1.14: Murin In Utero Elektroporasyonu

İn utero elektroporasyon, nörogelişimi yönlendiren moleküler mekanizmaları incelemek için anahtar bir tekniktir. Araştırmacılar, gelişmekte olan kemirgen beyninin belirli bölgelerinde gen ekspresyonunu değiştirmek için DNA enjekte ederek, nöral hücrelerin çoğalmasını, farklılaşmasını, göçünü ve olgunlaşmasını doğal ortamları bağlamında inceleyebilirler.

Bu video, in utero elektroporasyonun arkasındaki temel ilkeleri, tekniğin nasıl uygulanacağına dair temel bir genel bakışı ve nörobiyoloji araştırmalarındaki uygulamalarını tanıtacaktır.

Bu prosedürün nasıl gerçekleştirileceğini incelemeden önce, önce bazı elektroporasyon ilkelerini gözden geçirelim. Bu prosedür, hücre zarlarında geçici gözenekler oluşturan ve DNA'nın hücreye girmesine izin veren elektrik darbelerini kullanır. Negatif yüklü DNA, pozitif elektroda doğru hareket edeceğinden, elektrik alanının konumuna bağlı olarak farklı hücre popülasyonları hedeflenebilir.

Elektroporasyon geleneksel olarak in vitro çalışmalarda kullanılmış olsa da, bilimsel gelişmeler, uteroda gelişen fare embriyolarında bulunanlar da dahil olmak üzere sağlam organlara kullanımını genişletmiştir.

İn utero elektroporasyon, hücre kültürü veya ex vivo tekniklerden farklı olarak, transfekte edilmiş hücrelerin normal gelişimi yönlendiren tüm fizyolojik ipuçlarına maruz kalmaya devam etmesi avantajına sahiptir. Bu, aksonlar gibi yapıların düzgün bir şekilde gelişmek için diğer hücre tiplerinden rehberlik ipuçlarına ihtiyaç duyduğu beyinde özellikle önemlidir.

Özellikle beyin gelişimi, programlanmış bir dizi proliferasyon ve göç olayını içerir, bu da elektroporasyonun zamanlamasına bağlı olarak farklı doku katmanlarının hedeflenebileceği anlamına gelir.

Son olarak, farklı elektrot türlerinin mevcudiyeti, araştırmacıların hem beynin yüzeyine yakın bölgelere hem de daha derin alanlara erişmesine izin verir. Kürek elektrotları, beynin korteks ve hipokampus gibi yüzeysel kısımlarını hedeflerken kullanılırken, talamus ve hipotalamus gibi derin yapıları hedeflerken daha küçük iğne elektrotları kullanılır.

Artık tekniğin arkasındaki bazı temel prensipleri tartıştığımıza göre, hazırlıklarımızı bir kenara bırakalım, böylece cerrahi prosedüre ve utero elektroporasyona girebiliriz.

İlk olarak, tüm aletleri sterilize edin ve cerrahi alanı% 70 etanol ile silin. Daha sonra,% 0.1 Fast Green içeren steril PBS içinde plazmit DNA'yı çözerek bir enjeksiyon çözeltisi yapın. Hızlı Yeşil, embriyodaki enjeksiyon çözeltisinin görselleştirilmesine izin vermek için eklenir. Son olarak, bir iğne çektirme kullanılarak, amniyotik sıvı kaybını ve ardından fetal mortaliteyi azaltmak için ultra ince bir iğne oluşturulmalıdır.

Artık her şeyi hazırladığımıza göre, gelişmekte olan kemirgenlerde beyin dokusunu elektroporatörlük yapmak için temel adımları gözden geçirelim. % 5 izofluran kullanarak hamile bir barajı uyuşturarak başlayın, ardından prosedürün tamamı için% 2.25 izofluran sağlayan bir solunum tüpüne aktarın. Daha sonra, ameliyat sonrası ağrıyı hafifletmek için, deri altına buprenorfin gibi bir analjezik verin. Ardından karnı tıraş edin ve kesi bölgesini sterilize edin.

