orthomyxoviridae ailesini temsil eder. Ateşli Rift Valley virüsü (RVFV), bir (-) öncelikle eklembacaklıları enfekte ssRNA, artropod doğan virüsü,geviş ve insanlar, Bunyaviridae ailesinin temsilcisi olarak seçildi. RVFV (Şekil 1) için, titreleri 72 saat sonra enfeksiyonu için yan-yana kuluçkalanmıştır CMC, agaroz ya da Avicel bindirmeleri kullanan bir 12 kuyucuklu bir plaka biçiminde RVFV bir rekombinant canlı zayıflatılmış MP12 soyunun bir stok çözeltiden belirlendi (HPI). 10 -4 10 -7 arasında değişen dilüsyonlarını gösteren bir temsili plaka CMC kullanarak Panel A. Plaketlerinin görülen ve agaroz bindirmeleri iyi tanımlanmış bir dairesel sınırında, küçük, açık ve belirgin plaklar gösterdi edilebilir. Bir sıvı kalıbı ile plaklar biraz daha bol ve CMC plaklar agarosa ve kıyasla daha büyük olduğunu, ve daha az belirgin bir sınır sağladı. Viral titreleri bindirmeleri tüm karşılaştırılabilir performans ile Panel B karşılaştırıldı. Yeniden Üretim belirlemek için daha büyük bir örnek büyüklüğü ile MP12 için bindirme arasında net bir görsel bir karşılaştırma elde etmek içinnün, bir 6 yuvalı plaka da aynı şekilde üçlü (Şekil 2) trialed edildi. 6 yuvalı plaka biçiminde, CMC bindirmenin birbirinin boyut olarak karşılaştırılabilir agaroz ya da sıvı, şablon, &#39;den daha küçük plaklar gösterdi. Viral titreleri her üç bindirmeleri (Panel D) arasında benzer iken, agaroz ve sıvı bindirmeleri oluşan plaklar nedeniyle artan boyutu saymak daha kolay olmuştur. Belirgin değişmiştir (Şekil 3A), farklı şablonlar arasında RVFV, VEEV titreleri ve Plak aksine. Plak boyutu ve hassasiyet (Panel B) pahasına, 12 de plaka biçimi kullanarak CMC bindirmeleri oluşan plaklar, açık ve net morfolojisi gösterdi. CMC aksine, agaroz ve sıvı şablonlar kullanımı VEEV çoğaltma daha düşük viral önleme ve artan duyarlılık gösteren, önemli ölçüde daha büyük bir plaklar elde edildi. Sadece ap CMC&#39;nin karşı agarozun karşılaştırırken Bu önceden doğrulandıaper Juarez ve ark. 4 tarafından yayınlandı. Agaroz ve sıvı bindirmeleri CMC daha büyük plaklar üretirken, plaklar kötü sınırları tanımlanmış ve büyük sınır yaygınlaşmasını sağlayan sıvı bindirmeleri ile, bir 12 iyi biçimde saymak zordu vardı. Plakalar 6 yuvalı plakalar (Şekil 4) &#39;de trialed edildiğinde, büyük 6 göz formatındaki açısından CMC bindirmelere üstün kanıtlayan agaroz ile, 12 gözlü bir formatta ayırt etmek zor açıkça birikimdir ve sıvı bindirmeleri konusunu etkisiz plak tanımı ve hassas (Şekil 4D). Karşılaştırma RVFV ya da harici bir proteaz gereği olarak, plaquing zaman VEEV, grip birkaç benzersiz zorluklarla sağlar. Agaroz markalar farklı olarak küçük değişiklikler olması varken önemli değişiklikler belirtildiği gibi farklı bindirme seçimleri için grip virüsünün duyarlılığı da iyi geçmişte belgelenmiştirtr 9 kullanılır. İlginç İnfluenza B Tayvan suşu için bir kaplama olarak CMC&#39;nin kullanımı saymak zor ve (Şekil 5A) güvenilir puanı zor kanıtladı belirgin küçük plaklar sonuçlandı. Bir agaroz kaplamanın kullanılması iyi plaklar (Panel C) sağlanır ve (artan tek tabakalı canlılığı olasılığı nedeniyle) daha koyu bir arka plan leke sonuçlandı ve sıvı bindirme kullanımı (Panel B doğrudan karşılaştırıldığında daha net ve keskin plaklar gösterdi ). Böyle agaroz ve CMC gibi katı ve yarı katı bindirmeleri üzerinde sıvı polimerler, bir avantajı, kaldırma ve uygulama kolaylığı yatıyor. Yarı Katı bindirmeleri ısıtma gerektiren, ve taşıma ve kaldırma sırasında katılaşma problemli olabilir. Bu avantajlardan yararlanmak ve RVFV için yüksek