Farelerde In Utero Elektroporasyon

In utero elektroporasyon, nörogelişimi yönlendiren moleküler mekanizmaları incelemek için temel bir tekniktir. Gelişmekte olan kemirgen beyninin belirli bölgelerinde gen ekspresyonunu değiştirmek için DNA enjekte ederek araştırmacılar; nöral hücrelerin proliferasyonunu, diferansiyasyonunu, migrasyonunu ve maturasyonunu doğal ortamları bağlamında inceleyebilirler.

Bu video, in utero elektroporasyonun arkasındaki temel prensipleri, tekniğin nasıl uygulanacağına dair temel bir genel bakışı ve nörobiyoloji araştırmalarındaki uygulamalarını tanıtacaktır.

Bu prosedürün nasıl gerçekleştirileceğine değinmeden önce, elektroporasyonun bazı temel ilkelerini inceleyelim. Bu prosedür, hücre membranlarında DNA'nın hücreye girmesine izin veren geçici gözenekler oluşturan elektriksel darbeler kullanır. Negatif yüklü DNA pozitif elektroda doğru hareket edeceğinden, elektrik alanının konumlandırılmasına bağlı olarak farklı hücre popülasyonları hedeflenebilir.

Elektroporasyon geleneksel olarak in vitro çalışmalarda kullanılmış olsa da, bilimsel gelişmeler kullanım alanını in utero gelişen fare embriyolarında bulunanlar da dahil olmak üzere sağlam organlara kadar genişletmiştir.

Uterus içi elektroporasyon, hücre kültürü veya ex vivo tekniklerinin aksine, transfect edilen hücrelerin normal gelişimi yönlendiren tüm fizyolojik işaretlere maruz kalmaya devam etmesi avantajına sahiptir. Bu, özellikle aksonlar gibi yapıların düzgün gelişmek için diğer hücre tiplerinden gelen yönlendirici işaretlere ihtiyaç duyduğu beyinde oldukça önemlidir.

Özellikle beyin gelişimi, programlanmış bir proliferasyon ve migrasyon olaylar dizisini içerir; bu da elektroporasyonun zamanlamasına göre farklı doku tabakalarının hedeflenebileceği anlamına gelir.

Son olarak, farklı elektrot tiplerinin mevcut olması, araştırmacıların hem beynin yüzeyine yakın bölgelere hem de daha derin alanlara erişmesine olanak tanır. Korteks ve hipokampus gibi beynin yüzeysel kısımları hedeflenirken palet elektrotlar kullanılırken, talamus ve hipotalamus gibi derin yapılar hedeflendiğinde daha küçük iğne elektrotlar kullanılır.

Tekniğin arkasındaki bazı temel ilkeleri tartıştıktan sonra, cerrahi prosedür ve in utero elektroporasyona derinlemesine girebilmek için hazırlıklarımızı tamamlayalım.

Öncelikle, tüm aletleri sterilize edin ve cerrahi alanı %70 etanol ile silin. Ardından, plazmit DNA'yı %0,1 Fast Green içeren steril PBS içinde çözerek bir enjeksiyon solüsyonu hazırlayın. Fast Green, enjeksiyon solüsyonunun embriyo içinde görselleştirilmesini sağlamak için eklenir. Son olarak, amniyotik sıvı kaybını ve buna bağlı fetal mortaliteyi azaltmak için bir iğne çekici (needle puller) kullanılarak ultra ince bir iğne oluşturulmalıdır.

Her şey hazırlandıktan sonra, gelişmekte olan kemirgenlerde beyin dokusuna elektroporasyon yapmanın temel adımlarını inceleyelim. İşleme, gebe bir anneyi %5 isoflurane ile anestezi ederek başlayın, ardından prosedür boyunca %2,25 isoflurane veren bir respiratör tüpüne transfer edin. Ardından, ameliyat sonrası ağrı kesici olarak buprenorfin gibi bir analjeziği deri altına uygulayın. Daha sonra karnı tıraş edin ve insizyon bölgesini sterilize edin.

