Kullanımı Geleneksel Hikaye ve Roman Yerleşimi Sistemleri: Plak Tahliller sayesinde viral Konsantrasyon Tayini

Bu prosedürün genel amacı, hücre kültüründeki ayrık plakları sayarak enfeksiyöz varyasyonun nicelleştirilmesi yoluyla viral konsantrasyonu belirlemektir. Bu, enfeksiyon için birleşik bir tek tabaka oluşturmak üzere ilk kaplama hücreleri ile gerçekleştirilir. İkinci adım, miktarı belirlenecek bilinmeyen viral numunenin seri seyreltmesini gerçekleştirmektir.

Daha sonra, birleşik tek tabakalar, viral stoğun seri seyreltilmesi kullanılarak enfekte edilir, ardından bir immobilize edici kaplama uygulanır. Son adım, gizli plakları saymak için söz konusu virüs için uygun kuluçka süresinden sonra plakları sabitlemek ve lekelemektir. Sonuç olarak, plak tahlilleri, bilinmeyen bir viral numunenin viral titrelerini belirlemek için bir dizi farklı şekilde kullanılabilir ve değiştirilebilir.

Bu tekniğin yarı katı kaplama gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, hem yüksek verimli hem de geleneksel uygulamalarda uygulama ve çıkarma işleminin çok daha basit olmasıdır. Ek olarak, reaktiflerin ısıtılmasına gerek yoktur. Bu tekniğin sonuçları, sıvı bir tabakanın kullanılması olarak birçok farklı litik virüsün araştırılmasına kadar uzanır.

96 oyuklu bir formatta, yeni terapötik bileşiklerin hızlı bir şekilde taranmasına izin verir, bu da laboratuvarda geleneksel plak tahlilleri yapmak için harcanan uzun saatleri büyük ölçüde azaltabilir Tahlil plakasından önceki gün, söz konusu virüs için uygun hücreler, enfeksiyon gününde% 90 ila 100 co akıcılığı elde etmek için. Stok çözeltileri ayrıca tahlilden bir gün önce hazırlanabilir: önce 5.56 mililitre %36 stok formaldehit ile 14.44 mililitre damıtılmış su karıştırılarak damıtılmış su içinde %10'luk bir formaldehit sabitleme çözeltisi hazırlayın. Daha sonra damıtılmış su ile seyreltilmiş %20 etanol içinde %1 kristal menekşe içeren kristal viyole lekesini hazırlayın.

Daha sonra, steril koşullar altında çalışırken, kullanılan hücre tipine uygun iki x plak ortamını hazırlayın. Reaktiflerden herhangi biri steril değilse, çözeltiyi 0.2 mikronluk bir filtreden süzün. Plak tahlilinde kullanılmak üzere sıvı bir kaplama hazırlamak için, 2.4 gram avy hücresinde, bir karıştırma çubuğu ile hızla karıştırılan 97.6 mililitre damıtılmış su içeren bir şişeye.

Çözeltiyi oda sıcaklığında, karıştırma çubuğu için çok viskoz hale gelene kadar karıştırın. Bu noktada, şişeyi bir şişe çalkalayıcıya aktarın ve eşit homojenizasyonu sağlamak için 30 dakika boyunca yoğun bir şekilde çalkalayın. Son olarak, çözeltiyi 121 santigrat derecede, 14 PSI'da 30 dakika boyunca otoklavlayın.

Ve program bittiğinde, bir aros kaplaması için oda sıcaklığında kapalı olarak saklayın. Damıtılmış suda% 0.6 tarımsal stok çözeltisi hazırlayın. Çözelti veya karboksi metilselüloz kaplama haline getirmek için bir karıştırma çubuğu ve otoklav ile karıştırın.

Damıtılmış suda% 2'lik bir karboksi Metilselüloz çözeltisi hazırlayın ve kaplamadan sonraki gün olduğu gibi otoklavdan karıştırın. Teste başlamadan önce hücrelerin birlikte akıcılığını ve canlılığını kontrol etmek için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın. Hücrelerin standart hücresel morfoloji ve yaklaşık% 90 co akıcılığı sergilediğinden emin olun.

Söz konusu virüsün beklenen titresine bağlı olarak gereken seyreltme sayısını değiştirerek, hücresel büyüme ortamında enfeksiyöz numunelerin on kat seri seyreltmesini gerçekleştirin. Ayrıca, hücresel canlılığı bağımsız olarak sağlamak ve plak tanımlamasına yardımcı olmak için enfekte olmamış bir kontrol numunesi hazırlayın. Enfekte olmamış kontrolü ve seri seyreltmeyi plakanın kuyucuklarına pipetleyin ve tek tabakayı bozmamaya dikkat edin.

Tek tabaka ile viral teması en üst düzeye çıkarmak için hacmi mümkün olduğunca düşük tutarken hücreleri kaplamak için yeterli miktarda inokülum kullanın. Plakaları doku kültürü inkübatörüne koyun ve hücreleri her 20 dakikada bir 45 dakika ila bir saat boyunca enfekte edin. Eşit kapsama alanı sağlamak ve enfeksiyon sırasında hücresel tek tabakanın kurumasını önlemek için plakaları hafifçe sallayın.