verimli bir şekilde Avicel kullanan pratiklik belirlemek için, 96 kuyucuklu plak format değişik katlamalı konsantrasyon derecesinden en trialed edildions (Şekil 6). RVFV MP-12 için, seyreltme Avicel hem de 0.6 ve% 1.2 son konsantrasyonlarda dört kat olarak gerçekleştirilmiştir. Bini ve kaldırma tekrarlanabilirlik yüksek derecede gösteren, kopya arasından veya belirtilen konsantrasyonları arasında belirgin farklar, basit olduğu kanıtlanmamıştır. Puanlama yaparken, plaklar RVFV için yüksek verimli bir şekilde sıvı bindirmeleri kullanan fizibilitesini gösteren, çıplak gözle belirgin ve sayılabilir idi. <img alt="Şekil 1," fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig1highres.jpg" /> Şekil 1:. 12 gözenekli plakalar kullanılarak RVFV leke kalıbı karşılaştırmalar Veros 12 yuvalı plakalar içinde, 2.5 x 10 5 hücre plakalanmış ve MP12 aynı seri olarak seyreltilmiş başlangıç ​​numunesi kullanılarak 200 ul ile enfekte edilmiştir. Enfeksiyon% 0.3 agaroz 1.5 ml bindirmeleri,% 0.6 Avicel, ya da% 1 CMC (son c sonraPanel A. plaklardaki gösterdi sayıldı ve Panel B&#39;de titre gibi oncentrations) doğrudan bindirmeleri karşılaştırma amacıyla uygulandı. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52065/52065fig2highres.jpg" /> Şekil 2:. 6 kuyucuklu levhaların kullanılması RVFV leke kalıbı karşılaştırmalar Veros 6 yuvalı plakalar içinde 5 x 10 5 hücre olarak plakalanır ve MP12 aynı seri olarak seyreltilmiş başlangıç ​​numunesi kullanılarak 400 ul ile enfekte edilmiştir. Paneller AC için tarif edildiği gibi Panel A&#39;da gösterildiği gibi% 0.3 agaroz üç mi bindirmeleri,% 0.6 Avicel®, ya da% 1 CMC doğrudan bindirmeleri karşılaştırma amacıyla uygulandı, B ve C Ayrı deneyler ile aynı şekilde gerçekleştirilmiştir plakalar sayılmıştır ve Panel D&#39;ye (n = 3) olarak titre. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52065/52065fig3highres.jpg" /> Şekil 3: &lt;12 gözenekli plakalar kullanılarak strong&gt; VEEV plak katlamalı karşılaştırmaları. Veros 12 yuvalı plakalar içinde, 2.5 x 10 5 hücre plaka haline getirilmiş ve VEEV, TC-83 aşı soyunun aynı seri olarak seyreltilmiş başlangıç ​​numunesi kullanılarak 200 ul ile enfekte edilmiştir. Panel A. plaklardaki gösterildiği gibi virüsle enfekte edildikten sonra% 0.3 agaroz 1.5 mi, şablon,% 0.6 Avicel®, ya da% 1 CMC, Pand B&#39;de sayıldı ve titre edildi doğrudan bindirmeleri karşılaştırma amacıyla uygulandı <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52065/52065fig4highres.jpg" /> Şekil 4:. 6 kuyucuklu levhaların kullanılması V EEV leke kalıbı karşılaştırmalar Veros 6 yuvalı plakalar içinde 5 x 10 5 hücre olarak kaplandı ve 400 ul VEEV TC-83 ile aynı seri olarak seyreltilmiş başlangıç ​​numunesi kullanılarak ile enfekte edilmiştir. Gösterildiği gibi enfeksiyondan sonra,% 0.3 agaroz 3 mi bindirmeleri,% 0.6 Avicel®, ya da bir% 1 CMC doğrudan bindirmeleri karşılaştırma amacıyla uygulandıC sayılır ve Panel D titre plaklarla göre, (N = 3) - Panel A için tarif edildiği gibi paneller A, B ve C, ayrı deneyler aynı yapılmıştır. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52065/52065fig5highres.jpg" /> Şekil 5: İnfluenza plak katlamalı karşılaştırmalar MDCK hücreleri, 6 oyuklu plakalar içerisinde 5 x 10 5 hücre plakalanmış ve Influenza Tayvan aynı seri olarak seyreltilmiş başlangıç ​​numunesi kullanılarak aşı 400 ul ile enfekte edilmiştir.. FBS, viral füzyon için gerekli olan belirli proteazlann inhibisyonu yoluyla grip yayılmasını inhibe gibi fetal sığır serumu (FBS), büyüme ortamı veya üst kullanılmıştır. TPCK-tripsin konakçı hücrelerde viral füzyonu ve girişi kolaylaştırmak için uygulamadan önce bindirmeleri tümüne eklenmiştir. Enfeksiyondan sonra,% 0.3 agaroz 3 ml bindirmeleri,% 0.6 Avicel, ya da% 1 CMC doğrudan karşılaştırmak amacıyla uygulananCı, Panel D sayıldı ve titre plaklarla (n = 3) - Panel A tarif edildiği gibi Panel A, B ve C ile ayrı deneylerde gösterildiği gibi kaplamalar aynı yapılmıştır. Ortalama bir CMC plaklar için alınan iken diffüz sınırları ve çok küçük plak boyutları gösterdiği gibi onlar güvenilir saymak zor oldu. <img alt="Şekil 6," fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig6highres.jpg" /> Şekil 6:. Yüksek üretim leke düzenleri Veros bir 96 yuvalı plaka dörtlü olarak, 1 saat boyunca RVFV MP12 aynı seri olarak seyreltilmiş başlangıç ​​numunesi kullanılarak aşı 50 ul ile enfekte edilmiştir, oyuk başına 3 x 10 4 hücre kaplama. Bindirmeleri için Avicel 0.6 ve% 1.2 son konsantrasyonlara eklenmiştir bir yüksek verimli bir şekilde, paneller A ve B sıvı bindirmeleri kullanılmasının fizibilitesi ve tekrarlanabilirliğini belirlemek amacıyla trialed edilmiştir. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Hücre tipi </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Enfeksiyon dönemi </td><td> 1 saat </td><td> 1 saat </td><td> 45 dakika </td></tr><tr><td> İnkübasyon süresi </td><td> 3 gün </td><td> 2 gün </td><td> 3 gün </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Plak Testi Aşılama Koşulları ve Hücre Tipleri <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Hücre Tipi </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Büyüme Tipi</td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 2 </td></tr><tr><td> Plak Medya </td><td> 2xEMEM A </td><td> 2xEMEM A </td><td> 2xEMEM B </td></tr></tbody></table> 1. Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı,% 10 fetal bovin serumu,% 1 L-glutamin,% 1 Penicllin / streptomisin ile takviye edilmiştir. 2. Dulbecco Modifiye Eagle ortamı,% 1 L-glutamin,% 1 Penicllin / Streptomisin,% 0.2 öküz serum albumini,% 0.025 HEPES, DEAE-Dekstran 50 ug / ml ile takviye edilmiştir. % 5 FBS (25 mi),% 1 Minimum Esansiyel amino asitler (5 mi),% 1 sodyum piruvat (5 mi),% 1 L-glutamin (5 ml) ile takviye edilmiş A 2x Minimal Esansiyel Ortam (500 mi), % 2 / Strep (10 mi). % 0.2 öküz serum albumini,% 1 Minimum Esansiyel amino asitler (5 mi), 50 ug / ml,% 0.025 HEPES, DEAE-Dekstran, Tripsin-TPCK ile takviye edilmiş B 2x Minimal Esansiyel Ortam (500 mi) * * Hazırlık hemen önce, 25 başına 1 ul eklemekalikotuna 2 ug TPCK-tripsin / ml stok ml Eğer plaklar için agaroz ile karıştırmak için kullanıyor olacak. Tablo 2: Plak ve Viral / Hücresel Büyüme Medias <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Hücre tipi </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Enfeksiyon dönemi </td><td> 1 saat </td><td> 1 saat </td><td> 45 dakika </td></tr><tr><td> İnkübasyon süresi </td><td> 3 gün </td><td> 2 gün </td><td> 3 gün </td></tr></tbody></table> Çok uzun kısırlık muhafaza olarak yapıldığı zaman Yerleşimi çözümler dolacak değil. Tablo 3: Kaplamalar Stok <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 6 yuvalı </td><td> 12 gözlü </td><td> 96 gözlü </td></tr><tr><td> Hücreler içinde / oyuk </td><td> 5 x 10 5 </td><td> 2.5 x 10 5 </td><td> 3 x 10 4 </td></tr><tr><td> Inokulum hacmi (ul) </td><td> 400 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> paylaşımının hacmi (ml) </td><td> 3 </td><td> 1.5 </td><td> 0.100 </td></tr></tbody></table> Tablo 4: Plaka Biçimleri