Uterusu cerrahi olarak açığa çıkarmak için, derinin orta hattı boyunca dikey bir insizyon yapın ve makas kullanarak peritonyumu kesin. Embriyoların kurumasını önlemek için açıklığı steril salinle ıslatılmış gazlı bezle kapatın. Ardından, embriyo zincirini, önceden ısıtılmış steril salinle kapatarak embriyoları ıslak tuttuğunuzdan emin olarak karın boşluğundan nazikçe dışarı çekin.

Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, beyne kolay erişim için uygun konumdaki embriyoları belirleyin. Parmaklarınızla veya pensle embriyonun başını sabitleyin ve DNA solüsyonunu uterus duvarı üzerinden beyne enjekte edin. Pozitif elektrot, DNA'nın elektropore edilmesini istediğiniz yöne gelecek şekilde, başın her iki yanına birer elektrot yerleştirin. Uygun konumdaki tüm embriyolar elektropore edildikten sonra, uterus boynuzunu dikkatlice karın boşluğuna geri yerleştirin.

İnsizyonu kapatmadan önce, boşluğa 2 - 3 ml ılık salin ekleyin. Peritonyumu emilebilir sütürlerle birlikte dikin, ardından cildi zımba kullanarak kapatın. Son olarak, fareyi ısıtma pedli bir kafese transfer edin ve izleyin.

in utero elektroporasyonun nasıl gerçekleştirileceğini incelediğimize göre, şimdi bu tekniğin bazı ileri uygulamalarını değerlendirelim.

In utero elektroporasyon, belirli genlerin sinirsel gelişime nasıl katkıda bulunduğunu araştırmak için yararlı bir araçtır. Elektropore edilen konstrüktler, yabani tip veya mutant proteinlerin aşırı ekspresyonuna rehberlik edebilir veya protein ekspresyonunu tamamen engelleyebilir. Ardından, nörolojik fenotipler mikroskobik veya organizma düzeyinde değerlendirilebilir. Örneğin, bu araştırmacılar, gelişmekte olan fare beyninde şizofreni ile ilişkili DISC-1 geninin geçici aşırı ekspresyonunun, yaşamın ilerleyen dönemlerinde amfetamine karşı aşırı duyarlılıkla sonuçlandığını belirlemişlerdir.

In utero elektroporasyon, floresan proteinleri kodlayan dizileri sinir dokusuna ileterek, belirli hücre popülasyonlarının ve kurdukları bağlantıların görselleştirilmesi için de faydalı olabilir. Örneğin, bu araştırmacılar, görsel bilgileri gözden beyne ileten retinal ganglion hücrelerini (RGC'ler) incelemek için E13.5 retinalarına yeşil floresan protein genini elektropore etmişlerdir. E18.5'te retinaların incelenmesi, bu tekniğin RGC aksonunun optik sinir, optik kiazma ve optik traktus boyunca izlediği yolu takip etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Son olarak, sinirsel gelişimdeki birçok önemli olay doğumdan sonra meydana gelir; bu da bilim insanlarını in vivo elektroporasyon olarak adlandırılan modifiye bir teknik geliştirmeye teşvik etmiştir. Bu prosedür, in utero elektroporasyonla aynı temel adımları takip eder ancak genellikle doğumdan sonraki ilk birkaç gün içinde gerçekleştirilir. Postnatal genetik manipülasyon, özellikle burada gösterilen olfaktör bulbus içinde bulunanlar gibi daha geç oluşan hücre tiplerini incelemek için yararlıdır.

JoVE'nin in utero elektroporasyon hakkındaki videosunu izlediniz. Bu video, in utero elektroporasyonun nasıl gerçekleştirileceğine dair temel ilkeleri ve genel bir bakışı, ayrıca araştırmacıların nörogelişimi yönlendiren moleküler mekanizmaları incelemesine olanak tanıyan birkaç alt uygulamayı içermektedir.

İzlediğiniz için teşekkürler!