Uterusu cerrahi olarak ortaya çıkarmak için, ciltte orta hat boyunca dikey bir kesi yapın ve makas kullanarak peritonu kesin. Embriyoların kurumasını önlemek için, açıklığı steril tuzlu suya batırılmış gazlı bezle örtün. Daha sonra, steril önceden ısıtılmış tuzlu su ile kaplayarak embriyoları ıslak tuttuğunuzdan emin olarak embriyonik zinciri karın boşluğundan nazikçe dışarı çekin.

Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, beyne kolay erişim için uygun şekilde konumlandırılmış embriyoları tanımlayın. Parmaklarınızı veya forsepslerinizi kullanarak embriyonun başını stabilize edin ve DNA çözeltisini rahim duvarından beyne enjekte edin. Başın her iki tarafına, pozitif elektrot DNA'nın elektroporasyonunu istediğiniz yönde olacak şekilde bir elektrot yerleştirin. Uygun şekilde konumlandırılmış tüm embriyolar elektropore edildikten sonra, uterus boynuzunu dikkatlice karın boşluğuna geri yerleştirin.

Kesi kapatmadan önce, boşluğa 2-3 ml ılık salin ekleyin. Peritonu emilebilir dikişlerle birlikte dikin, ardından cildi zımba kullanarak kapatın. Son olarak, fareyi bir ısıtma yastığı ve monitörü olan bir kafese aktarın.

Artık utero elektroporasyonun nasıl gerçekleştirileceğini gözden geçirdiğimize göre, bu tekniğin bazı aşağı akış uygulamalarını inceleyelim.

In utero elektroporasyon, belirli genlerin nöral gelişime nasıl katkıda bulunduğunu araştırmak için yararlı bir araçtır. Elektroporasyonlu yapılar, vahşi tip veya mutant proteinlerin aşırı ekspresyonunu yönlendirebilir veya protein ekspresyonunu tamamen bloke edebilir. Nörolojik fenotipler daha sonra mikroskobik veya organizma düzeyinde değerlendirilebilir. Örneğin, bu deneyciler, gelişmekte olan fare beyninde şizofreni ile ilişkili gen olan DISC-1'in geçici olarak aşırı ekspresyonunun, yaşamın ilerleyen dönemlerinde amfetamine karşı aşırı duyarlılığa yol açtığını belirlediler.

İn utero elektroporasyon, floresan proteinleri nöral dokuya kodlayan diziler sunarak belirli hücre popülasyonlarını ve yaptıkları bağlantıları görselleştirmek için de yararlı olabilir. Örneğin, bu deneyciler, gözden beyne görsel bilgi ileten retinal ganglion hücrelerini veya RGC'leri incelemek için yeşil floresan protein genini E13.5 retinalarına elektropore ettiler. E18.5'teki retinaların incelenmesi, bu tekniğin RGC aksonunun optik sinir, optik kiazma ve optik yol boyunca yolunu izlemek için nasıl kullanılabileceğini gösterir.

Son olarak, nöral gelişimdeki birçok önemli olay doğumdan sonra meydana gelir ve bilim adamlarına in vivo elektroporasyon adı verilen modifiye bir teknik geliştirmeleri için ilham verir. Bu prosedür, utero elektroporasyon ile aynı temel adımları takip eder, ancak genellikle doğumdan sonraki ilk birkaç gün içinde gerçekleştirilir. Doğum sonrası genetik manipülasyon, burada gösterilen koku soğancığı içinde bulunanlar gibi daha sonra doğan hücre tiplerini incelemek için özellikle yararlıdır.

Az önce JoVE'nin in utero elektroporasyon videosunu izlediniz. Bu video, utero elektroporasyonun nasıl gerçekleştirileceğine dair temel ilkeler ve temel bir genel bakışın yanı sıra, araştırmacıların nörogelişimi yönlendiren moleküler mekanizmaları araştırmasına olanak tanıyan birkaç alt uygulama içeriyordu.

İzlediğiniz için teşekkürler!