Plak tahlilleri, viral titreleri belirlemek için konakçı hücresel tek tabakalar üzerinde tuzak kaplamaları kullanan viral miktar tayini için altın standarttır. Geleneksel olarak çeşitli yarı katı kaplamalar kullanılmış olsa da, burada yarı katı kaplamaları çeşitli virüs aileleri arasında yeni bir sıvı mikrokristalin selülozla karşılaştıran plak tekniklerini gösteriyoruz.

Kullanımı Geleneksel Hikaye ve Roman Yerleşimi Sistemleri: Plak Tahliller sayesinde viral Konsantrasyon Tayini

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Bu prosedürün genel amacı, hücre kültüründeki ayrı plakların sayılması yoluyla enfektif varionların miktarının belirlenerek viral konsantrasyonun saptanmasıdır. Bu işlem, öncelikle enfeksiyon için konfluent bir monokatman oluşturacak şekilde hücrelerin ekilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, miktarı belirlenecek olan bilinmeyen viral örneğin seri dilüsyonunun yapılmasıdır. Ardından, konfluent monokatmanlar viral stokun seri dilüsyonları kullanılarak enfekte edilir ve ardından immobilize eden bir örtü tabakası uygulanır. Son adım, ayrı plakları sayabilmek için söz konusu virüs için uygun inkübasyon süresinden sonra plakların fikse edilmesi ve boyanmasıdır. Sonuç olarak, plak analizleri, bilinmeyen bir viral örneğin viral titresi belirlenmek amacıyla birçok farklı şekilde kullanılabilir ve modifiye edilebilir.Bu tekniğin yarı katı overlay gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hem yüksek kapasiteli hem de geleneksel uygulamalarda uygulama ve kaldırma işlemlerinin çok daha basit olmasıdır. Ayrıca, reaktiflerin ısıtılmasına gerek yoktur. Bu tekniğin etkileri, birçok farklı litik virüs araştırmasına kadar uzanmaktadır; çünkü 96 kuyucuklu formatta sıvı overlay kullanımı, yeni terapötik bileşiklerin hızlı bir şekilde taranmasına olanak tanır ve bu da geleneksel plak analizleri gerçekleştirirken laboratuvarda harcanan uzun saatleri önemli ölçüde azaltabilir.Analizden bir gün önce, enfeksiyon gününde %90 ila %100 konfluens düzeyine ulaşmak için söz konusu virüs için uygun hücreleri ekim yapın. Stok çözeltiler de analizden bir gün önce hazırlanabilir. İlk olarak, 5,56 mililitre %36'lık stok formaldehiti 14,44 mililitre distile su ile karıştırarak distile suda %10'luk bir fiksasyon çözeltisi hazırlayın. Ardından, %20 etanol içinde %1 kristal viyole içeren ve distile su ile seyreltilmiş kristal viyole boyasını hazırlayın. Sonra, steril koşullar altında çalışarak, kullanılan hücre tipi için uygun 2x plak medyasını hazırlayın. Reaktiflerden herhangi biri steril değilse, çözeltiyi 0,2 mikronluk bir filtreden geçirin. Plak analizinde kullanılacak sıvı örtü katmanını hazırlamak için, manyetik karıştırıcı ile hızla karıştırılan 97,6 mililitre distile su içeren bir balona 2,4 gram Avicel ekleyin. Çözeltiyi, manyetik karıştırıcı için çok viskoz hale gelene kadar oda sıcaklığında karıştırın. Bu noktada, balonu