Fizyolojik Kayıtlar ve Sarı-ateş Sivrisinek Tat Çıkıntılara RNA Sıralama Aedes aegypti

Bu prosedürün genel amacı, böceklerde tat alma nöronlarının tepkilerini gözlemlemek ve tat alma dokularındaki gen ekspresyonunu ölçmektir. Bu, ilk olarak belirli tat tüylerinin farklı konsantrasyonlarda çeşitli tatlara verdiği tepkilerin kaydedilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, tat dokularını dikkatlice incelemektir.

Daha sonra örnekleri cinsiyete ve eklere göre ayırın. Daha sonra, her doku örneğinden toplam RNA'yı izole edin ve yeni nesil dizileme ve QPCR için CD NA preparatları oluşturun. Son adım, gen ekspresyon verilerini analiz etmek ve ifade edilen kemos duyusal genlerin böceklerdeki tatlara fizyolojik tepkilere nasıl aracılık ettiği gibi hipotezler oluşturmaktır.

Sonuç olarak, böcek tat alma sisteminin alıcı aralığını göstermek için elektrofizyolojik kayıtlar kullanılır ve tatlandırıcı dokunun RNA dizilimi, tat alımının en önemli genetik bileşenlerini vurgulamak için kullanılır. Genel olarak, bu yöntemlere yeni olan bireyler, böcek kemoterapisinin küçük boyutu nedeniyle mücadele edeceklerdir. Duyusal ekler.

İster küçük böcek organlarından diseksiyon ister kayıt olsun, hastalarda pratik yapmak bu tekniklere hakim olmanın anahtarıdır. Bu işleme başlamak için, diseksiyon mikroskobu altında cam kılcal bir pipet çektirme makinesine ince uçlu bir kayıt elektrodu çekin. Elektrot ucunu, açıklığı hedef santimetreyi saracak kadar geniş, ancak komşu yapılarla temas etmeyecek kadar küçük olacak şekilde dikkatlice kırın.

Daha sonra, dondurucuda eksi 20 santigrat derecede 20 saniye boyunca iki ila dört yetişkin böceği uyuşturun. Bundan sonra, küçük selofan bant şeritleri içeren bir kapak fişi kullanarak böceklerden birini hareketsiz hale getirin. Mikroskop altında.

Hedef sensörü morfolojisi ve konumu ile tanımlayın ve hayvanı, elektrot giriş açısından ona serbest erişime izin verecek şekilde yönlendirin. Daha sonra dorsal göğüs kafesine bir tungsten tel yerleştirin. Toprak elektrodu olarak hizmet etmek için, cam elektrodu uçtan ilgili uyarıcı bir çözelti ile doldurun.

Ucu aşağıda tutarken hava kabarcıklarını dışarı doğru itin. Kayıt ve uyarıcı elektrot olarak işlev görmesi için elektrotun içine gümüş bir tel yerleştirin. Bundan sonra, elektrotları, nöronal aktiviteyi yakalamak için çökeltme süresinin azaltılmasına izin veren bir ön amplifikatöre bağlayın.

Ön amplifikatör, elektrik sinyallerini toplamak, depolamak ve analiz etmek için spike kayıt yazılımı ile donatılmış bir bilgisayara bağlanır. Şimdi işlevselliğini sağlamak için centum'u bir kontrol solüsyonu ile teşvik edin. Uyaran artefaktını takip eden 200 milisaniye sonra başlayan ani artışları sayın.

Doz yanıt sonuçlarını elde etmek için. Santimetreyi deneysel kimyasalın artan konsantrasyonlarına maruz bırakın ve yeterli geri kazanımı sağlamak için stimülasyonlar arasında en az üç dakikalık aralıklarla izin verin. Bu prosedürde, kuru buz ile sığ bir soğutucu hazırlayın.

Doku toplama tüpleri için, farklı doku türlerinin toplanması için 1.5 mililitre RNA içermeyen geçmeli kapaklı tüpleri etiketleyin. Aşırı yoğuşmayı önlemek için tüpleri kapalı tutun. Daha sonra, eksi 20 santigrat derece dondurucuda 30 ila 40 sivrisineği 15 ila 30 saniye boyunca uyuşturun.

