Kuvvetlendiği Hsp104 Varyantlar kullanarak Maya Proteinopathy Modelleri Ayırma

Aşağıdaki deneyin amacı, protein yanlış katlanma bozuklukları ile ilişkili proteinlerin toksisitesini baskılayan varyantların seçimi için HS P 1 0 4 kütüphanelerini taramaktır. Bu, HSP 1 0 4 varyant kütüphanelerinin maya ve koekste hastalıkla ilişkili bir substrat ile birlikte dönüştürülmesi ve iki proteinin ikinci bir adım olarak eksprese edilmesiyle elde edilir. Seçilen maya, HSP 1 0 4 plazmid için karşı seçim yapmak üzere beş Floretik asit veya beş FOA ile muamele edilir.

Daha sonra, isabetler, mutagen bölgesinin koloni PCR ile amplifiye edilmesi veya HSP 1 0 4 genindeki mutasyonların tanımlanması ile sıralanır. Sonuç olarak, hastalıkla ilişkili substratın toksisitesinin baskılanması, daha fazla karakterizasyon için en umut verici olan HS P 1 0 4 varyantlarını tanımlamak için değerlendirilebilir. Bu tekniğin, bağlanmaya dayalı seçimler gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bu tekniğin, hastalıkla ilişkili substratın toksisitesini baskılayan varyantların seçimine izin vermesidir.

Bu yöntem, protein yanlış katlanmasını tersine çevirebilecek proteinleri belirleyerek protein katlanması alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu yöntem HS P 1 0 4 potansiyasyonu hakkında bilgi sağlayabilse de, mayada toksik olan herhangi bir substratın toksisite baskılanması için herhangi bir proteinin tarama kütüphanelerine de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler mücadele edecektir, çünkü geçerli isabetler bulmak için birçok koloninin taranması gerekebilir Protea toksisitesinin baskılanmasını taramak için, HSP 1 0 4 kolonilerini plakalardan rafinoz takviyeli bırakma ortamı, serolojik bir pipet ve steril ahşap ile yıkayarak başlayın ve aplikatörler sıvı yıkamaları 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarır ve herhangi bir hücre kümesini ayırmak için kolonileri iyice girdaplar.

Daha sonra, hücre süspansiyonunu hafif bulanık bir kültüre seyreltin ve hücreleri gece boyunca Rafinoz bırakma ortamında 30 santigrat derecede çalkalanarak büyütün. HSP 1 0 4 vahşi türünü ve vektör kontrollerini de şu anda paralel olarak büyütün. Ertesi sabah plakası, tek kolonili grup başına en az bir plaka oluşturmak için bireysel galaktoz plakaları üzerine bir dizi hücre konsantrasyonu

Vektör ve HSP 1 0 4 dünya tipi kültürleri kütüphane ve plakanın OD 600'üne normalleştirin. Seçimi değerlendirmek için kütüphanenin büyümesini kontrollere göre karşılaştırmak için bu hücrelerin deneysel suş konsantrasyonlarına eşit hacimleri. Sıkılık ayrıca kütüphaneyi glikoz baskılayıcı ortam üzerine kaplar ve daha sonra tüm plakaları 30 santigrat derecede iki ila üç gün boyunca inkübe eder, koloniler hücrelerin seçimi için beş FOA kullanıyor gibi görünene kadar, artık HSP 1 0 4 eksprese eden plazmitler, her bir suştan tek kolonileri 30 santigrat derecede gece boyunca inkübasyon başına çift ve tek bırakmalı ortam plakalarına iki kopya halinde çıkarır.

Bu plakalar, plakaların kurumasını önlemek için daha sonra sıralama için kullanılacaktır. SD hiss Euro plakalarını para filme sarın ve beş FOA ekranını gerçekleştirirken dört santigrat dereceye takın. Daha sonra, tek koloniler görünene kadar 30 santigrat derecede bir ila iki günlük bir inkübasyon için kolonileri SD tıslama plakalarından beş FOA plakası üzerinde tek kolonilere doğru çizgileyin. Önümüzdeki.

Her beş FOA plakasından seçin ve çizgi çizin. Hayatta kalan üç koloni, 30 santigrat derecede bir ila iki günlük inkübasyondan sonra hayatta kalan koloni başına bir SD Euro ve bir SD onun plakasına yerleştirilir. HSP 1 0 4 plazmidini kaybeden koloniler SD tıslama plakalarında büyüyecek, ancak SD Euro plakalarında büyümeyecektir.

Bu suşları 96'da rafinoz bırakma ortamında doygunluğa kadar büyütün. Derin kuyu iki mililitrelik plakalar gece boyunca 30 santigrat derecede çalkalanarak. Ardından, herhangi bir yanlış pozitifi ortadan kaldırmak için bir lekelenme testi yapın.