bir çalkalayıcıya aktarın ve homojenizasyonu sağlamak için 30 dakika boyunca şiddetli şekilde çalkalayın. Son olarak, çözeltiyi 121 °C'de 14 PSI basınçta 30 dakika boyunca otoklavlayın.Program sona erdiğinde, sızdırmaz şekilde oda sıcaklığında saklayın. Agaroz kaplama için, distile su içerisinde %0,6'lık bir agaroz stok çözeltisi hazırlayın, bir karıştırma çubuğu ile karıştırın ve çözünür hale getirmek için otoklavlayın. Karboksimetilselüloz kaplama için, distile su içerisinde %2'lik bir karboksimetilselüloz çözeltisi hazırlayın ve karıştırın. Ardından, daha önce olduğu gibi otoklavlayın.Ekimi takip eden gün, analize başlamadan önce hücrelerin konfluensini ve canlılığını kontrol etmek için ters mikroskop kullanın. Hücrelerin standart hücresel morfoloji sergilediğinden ve yaklaşık %90 konfluensten emin olun.Söz konusu virüsün beklenen titresi temelinde gerekli dilüsyon sayısını değiştirerek, enfektif örneklerin hücresel büyüme ortamında on katlık seri dilüsyonunu gerçekleştirin. Ayrıca, hücresel canlılığı bağımsız olarak doğrulamak ve plak tanımlamaya yardımcı olmak için enfekte edilmemiş bir kontrol örneği hazırlayın. Monotabakayı bozmamaya dikkat ederek, enfekte edilmemiş kontrolü ve seri dilüsyonları plaka kuyucuklarına pipetleyin.Viral kontak oranını maksimize etmek için hacmi mümkün olduğunca düşük tutarak, hücreleri kaplayacak yeterli miktarda inokülüm kullanın. Plakaları doku kültürü inkübatörüne yerleştirin ve hücreleri 45 dakika ile bir saat arası enfekte edin. Eşit dağılımı sağlamak ve hücresel monokatmanın kurumasını önlemek için plakaları her 20 dakikada bir nazikçe sallayın.Enfeksiyon sırasında, sıvı örtü katmanları için çalışma çözeltisini hazırlayın. 0,6 ila 1,2% Avicel örtü ortamı çalışma çözeltisi elde etmek için, ısıtılmış plak medya ile oda sıcaklığındaki %1,2 ila 2,4'lük Stok Avicel'i birer bir oranda karıştırın. Agaroz veya CMC örtü katmanları için, ısıtılmış plak medyayı, ısıtılmış %0,6'lık agaroz veya %2'lik CMC stok çözeltisi ile birer bir oranda karıştırın. Ardından, sıcaklık dengelenmesi için 30 dakika boyunca 56 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Hücre ölümünü ve viral titrenin azalmasını önlemek için çözeltinin ılık olduğundan ancak dokunulduğunda sıcak olmadığından emin olun. Enfeksiyondan sonra, örtü katmanlarını enfekte edilmiş tek katmanlı hücrelere uygulayın. Örtü katmanı eklendikten sonra, plakları analiz edilen virüse bağlı olarak iki ila 14 gün boyunca 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında inkübe edin.Hücreleri sıvı bir örtüyle sabitlemek için Avicel örtüsünü dökün veya aspire edin, ardından kuyucuklara %10'luk formaldehit çözeltisi pipetleyin ve oda sıcaklığında 30 dakikadan gece boyunca kadar sabitleyin. Agaroz veya CMC için formaldehit çözeltisini doğrudan örtünün üzerine ekleyip oda sıcaklığında bir saatten gece boyunca kadar bekletin. Sabitleme işleminden sonra formaldehiti