Farelerde In Utero Elektroporasyon
In utero elektroporasyon, nöral gelişim sırasında hücrelerin proliferasyonunu, farklılaşmasını, migrasyonunu ve olgunlaşmasını yönlendiren moleküler m…
In utero elektroporasyon, nörogelişimi yönlendiren moleküler mekanizmaları incelemek için temel bir tekniktir. Gelişmekte olan kemirgen beyninin belirli bölgelerinde gen ekspresyonunu değiştirmek için DNA enjekte ederek araştırmacılar; nöral hücrelerin proliferasyonunu, diferansiyasyonunu, migrasyonunu ve maturasyonunu doğal ortamları bağlamında inceleyebilirler.
Bu video, in utero elektroporasyonun arkasındaki temel prensipleri, tekniğin nasıl uygulanacağına dair temel bir genel bakışı ve nörobiyoloji araştırmalarındaki uygulamalarını tanıtacaktır.
Bu prosedürün nasıl gerçekleştirileceğine değinmeden önce, elektroporasyonun bazı temel ilkelerini inceleyelim. Bu prosedür, hücre membranlarında DNA'nın hücreye girmesine izin veren geçici gözenekler oluşturan elektriksel darbeler kullanır. Negatif yüklü DNA pozitif elektroda doğru hareket edeceğinden, elektrik alanının konumlandırılmasına bağlı olarak farklı hücre popülasyonları hedeflenebilir.
Elektroporasyon geleneksel olarak in vitro çalışmalarda kullanılmış olsa da, bilimsel gelişmeler kullanım alanını in utero gelişen fare embriyolarında bulunanlar da dahil olmak üzere sağlam organlara kadar genişletmiştir.
Uterus içi elektroporasyon, hücre kültürü veya ex vivo tekniklerinin aksine, transfect edilen hücrelerin normal gelişimi yönlendiren tüm fizyolojik işaretlere maruz kalmaya devam etmesi avantajına sahiptir. Bu, özellikle aksonlar gibi yapıların düzgün gelişmek için diğer hücre tiplerinden gelen yönlendirici işaretlere ihtiyaç duyduğu beyinde oldukça önemlidir.
Özellikle beyin gelişimi, programlanmış bir proliferasyon ve migrasyon olaylar dizisini içerir; bu da elektroporasyonun zamanlamasına göre farklı doku tabakalarının hedeflenebileceği anlamına gelir.
Son olarak, farklı elektrot tiplerinin mevcut olması, araştırmacıların hem beynin yüzeyine yakın bölgelere hem de daha derin alanlara erişmesine olanak tanır. Korteks ve hipokampus gibi beynin yüzeysel kısımları hedeflenirken palet elektrotlar kullanılırken, talamus ve hipotalamus gibi derin yapılar hedeflendiğinde daha küçük iğne elektrotlar kullanılır.
Tekniğin arkasındaki bazı temel ilkeleri tartıştıktan sonra, cerrahi prosedür ve in utero elektroporasyona derinlemesine girebilmek için hazırlıklarımızı tamamlayalım.
Öncelikle, tüm aletleri sterilize edin ve cerrahi alanı %70 etanol ile silin. Ardından, plazmit DNA'yı %0,1 Fast Green içeren steril PBS içinde çözerek bir enjeksiyon solüsyonu hazırlayın. Fast Green, enjeksiyon solüsyonunun embriyo içinde görselleştirilmesini sağlamak için eklenir. Son olarak, amniyotik sıvı kaybını ve buna bağlı fetal mortaliteyi azaltmak için bir iğne çekici (needle puller) kullanılarak ultra ince bir iğne oluşturulmalıdır.
Her şey hazırlandıktan sonra, gelişmekte olan kemirgenlerde beyin dokusuna elektroporasyon yapmanın temel adımlarını inceleyelim. İşleme, gebe bir anneyi %5 isoflurane ile anestezi ederek başlayın, ardından prosedür boyunca %2,25 isoflurane veren bir respiratör tüpüne transfer edin. Ardından, ameliyat sonrası ağrı kesici olarak buprenorfin gibi bir analjeziği deri altına uygulayın. Daha sonra karnı tıraş edin ve insizyon bölgesini sterilize edin.
Uterusu cerrahi olarak açığa çıkarmak için, derinin orta hattı boyunca dikey bir insizyon yapın ve makas kullanarak peritonyumu kesin. Embriyoların kurumasını önlemek için açıklığı steril salinle ıslatılmış gazlı bezle kapatın. Ardından, embriyo zincirini, önceden ısıtılmış steril salinle kapatarak embriyoları ıslak tuttuğunuzdan emin olarak karın boşluğundan nazikçe dışarı çekin.
Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, beyne kolay erişim için uygun konumdaki embriyoları belirleyin. Parmaklarınızla veya pensle embriyonun başını sabitleyin ve DNA solüsyonunu uterus duvarı üzerinden beyne enjekte edin. Pozitif elektrot, DNA'nın elektropore edilmesini istediğiniz yöne gelecek şekilde, başın her iki yanına birer elektrot yerleştirin. Uygun konumdaki tüm embriyolar elektropore edildikten sonra, uterus boynuzunu dikkatlice karın boşluğuna geri yerleştirin.
İnsizyonu kapatmadan önce, boşluğa 2 - 3 ml ılık salin ekleyin. Peritonyumu emilebilir sütürlerle birlikte dikin, ardından cildi zımba kullanarak kapatın. Son olarak, fareyi ısıtma pedli bir kafese transfer edin ve izleyin.
in utero elektroporasyonun nasıl gerçekleştirileceğini incelediğimize göre, şimdi bu tekniğin bazı ileri uygulamalarını değerlendirelim.
In utero elektroporasyon, belirli genlerin sinirsel gelişime nasıl katkıda bulunduğunu araştırmak için yararlı bir araçtır. Elektropore edilen konstrüktler, yabani tip veya mutant proteinlerin aşırı ekspresyonuna rehberlik edebilir veya protein ekspresyonunu tamamen engelleyebilir. Ardından, nörolojik fenotipler mikroskobik veya organizma düzeyinde değerlendirilebilir. Örneğin, bu araştırmacılar, gelişmekte olan fare beyninde şizofreni ile ilişkili DISC-1 geninin geçici aşırı ekspresyonunun, yaşamın ilerleyen dönemlerinde amfetamine karşı aşırı duyarlılıkla sonuçlandığını belirlemişlerdir.
In utero elektroporasyon, floresan proteinleri kodlayan dizileri sinir dokusuna ileterek, belirli hücre popülasyonlarının ve kurdukları bağlantıların görselleştirilmesi için de faydalı olabilir. Örneğin, bu araştırmacılar, görsel bilgileri gözden beyne ileten retinal ganglion hücrelerini (RGC'ler) incelemek için E13.5 retinalarına yeşil floresan protein genini elektropore etmişlerdir. E18.5'te retinaların incelenmesi, bu tekniğin RGC aksonunun optik sinir, optik kiazma ve optik traktus boyunca izlediği yolu takip etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
Son olarak, sinirsel gelişimdeki birçok önemli olay doğumdan sonra meydana gelir; bu da bilim insanlarını in vivo elektroporasyon olarak adlandırılan modifiye bir teknik geliştirmeye teşvik etmiştir. Bu prosedür, in utero elektroporasyonla aynı temel adımları takip eder ancak genellikle doğumdan sonraki ilk birkaç gün içinde gerçekleştirilir. Postnatal genetik manipülasyon, özellikle burada gösterilen olfaktör bulbus içinde bulunanlar gibi daha geç oluşan hücre tiplerini incelemek için yararlıdır.
JoVE'nin in utero elektroporasyon hakkındaki videosunu izlediniz. Bu video, in utero elektroporasyonun nasıl gerçekleştirileceğine dair temel ilkeleri ve genel bir bakışı, ayrıca araştırmacıların nörogelişimi yönlendiren moleküler mekanizmaları incelemesine olanak tanıyan birkaç alt uygulamayı içermektedir.
İzlediğiniz için teşekkürler!
In utero elektroporasyon, nörogelişimi yönlendiren moleküler mekanizmaları incelemek için temel bir tekniktir. Gelişmekte olan kemirgen beyninin belirli bölgelerinde gen ekspresyonunu değiştirmek için DNA enjekte ederek araştırmacılar; nöral hücrelerin proliferasyonunu, diferansiyasyonunu, migrasyonunu ve maturasyonunu doğal ortamları bağlamında inceleyebilirler.
Bu video, in utero elektroporasyonun arkasındaki temel prensipleri, tekniğin nasıl uygulanacağına dair temel bir genel bakışı ve nörobiyoloji araştırmalarındaki uygulamalarını tanıtacaktır.
Bu prosedürün nasıl gerçekleştirileceğine değinmeden önce, elektroporasyonun bazı temel ilkelerini inceleyelim. Bu prosedür, hücre membranlarında DNA'nın hücreye girmesine izin veren geçici gözenekler oluşturan elektriksel darbeler kullanır. Negatif yüklü DNA pozitif elektroda doğru hareket edeceğinden, elektrik alanının konumlandırılmasına bağlı olarak farklı hücre popülasyonları hedeflenebilir.