İnkübasyonun sonuna doğru, kuyu başına 200 mikrolitre rafinoz bırakma ortamını yeni bir 96 oyuklu plakaya ayırmak için çok kanallı bir pipet bulunur ve düzgün kültürler için birinci ve yedinci sütunları ayırır. Daha sonra, 16 doymuş kültürün her birinden 250 mikrolitreyi plakanın birinci ve yedinci sütunlarına ayırın ve kültürleri plakanın her bir sütununa beş kat seri olarak seyreltin ve çok kanallı pipetle iyice karıştırın. Daha sonra, eşit lekelenmeyi sağlamak için, her bir oyuğun nihai hacminin 200 mikrolitre olduğundan emin olmak için seyreltilmiş kültürün 50 mikrolitresini altıncı ve 12. sütunlardan çıkarın.

Ardından, kültürleri SD tıslama ve escal tıslama plakalarına kopya halinde tespit etmek için 96 voltluk bir çoğaltıcı alet kullanın. 30 santigrat derecede iki ila üç günlük bir inkübasyondan sonra, escal tıslama plakaları üzerinde toksisite sergileyen sıralama suşlarını seçin. Kontrollerinkine benzer şekilde, kontroller atılabileceği kadar toksik olmayan yanlış pozitif suşlar.

Ayrıca sd üzerinde büyüme kusuru gösteren suşları da atın. Onun plakaları veya tek başına hastalık substratından önemli ölçüde daha fazla toksisite sergileyen. HSP 1 0 4 varyantlarını koloni PCR'ye göre sıralamak için, önce SD hiss Euro plakalarından yaklaşık 10 mikrolitre mayayı PCR soyulmuş tüplerde üç mikrolitre 20 mili sodyum hidroksite kazıyarak hücreleri dondurarak çözdürün.

İlk önce şeritleri eksi 80 derecelik bir dondurucuya yerleştirin. Dondurucuda 10 dakika sonra, tüpleri termosiklerde 99 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin ve ardından suşları yüksek bir astar konsantrasyonu kullanarak PCR dereceli su ile 100 mikrolitreye seyreltin. Ardından, numuneler üzerinde standart bir PCR programı çalıştırın ve ardından uygun boyutta bir PCR ürününün amplifikasyonunu doğrulamak için numuneleri agel elektroforezi ile analiz edin.

Son olarak, mutasyonlar için sıralama kromatogramlarını kapsamlı bir şekilde analiz etmeye özen göstererek PCR ürünlerini sıralayın. Mutasyonlar, maya genellikle birden fazla plazmit içerdiğinden, belirli bir bölgeye iki nükleotidin bir karışımı olarak gözlemlenebilir. Bu temsili deneyde, orta alanda randomize edilmiş HSP 1 0 4 varyantlarından oluşan bir kütüphanenin oluşturulmasından sonra, kütüphane, galaktozla indüklenebilir TDP 43 ekspresyonu için bir plazmit barındıran mayaya dönüştürüldü.

Dönüştürücüler daha sonra geri kazanıldı ve ekranın sıkılığını değerlendirmek için glikoz ve galaktoz plakaları üzerine kaplandı. İlk ekranda seçilen varyantların bir alt kümesinin beş FOA tedavisi tespit testini takiben. Seçilen dört koloniden ikisinin HSP 1 0 4 gösterdiğini, TDP 43 toksisite baskılamasına aracılık ettiğini gösterdi.

Biri yanlış pozitifti ve diğeri artmış toksisite gösterdi. Beş FOA tedavisinin ardından, iki gerçek isabet daha sonra orta alan mutasyonlarını tanımlamak için koloni PCR ile sıralandı. Bu HS P 1 0 4 mutasyonları daha sonra ebeveyn HSP 1 0 4 plazmitinde, toksisite baskılanmalarını doğrulamak için bölgeye yönlendirilmiş mutajenez ile yapılabilir Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, beş FO'da bir seferde 200'e kadar isabeti taramak için kullanılabilir, uygun şekilde gerçekleştirilirse bir ila iki hafta boyunca bir adım.

Bu prosedürü denerken, bu prosedürü takiben genellikle plazmit karışımları elde edildiğinden, sıralama sonuçlarını dikkatli bir şekilde analiz etmek önemlidir. Floresan mikroskobu gibi diğer yöntemler, HSP 1 0 4 varyantlarının hastalıkla ilişkili substratın agregasyonunu nasıl etkilediği gibi ek soruları yanıtlamaya yardımcı olmak için gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, toksisite baskılayıcıların seçimi için HSP 1 0 4 varyantlarının kitaplıklarının nasıl taranacağını iyi anlamalısınız.