atın ve ardından agaroz için yarı katı tıkaçları spatula ile manuel olarak çıkarın.Boyama işleminden önce, kalıntı overlay tespit ediciyi uzaklaştırmak için Avicel hücre plaklarını suyla durulayın.Boyamak için hücrelerin üzerini yaklaşık 15 dakika boyunca minimum miktarda kristal viyole çözeltisi ile kaplayın. Eşit kapsama sağlamak için gerekirse plakaları sallayın. Kristal viyole boyasını su ile nazikçe yıkayarak temizleyin. Fiksasyon, boyama ve kurutma işlemleri tamamlandıktan sonra, plakları gelecekteki analizler için süresiz olarak saklayın. Beşten az veya 100'den fazla plağı olan kuyucukları hariç tutarak her kuyucuktaki plakları sayın. Aynı dilüsyonun teknik tekrarları için ortalamayı alın. Plak boyutunu ve morfolojisini not edin. Bir dilüsyon için ortalama plak sayısını ve toplam dilüsyon faktörünün tersini alarak stok örneğin viral titresini belirleyin.Bu görüntü, 12 kuyucuklu plaklar kullanılarak yapılan Rift Vadisi ateşi virüsü plak örtme karşılaştırmalarını göstermektedir. Vero hücreleri, 12 kuyucuklu plakalara 2,5 x 10⁵ hücre olacak şekilde ekilmiş ve MP 12'nin aynı seri dilüe edilmiş başlangıç örneğinden 200 µL kullanılarak enfekte edilmiştir. Enfeksiyon sonrası, örtme yöntemlerini doğrudan karşılaştırmak için 1,5 mL'lik 0,3% agaroz, 0,6% Avicel veya 1% CMC örtmeleri uygulanmıştır. Bu histogram, üç örtme yönteminin tamamı için plak sayımı ve titrasyon sonuçlarını göstermektedir. Burada, 12 kuyucuklu plaklar kullanılarak yapılan VEEV plak örtme karşılaştırmaları gösterilmektedir. Vero hücreleri daha önce olduğu gibi ekilmiş ve VEEV-TC 83 vaccine strain'in aynı seri dilüe edilmiş başlangıç örneğinden 200 µL hacminde kullanılarak enfekte edilmiştir; enfeksiyon sonrası, daha önce olduğu gibi 1,5 mL'lik 0,3% agaroz, 0,6% Avicel veya 1% CMC örtmeleri uygulanmıştır.Tekrar, histogram üç kaplamanın tamamı için plak sayımı ve titrasyon sonuçlarını göstermektedir. Bu görüntü, yüksek kapasiteli plak kaplamalarına bir örnek sunmaktadır. Kuyuk başına 3 x 10⁴ hücre olacak şekilde ekilen Vero hücreleri içeren 96 kuyucuklu bir plak, Rift Valley fever virus MP 12'den hazırlanan aynı seri seyreltilmiş başlangıç örneğinin 50 µL'lik inokulumu ile dört paralel şeklinde bir saat boyunca enfekte edilmiştir. Kaplamalar için, sıvı kaplamaların yüksek kapasiteli bir şekilde kullanılmasının fizibilitesini ve tekrarlanabilirliğini belirlemek amacıyla Avicel hücresinin %0,6 ve %1,2 nihai konsantrasyonları denenmiştir. Bu histogram, her bir kaplamadan belirlenen titreleri göstermektedir.Bu prosedürü uygularken, her virüsün farklı olduğunu ve farklı hücre tiplerinin, inkübasyon sürelerinin ve/veya büyüme ortamlarının kullanılması dahil olmak üzere optimizasyonların gerekli olabileceğini unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, hem sıvı hem de yarı katı kaplamalar kullanılarak temel bir plak assay'inin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

