1.13: Nöral dokunun eksplant kültürü

Eksplant kültürleri, belirli hücre popülasyonlarının ve nöral yapıların gelişimini araştırmak için bir teknik olarak hizmet eder. Gelişimsel sinirbilim deneylerinde, eksplantlar, in vitro olarak sürekli gelişim için bir embriyodan çıkarılan nöral dokulardır. Bu kültürler, araştırmacılara gelişmekte olan dokuları in vivo olarak mümkün olmayan şekillerde manipüle etme ve görselleştirme yeteneği verir. Bu videoda, ekilen dokularla çalışmanın ardındaki bazı önemli ilkeler, ekzost kültürüne yönelik iki yaklaşım için adım adım prosedürler ve bu tekniğin uygulamaları tanıtılacaktır.

Yöntemlere girmeden önce, bazı temel ilkeleri gözden geçirelim. Eksplantlar, bir dizi model organizmadan ve çeşitli doku tiplerinden oluşturulabilir. Genel olarak, kültürler, bir embriyodan nöral dokunun dikkatlice çıkarılması, ilgilenilen bir bölgenin parçalara ayrılması ve yapay bir ortama yerleştirilmesiyle oluşturulur.

Dokular ayrıca ince tabakalar halinde bölümlere ayrılabilir ve "dilim kültüründe" büyütülebilir. Kültür ortamı, tüm organın in vivo koşullarını taklit edecek şekilde tasarlandığından, bu kültür stratejisine genellikle "organotipik" denir.

Başlamadan önce aletlerinizi %70 etanol ile sterilize ettiğinizden emin olun. Ardından, laboratuvarınızın tercih ettiği yöntemi kullanarak hamile bir fareye ötenazi yapın. Daha sonra uterusu cerrahi olarak eksize edin ve buz gibi soğuk tampona yerleştirin. Çanağı bir diseksiyon mikroskobuna aktarın ve tek tek embriyoları yumurta sarısı kesesinden çıkarın. Daha sonra, beyni izole edin, ilgilendiğiniz bölgeyi dikkatlice inceleyin ve kültür ortamı içeren bir kültür kabına aktarın. Eksplantlar, her 2-3 günde bir ortamın %50'si değiştirilerek %5 CO2 içeren 37 °C'lik bir inkübatörde birkaç hafta boyunca muhafaza edilebilir.

Beyin dokusunun dilim kültürü birkaç ekstra adım gerektirir. Seksiyondan önce, doku agaroz içine gömülür, bu da dokuya destek sağlar, böylece dilimlenirken bozulmadan kalır. Bunu yapmak için,% 1.5 düşük erime noktalı bir agaroz çözeltisi, agaroz çözülene kadar ısıtılır. Daha sonra, agaroz gömme kalıplara aktarılır ve dokuya zarar vermemek için hafifçe soğumaya bırakılır.

Doku daha sonra dikkatlice suya batırılabilir ve agaroz sertleşmeye bırakılabilir. Elde edilen bloklar kesilir ve daha sonra bir numune aşamasına yapıştırılır ve ince canlı doku dilimlerini kesmek için titreşimli bir bıçak kullanan bir alet olan bir vibratom kullanılarak kesitlere ayrılır. Dilimler oluşturulurken, bunlar dikkatlice kültür ortamı içeren kaplanmış bir plakaya aktarılır ve daha önce belirtildiği gibi kültürlenir.

Eksplant kültürlerinin in vivo ve diğer in vitro yöntemlere göre kullanılmasının bir takım avantajları vardır. İlk olarak, ekilen dokudaki hücreler deneysel araçlar için daha erişilebilirdir. İkincisi, eksplantların gelişmekte olan nöral dokunun karmaşık hücresel mimarisini sürdürmesi, hücre-hücre etkileşimlerinin incelenebileceği anlamına gelir. Üçüncüsü, kültür ortamının kimyasal bileşimini kontrol edebildikleri için, bilim adamları belirli bileşiklerin doku gelişimi üzerindeki etkisini test etmek için eksplantları kullanabilirler.

Bununla birlikte, doğal ortamından uzaklaştırıldığı için, in vitro olarak mutlu ve sağlıklı dokuyu korumak için özel dikkat gösterilmelidir. Örneğin, hücre dışı matrisin veya ECM'nin varlığı, hücre davranışı üzerinde önemli bir etkiye sahiptir, bu nedenle saflaştırılmış ECM proteinleri genellikle kültür kaplarını kaplamak için kullanılır. Bir diğer önemli husus, eksplantların yıkandığı çözeltidir. Geleneksel hücre kültürü ortamı sıklıkla kullanılsa da, bazı deneyler, merkezi sinir sisteminde dolaşan sıvıya çok benzeyen çözeltiler gerektirir: beyin omurilik sıvısı, birazdan göreceğiniz deneyler gibi deneylerde kritik bir reaktiftir.

Artık eksplant kültür yöntemlerini gözden geçirdiğimize göre, bu tekniklerin nasıl kullanıldığını görelim.

Hücre göçü tahlilleri, nöral hücre hareketinde yer alan itici ve çekici sinyalleri incelemek için ekilen dokuyu kullanır. Bu deneyde, daha önce büyüme faktörlerine batırılmış boncuklar, nöral hücre göçünü incelemek için arka beyin eksplantlarına implante edilir. 3-4 günlük maruziyetten sonra, nöronlar konfokal mikroskop kullanılarak görüntülendi. Sonuçlar, motor nöronların vasküler endotelyal büyüme faktörüne batırılmış boncuklara doğru göç ettiğini, ancak tampona batırılmış boncukları kontrol etmediğini göstermektedir.

Ko-kültür tahlilleri genellikle gelişim sırasında hücre-hücre etkileşimlerini araştırmak için kullanılır. Bu örnekte, omurilik segmentleri, omurilik motor nöronları ve iskelet kası arasındaki bağlantıların nasıl yapıldığını incelemek için bir kas hücresi tabakasının üzerine kültürlendi. Kuluçkadan 2 gün kadar kısa bir süre sonra, nörit olarak da bilinen nöronlardan gelen çıkıntıların eksplanttan çıktığı görülür. 5 gün içinde kas hücre tabakasının kasılması ile fonksiyonel innervasyon gözlenir.

Sinir sisteminin gelişimi sırasında, nöronların hedef doku ile merkezi sinir sistemi arasında bir bağlantı kurmak için aksonlarını uzatması gerekir. Bu karmaşık süreci incelemenin bir yolu, akson rehberlik tahlilleridir. Araştırmacılar, aksonu uygun konumuna yönlendirmeye yardımcı olan nöronlar içindeki ve çevredeki faktörleri incelemek için ekilen dokuları kullanırlar.

Az önce JoVE'nin nöral doku eksplant kültürü rehberini izlediniz. Bu video, eksplant kültürlerinin avantajlarına, kültür stratejilerine, yaygın olarak kullanılan iki eksplant prosedürünün adım adım protokollerine ve bu tekniklerin günümüzde laboratuvarda nasıl kullanıldığına dair bir genel bakışı kapsıyordu.

İzlediğiniz için teşekkürler!