Daha sonra anestezi uygulanmış sivrisinekleri soğuk bir aşamaya aktarın ve cinsiyete göre sıralayın. Böceklerin sırt tarafını kanatlarını kavrayarak aşağı çevirin, tat eklerine zarar vermemeye dikkat edin. Diseksiyon mikroskobu altında, sivrisinek pro Bois'i etiketin hemen yakınında nazikçe kavrayarak eşleştirilmiş Bella veya tarsi etiketini erkeklerden veya dişilerden ayırın.

Bella, iç kalemi ortaya çıkarmak için bir çift forseps ile ve diğer forseps çiftiyle etiketi çıkarın. Daha sonra dokuyu tarsal doku için soğuk toplama tüpüne yerleştirin. Sivrisinek bacağını tibia ve ilk tarsal segmentin birleştiği yerde nazikçe kavrayın ve tarsi'yi çıkarın.

Daha sonra dokuyu soğuk etiketli tüpe yerleştirin. Dokuyu tüpün dibinde tutmak için toplama tüplerini sıfır derece Celsius santrifüjde 9.000 kez yerçekiminde bir dakika döndürün. Diseksiyon sırasında toplama tüplerinde nem birikirse, toplanan dokuyu kaplamak ve korumak için 50 mikrolitre soğuk triol reaktifi ekleyin.

Tüpleri sıvı nitrojen içeren 1,5 mililitrelik tüp rafında dondurun. Bundan sonra, doku bozulmadan önce kuru buz üzerinde soğutarak sıkıca oturan RNA içermeyen tokmakları hazırlayın. Sonra dokuyu ince toz haline getirin ve bir kez daha tekrarlayın.

Toplam triol hacmini bir mililitreye getirin ve yeniden canlandırın. Zemin dokusunu girdap yaparak askıya alın. Bundan sonra, zemin dokusuna 200 mikrolitre kloroform ekleyin ve iyice karıştırın.

Oda sıcaklığında beş dakika sonra, 15 dakika boyunca yerçekiminin 11.000 katı sıcaklıkta dört santigrat derecede santrifüjde döndürün. Sulu tabakayı dikkatlice doğrudan bir genomik DNA filtre kolonuna ekleyin. Sonra beş dakika boyunca yerçekiminin 11.000 katı kadar döndürün.

Akışa eşit hacimde RNA içermeyen %70 etanol ekleyin ve pipetleyerek karıştırın. Sıvıyı bir RNA toplama kolonuna aktarın ve RNA ekstraksiyonuna devam edin. Bundan sonra, toplam RNA'nın saflığını hassas bir spektrofotometrede ölçün ve değerlendirin ve herhangi bir standart RNA dizileme yöntemiyle devam edin.

Yardımcının E GTI tat illetinden elde edilen aksiyon potansiyellerinin iz kayıtları, çeşitli kimyasallarla doğrudan stimülasyonun etkinliğini göstermektedir. Bu teknik, 500 milisaniyeden daha kısa makul bir zaman aralığında belirli bir genlik ve sürenin sivri uçlarını sayarak herhangi bir uyarıcı kimyasala verilen yanıtları ölçmek için kullanılabilir. Bu üç sivri uç, farklı hassasiyetlere sahip üç duyusal nöron alt tipine karşılık gelir.

RNA-Seq veri setleri için biyolojik replikatlar, doku toplamanın maliyeti veya zorluğu ile sınırlı olabilir. Q-R-T-P-C-R, toplam gen ekspresyonunun küçük alt kümelerini daha az maliyetle doğrulama yeteneği sunar ve daha az kaynak gerektirir. Sol panelde yan yana gösterilen RNA, RN Aeq tarafından belirlenen bağıl ifade ile Q-R-T-P-C-R tarafından belirlenen bağıl ifade arasında bir karşılaştırmadır.

Bu iki yöntem, gen bolluğu tahmini için farklı kimyalara dayanır. Sağ panelde grafiksel olarak görüntülenen istatistiksel eşdeğerlik fonksiyonları, her durumda kesinlik sınırlarını gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, RNA izolasyonu için böcek dokusunun nasıl kesileceğini ve canlı böceklerin tat tüylerinden gelen nöral sinyallerin nasıl kaydedileceğini iyi anlamış olmalısınız.