viral-concentration-determination-through-plaque-assays-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kültür mikroorganizmalar için kullanılan medya ve reaktifler ile çalışırken, aseptik tekniği kontaminasyonu minimize edilmiştir sağlamak için uygulanan olmalıdır. Kaplama yöntemleri çeşitli rutin bir şekilde, izole yaymak veya numaralandırma bakteri ve faj, deney malzemelerinin steriliteyi korumaya işlemleri dahil, her biri için kullanılır.

Aseptik Laboratuvar Teknikleri: Kaplama Yöntemleri

Burada etkin hücre kültüründe çoğaltır yalnızca norovirusa olduğunu murin norovirusa (MNV), infeksiyöz partikül ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Plak tahlil murin makrofajlar için MNV en tropizm yararlanır ve MNV içeren biyolojik veya çevresel numuneler ile kullanım için adapte edilebilir.

Mürin Norovirüs için Plak Testi

Source: Morales Vasquez, D., et al. Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the protocol for carrying out plaque assay–based viral titration for quantifying infectious virus levels in tissue sample collected from a virus–infected mouse model.

Plaque Assay–Based Quantification of Viral Load in an Infected Mouse Tissue Sample

Bu videoda, enfeksiyöz herpes simpleks virüsü veya HSV'nin virüs plak testi açıklanmaktadır. Seyreltilmiş viral partiküller, epitel hücrelerinin tek tabakasına aşılanır. Kuluçka sırasında, virüs plaklar oluşturur ve bulaşıcı virüs titresini belirlemek için görsel olarak sayılır.

Virüs Plak Testi: Virüsle enfekte olmuş hücrelerin tek tabakasında oluşan plakların miktar tayini yoluyla enfeksiyöz herpes simpleks virüsünü ölçmek için bir teknik

Bu videoda, enfekte domuz korneasından elde edilen bir virüs kullanılarak plak testi gerçekleştirme yöntemi gösterilmektedir. Domuz korneası, deneysel ilaçların antiviral etkinliğini test etmek için kullanılır.

Plak Testi ile Deneysel İlaçların Antiviral Etkinliğinin Belirlenmesi

Bu makale, otomatik ve manuel sıvı işleyiciler kullanarak çeşitli RNA ve DNA virüslerini titre etmek için yüksek verimli lusiferaz ifadesine dayalı bir yöntem sunar.

Lusiferaz ifade eden rekombinant virüsler yüksek verimlilik Titrasyon

Bu çalışma, bir açıklar   görüntüleme bazlı mikro-nötralizasyon deneyi virüsler arasında antijenik ilişkileri analiz etmek. protokol düz yataklı tarayıcı kullanır ve titrasyon, titrasyon kantitatif, nötralizasyon ve nötralizasyon kantitatif olmak üzere dört adım vardır. Tahlil akımı dolaşan grip A (H1N1) pdm09, A (H3N2) ve B virüsleri ile iyi çalışır.

Bir Kantitatif Mikro-nötralizasyon Testi optimizasyonu

Biz üretmek için bir yöntem tanımlamak ve genetik olarak yükseltecek solunum sinsisyal virüs (RSVs) ve bir en iyi duruma getirilmiş plak tahlil RSVs için değiştirilebilir. Biz bu protokolü sırasıyla miktar RSV çoğaltma izin ve analiz RSV dahil organları ve granül dahil organları ilişkili dynamics canlı iki rekombinant virüs oluşturarak göstermektedir.

Üretimi, güçlendirme ve titrasyon rekombinant solunum sinsisyal virüs

Plaqueing, bir popülasyondaki canlı virüsleri ölçmek için kullanılan rutin bir yöntemdir. Plaqueing, bakteri ve bakteriyofajlarla çeşitli mikrobiyoloji müfredatlarında sıklıkla öğretilmesine rağmen, memeli virüslerinin veba edilmesi daha karmaşık ve zaman alıcıdır. Bu protokol, herpes simpleks virüsleri ile düzenli çalışma için güvenilir bir şekilde çalışan prosedürleri açıklar.

Herpes Simpleks Virüslerinin Plaklaşması

Mevcut protokol, Zika virüsünün (ZIKV) Vero Afrika yeşil maymun böbrek hücrelerinde yayılımını ve 24 oyuklu ve 96 oyuklu (yüksek verimli) formatlarda hücre bazlı kolorimetrik immüno-tespit yöntemleri kullanılarak ZIKV'nin miktar tayinini açıklamaktadır.

Virüs Yayılımı ve Hücre Bazlı Kolorimetrik Miktar Tayini

Öğrenin, plak tahlilleri ile viral konsantrasyon tayini yöntemini; sıvı mikrokristalin selüloz örtü kullanarak yüksek verimli uygulamalarda viral titrasyonu nasıl kolaylaştıracağınızı keşfedin.

Kullanımı Geleneksel Hikaye ve Roman Yerleşimi Sistemleri: Plak Tahliller sayesinde viral Konsantrasyon Tayini

Daha fazla video keşfet