Elektroporasyon geleneksel olarak in vitro çalışmalarda kullanılmış olsa da, bilimsel gelişmeler kullanım alanını in utero gelişen fare embriyolarında bulunanlar da dahil olmak üzere sağlam organlara kadar genişletmiştir.
Uterus içi elektroporasyon, hücre kültürü veya ex vivo tekniklerinin aksine, transfect edilen hücrelerin normal gelişimi yönlendiren tüm fizyolojik işaretlere maruz kalmaya devam etmesi avantajına sahiptir. Bu, özellikle aksonlar gibi yapıların düzgün gelişmek için diğer hücre tiplerinden gelen yönlendirici işaretlere ihtiyaç duyduğu beyinde oldukça önemlidir.
Özellikle beyin gelişimi, programlanmış bir proliferasyon ve migrasyon olaylar dizisini içerir; bu da elektroporasyonun zamanlamasına göre farklı doku tabakalarının hedeflenebileceği anlamına gelir.
Son olarak, farklı elektrot tiplerinin mevcut olması, araştırmacıların hem beynin yüzeyine yakın bölgelere hem de daha derin alanlara erişmesine olanak tanır. Korteks ve hipokampus gibi beynin yüzeysel kısımları hedeflenirken palet elektrotlar kullanılırken, talamus ve hipotalamus gibi derin yapılar hedeflendiğinde daha küçük iğne elektrotlar kullanılır.
Tekniğin arkasındaki bazı temel ilkeleri tartıştıktan sonra, cerrahi prosedür ve in utero elektroporasyona derinlemesine girebilmek için hazırlıklarımızı tamamlayalım.
Öncelikle, tüm aletleri sterilize edin ve cerrahi alanı %70 etanol ile silin. Ardından, plazmit DNA'yı %0,1 Fast Green içeren steril PBS içinde çözerek bir enjeksiyon solüsyonu hazırlayın. Fast Green, enjeksiyon solüsyonunun embriyo içinde görselleştirilmesini sağlamak için eklenir. Son olarak, amniyotik sıvı kaybını ve buna bağlı fetal mortaliteyi azaltmak için bir iğne çekici (needle puller) kullanılarak ultra ince bir iğne oluşturulmalıdır.
Her şey hazırlandıktan sonra, gelişmekte olan kemirgenlerde beyin dokusuna elektroporasyon yapmanın temel adımlarını inceleyelim. İşleme, gebe bir anneyi %5 isoflurane ile anestezi ederek başlayın, ardından prosedür boyunca %2,25 isoflurane veren bir respiratör tüpüne transfer edin. Ardından, ameliyat sonrası ağrı kesici olarak buprenorfin gibi bir analjeziği deri altına uygulayın. Daha sonra karnı tıraş edin ve insizyon bölgesini sterilize edin.
Uterusu cerrahi olarak açığa çıkarmak için, derinin orta hattı boyunca dikey bir insizyon yapın ve makas kullanarak peritonyumu kesin. Embriyoların kurumasını önlemek için açıklığı steril salinle ıslatılmış gazlı bezle kapatın. Ardından, embriyo zincirini, önceden ısıtılmış steril salinle kapatarak embriyoları ıslak tuttuğunuzdan emin olarak karın boşluğundan nazikçe dışarı çekin.
Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, beyne kolay erişim için uygun konumdaki embriyoları belirleyin. Parmaklarınızla veya pensle embriyonun başını sabitleyin ve DNA solüsyonunu uterus duvarı üzerinden beyne enjekte edin. Pozitif elektrot, DNA'nın elektropore edilmesini istediğiniz yöne gelecek şekilde, başın her iki yanına birer elektrot yerleştirin. Uygun konumdaki tüm embriyolar elektropore edildikten sonra, uterus boynuzunu dikkatlice karın boşluğuna geri yerleştirin.
İnsizyonu kapatmadan önce, boşluğa 2 - 3 ml ılık salin ekleyin. Peritonyumu emilebilir sütürlerle birlikte dikin, ardından cildi zımba kullanarak kapatın. Son olarak, fareyi ısıtma pedli bir kafese transfer edin ve izleyin.
in utero elektroporasyonun nasıl gerçekleştirileceğini incelediğimize göre, şimdi bu tekniğin bazı ileri uygulamalarını değerlendirelim.