Sıvı kaplamalar için kaplama çalışma çözümünü hazırlayın. Isıtılmış plak ortamını ve %1,2 ila %2,4 oda sıcaklığında karıştırın %0,6 ila 1,2 avy hücre kaplama ortamı veya AROS veya CMC kaplamaları karışık ısıtılmış plak ortamından oluşan bir çalışma çözeltisi elde etmek için avy hücresini bire bir oranında stoklayın ve bire bir oranında ısıtılmış %0,6 AROS veya %2 CMC'lik bir stok çözeltisi. Daha sonra sıcaklık dengelemesi için 30 dakika 56 santigrat derece su banyosuna koyun.

Hücre ölümünü ve viral titreleri azaltmak için çözeltinin ılık olduğundan ancak dokunulamayacak kadar sıcak olmadığından emin olun. Enfeksiyondan sonra, kaplamanın eklenmesinden sonra kaplamaları enfekte olmuş tek katmanlara uygulayın Hücreleri sıvı bir kaplama ile sabitlemek için analiz edilen virüse bağlı olarak plakaları 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte iki ila 14 gün boyunca inkübe edin, e hücre kaplamasını dökün veya aspire edin, daha sonra% 10 formaldehit çözeltisini kuyucuklara pipetleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca gece boyunca veya aros veya CMC'ye sabitleyin. Formaldehit çözeltisini, fiksasyondan sonra oda sıcaklığında bir saat ila gece boyunca kaplamaya ekleyin, formaldehiti atın ve ardından spatula ile arosların bulunduğu yarı katı tapaları manuel olarak çıkarın.

Boyamadan önce kalan kaplama fiksatifini çıkarmak için aby hücre plaklarını suyla durulayın. Lekelemek için, hücreleri yaklaşık 15 dakika boyunca minimum miktarda kristal viyole çözeltisi ile kaplayın. Eşit kapsama alanı sağlamak için gerekirse plakaları sallayın.

Kristal viyole lekesini sabitlendikten, lekelendikten ve kurutulduktan sonra suyla nazikçe yıkayın, ileride analiz etmek için pleksi süresiz olarak saklayın. Beşten az veya 100'den fazla plaket içeren kuyucukları indirgeyerek her kuyucuktaki plakları sayın. Aynı seyreltmenin herhangi bir teknik kopyası için ortalamayı alın.

Plak boyutuna ve morfolojisine dikkat edin. Bir seyreltme için ortalama plak sayısını ve toplam seyreltme faktörünün tersini alarak stok numunesinin viral titresini belirleyin. Bu görüntü, 12 kuyucuklu plaka kullanılarak Rift Vadisi ateşi virüsü plak kaplama karşılaştırmalarını göstermektedir: bürolar, 12 kuyucuklu plakadaki beşinci hücrelerin 2,5 katında kaplandı ve aynı seri olarak seyreltilmiş MP 12 başlangıç örneği kullanılarak 200 mikrolitre ile enfekte edildi.

Enfeksiyondan sonra, kaplamaları doğrudan karşılaştırmak için% 0.3 aros% 0.6 AVY veya% 1 CMC'lik 1.5 mililitre kaplamalar uygulandı. Bu histogram, her üç kaplama için de plak sayımlarının ve titremenin sonuçlarını gösterir. Burada. 12 oyuklu plaka kullanılarak yapılan ViiV plak kaplama karşılaştırmaları, büroların daha önce olduğu gibi kaplandığı ve ViiV TC 83 aşı suşunun aynı seri olarak seyreltilmiş başlangıç numunesi kullanılarak 200 mikrolitrelik bir hacimle enfekte edildiği gösterilmiştir.

Yine histogram, her üç kaplama için de plak sayımlarının ve titrelerin sonuçlarını gösterir. Bu görüntüde, yüksek aktarım hızına sahip plak kaplamalarının bir örneği gösterilmektedir. Kuyucuk başına dördüncü hücrelerin 10'u olmak üzere üç kez kaplanmış 96 oyuklu bir VIR plakası, Rift Valley ateşi virüsü MP 12'nin aynı seri olarak seyreltilmiş başlangıç numunesi kullanılarak 50 mikrolitre aşılama ile enfekte edildi ve %0.6 ve %1.2 kaplamalar için dörtlü çift halinde bir saat boyunca avy hücresinin nihai konsantrasyonları, sıvı kaplamaların yüksek verimli bir şekilde kullanılmasının fizibilitesini ve tekrarlanabilirliğini belirlemek için denendi.

Bu histogram, her kaplamadan belirlenen titreleri gösterir. Bu prosedürü denerken, her virüsün farklı olduğunu ve farklı hücre tiplerinin, kuluçka sürelerinin ve / veya büyüme ortamının kullanılması dahil olmak üzere optimizasyonların gerekli olabileceğini hatırlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, hem sıvı hem de yarı katı kaplamalar kullanılarak temel bir plak testinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.