In utero elektroporasyon, belirli genlerin sinirsel gelişime nasıl katkıda bulunduğunu araştırmak için yararlı bir araçtır. Elektropore edilen konstrüktler, yabani tip veya mutant proteinlerin aşırı ekspresyonuna rehberlik edebilir veya protein ekspresyonunu tamamen engelleyebilir. Ardından, nörolojik fenotipler mikroskobik veya organizma düzeyinde değerlendirilebilir. Örneğin, bu araştırmacılar, gelişmekte olan fare beyninde şizofreni ile ilişkili DISC-1 geninin geçici aşırı ekspresyonunun, yaşamın ilerleyen dönemlerinde amfetamine karşı aşırı duyarlılıkla sonuçlandığını belirlemişlerdir.
In utero elektroporasyon, floresan proteinleri kodlayan dizileri sinir dokusuna ileterek, belirli hücre popülasyonlarının ve kurdukları bağlantıların görselleştirilmesi için de faydalı olabilir. Örneğin, bu araştırmacılar, görsel bilgileri gözden beyne ileten retinal ganglion hücrelerini (RGC'ler) incelemek için E13.5 retinalarına yeşil floresan protein genini elektropore etmişlerdir. E18.5'te retinaların incelenmesi, bu tekniğin RGC aksonunun optik sinir, optik kiazma ve optik traktus boyunca izlediği yolu takip etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
Son olarak, sinirsel gelişimdeki birçok önemli olay doğumdan sonra meydana gelir; bu da bilim insanlarını in vivo elektroporasyon olarak adlandırılan modifiye bir teknik geliştirmeye teşvik etmiştir. Bu prosedür, in utero elektroporasyonla aynı temel adımları takip eder ancak genellikle doğumdan sonraki ilk birkaç gün içinde gerçekleştirilir. Postnatal genetik manipülasyon, özellikle burada gösterilen olfaktör bulbus içinde bulunanlar gibi daha geç oluşan hücre tiplerini incelemek için yararlıdır.
JoVE'nin in utero elektroporasyon hakkındaki videosunu izlediniz. Bu video, in utero elektroporasyonun nasıl gerçekleştirileceğine dair temel ilkeleri ve genel bir bakışı, ayrıca araştırmacıların nörogelişimi yönlendiren moleküler mekanizmaları incelemesine olanak tanıyan birkaç alt uygulamayı içermektedir.
İzlediğiniz için teşekkürler!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: How does electroporation create transient pores in cell membranes?
Electroporation uses electrical pulses to temporarily disrupt cell membranes, creating transient pores that allow DNA to enter cells. Since negatively charged DNA moves toward the positive electrode, researchers can target specific cell populations by positioning the electric field appropriately. This mechanism enables precise gene delivery to desired brain regions during development.
Q2: Why is in utero electroporation better than in vitro techniques for studying neural development?
In utero electroporation allows transfected cells to remain exposed to physiological cues that guide normal development, unlike cell culture or ex vivo techniques. This is particularly important in the brain, where structures such as axons require guidance cues from other cell types to develop properly. Studying cells in their natural environment provides more accurate insights into developmental mechanisms.
Q3: What is the purpose of Fast Green in the injection solution?
Fast Green is added to the plasmid DNA injection solution at 0.1% concentration to allow visualization of the injection solution within the embryo. This dye enables researchers to confirm accurate DNA delivery to the target brain region during the surgical procedure, ensuring successful transfection of the desired neural tissue.
Q4: How do paddle electrodes and needle electrodes differ in their applications?
Paddle electrodes target superficial brain regions such as the cortex and hippocampus, while smaller needle electrodes access deeper structures like the thalamus and hypothalamus. The choice of electrode type depends on the location of the target tissue within the developing brain, allowing researchers to deliver genes to specific neural populations based on their anatomical position.
Q5: What are the main applications of in utero electroporation in neurobiology research?
In utero electroporation enables investigation of how specific genes contribute to neural development by overexpressing wildtype or mutant proteins or blocking protein expression. Researchers can also visualize specific cell populations and their connections by delivering fluorescent protein sequences into neural tissue. Additionally, neurological phenotypes can be assessed at microscopic or organismal levels to understand gene function in development.
Q6: How does the timing of electroporation allow targeting of different neural cell populations?
Brain development involves a programmed series of proliferation and migration events, meaning different tissue layers can be targeted based on when electroporation is performed. By timing the procedure to coincide with specific developmental stages, researchers can selectively transfect neural progenitors, migrating neurons, or other cell types present at particular embryonic ages, enabling stage-specific genetic manipulation.
Q7: What is in vivo electroporation and how does it extend in utero electroporation research?
In vivo electroporation follows the same basic steps as in utero electroporation but is performed within the first few days after birth. This modified technique is particularly useful for studying later-born cell types, such as those found within the olfactory bulb, allowing researchers to investigate neural development events that occur after birth when in utero manipulation is no longer possible.