Name: Yüksek Verim Dizilimine tarafından MicroRNA ölçümü için Küçük RNA molekülleri, yüksek Verimli ligasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
Description: Öğrenin, mikroRNA klonlama ve yüksek verimli dizileme yöntemiyle genom çapında mikroRNA ölçümünü. Bu teknik, gen düzenlemesindeki rollerini anlamak için transkriptom genelinde profil oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, bağlayıcı tasarımı ve ligasyon verimlilikleri ile ilgili verimli tartışmalar için Yi laboratuvarı üyelerine, özellikle Zhaojie Zhang'a ve bu çalışmayı JEL ile doktora sonrası burs (#125209) aracılığıyla destekleyen Amerikan Kanser Derneği'ne teşekkür eder. Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ulusal Artrit ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü tarafından da Ödül Numarası altında desteklenmiştir R01AR059697 (R.Y.'ye) ve Linda Crnic Down Sendromu Enstitüsü'nden bir araştırma bursu. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Not: Bu, tüm işlem boyunca RNase içermeyen koşulları sağlamak için çok önemlidir. 3 &#39;Bağlayıcının 1. Adenylation <ol><li> Nükleaz içermeyen H2O içinde 100 uM 3 ligasyon reaksiyonları için tasarlanmış DNA oligonükleotid seyreltin Not: oligonükleotidi bir 5 &#39;fosfat grubu, 5 bir randomize dinükleotid&#39; ucuna ve 3 &#39;dideoxycytosine olmalıdır. 5 PCP 10 &#39;fosfat grubu etkili 5 için Mth enzimin bir gerekliliktir&#39;. Fosfat doğrudan modifikasyonu ile bir polinükleotid kinaz ile oligonükleotidin ön-muamele ile ilave ya da istenebilir. 5 &#39;ucunda, randomize dinükleotit hangi belirli bir son uç diğerleri üzerinde 6 tepkileri birleştirilmesi için bir RNA ligaz sergiler sekansı tercih en aza indirmek için önemlidir. 3, oligonükleotid t &#39;ucuna dideoxycytosine 3 bir blokaj elemanının yerleştirir&#39;O sonraki bağlama adımları sırasında bağlayıcı-bağlayıcı konkatamerler oluşumunu inhibe eden ve aynı zamanda bağlama reaksiyonu, 11 3 &#39;3&#39;ün ucunda oluşturulan miRNA-Bağlayıcı molekülün ucunu&#39; için blok teşkil eder. Aşağıdaki gibi tarafsız miR-Dizi yöntemi için seçilen oligonükleotid linker dizisi olduğu için: 5&#39;PO 4 NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3. &#39; </li><li> 200 pmol 3 &#39;oligonükleotidi, 4 ul 10x için 5&#39; DNA adenilasyon tampon maddesi, 4 ul 1 mM ATP, 4 ul Mde RNA ligaz, nükleaz içermeyen H2O 40 ul&#39;lik nihai bir hacme kadar: Aşağıdaki adenilasyon reaksiyon bir araya getirin. </li><li> 1 saat boyunca 65 ° C&#39;de reaksiyon inkübe edin. 5 dakika boyunca 85 ° C&#39;ye ısıtılması yolu ile reaksiyonu bitirin. </li><li> Kalıntı ATP kaldırmak ve gelecekteki reaksiyonlarda beklenmedik ligasyonu önlemek için% 100 2.5 hacim etanol ve 10 M amonyum asetat 1/3 hacme ilavesiyle adenylated bağlayıcı çökeltilmesi. <ol><li> Kısaca, al karıştırıncohol, tuz ve 20 dakika boyunca 4 ° C&#39;de bir mikrosantrifüj içinde tam hızda eğirme homojenlik oligo çözeltisi (~ 15,000 xg). Adenylated oligo 50-100 uM vermek üzere nükleaz içermeyen H2O uygun hacimde% 70 etanol, kuru hava ve tekrar süspansiyon pelet yıkayın. </li></ol></li><li> % 18 poliakrilamidjeli çalıştırarak adenilasyon onaylayın. <ol><li> Birlikte, aşağıdakileri karıştırarak jel hazırlayın: 6.3 g üre,% 40 akrilamid 6.75 mi, ve 10x TBE 1.5 mi. H 2 O 15 ml ilave edilir. </li><li> Üre tamamen çözülene kadar karıştırın ve amonyum persülfat (BP), ve 15 ul tetramethlyethylenediamine (TEMED) (ağ / hac), 150 ul% 10 ekleyin. </li><li> Jel 1x TBE oda sıcaklığında tampon maddesi ile jel genişliğinin 24 V / cm &#39;de 30 dakika boyunca ön-run kurduğunda. Tamponu ile çalışan 30 dk kadar bir kez yıkayın kuyular. </li><li> Ile adenylated oligonükleotitlerin ve 2x denatüre RNA yükleyici tampon eşit hacimde (% 95 (h / h) formamid 5 pmol karıştırın% 0.02 SDS,% 0.02 bromofenol mavisi (ağırlık / hacim),% 0.01 (ağırlık / hacim) (w / v) Ksilen siyanol, 1.0 mM EDTA) içinde, ısı kısa bir süre için 75 ° C ve buz üzerinde soğutuldu oturmaktadır. Jelin kuyuya, örneğin tamamına koyun. Aynı zamanda, bir sigara adenylated kontrol benzer bir miktar ve düşük molekül ağırlıklı boyutu standartlarına uygun bulunmaktadır. </li><li> Bromofenol mavi jel tabanına yol ¾&#39;ünü kadar 24 V / cm jel üzerinde çalıştırıldı. 1x TBE 1x SYBR-altın çözeltisi ile cihaz, post-leke jel sökmeye ve UV-transilluminator&#39;de kutusu (Şekil 2) görselleştirmek. Not: girdi RNA örnekleri ile karşılaştırıldığında Jel &quot;, herhangi bir giriş RNA &#39;olarak kontrol PCR ürününün yüksek miktarda elde edilir, yukarıda tarif edilene benzer bir şekilde adenylated oligo temizler. </li></ol></li></ol> 2. Bağlayıcı Ligasyon miRNA 3 &#39;ucuna <ol><li> 3 &#39;Ligasyon <ol><li> (Ağ / hac) PEG 8000, 0.5 ve 1.0 ul% 50: sıraya uygun olarak buz üzerinde, aşağıdaki bileşenleri monte956. l 10x RNA ligaz tamponu (500mM Tris-HCI pH 7.5, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT), 1.0 ul, 3 &#39;Linker (100 uM), 0.5 ul RNaz inhibitörü, 0,5-8,0 ug toplam RNA, adenylated 0.5 ul T4 RNA ligaz, 2, 5 ul&#39;lik nihai bir hacme kadar nükleaz içermeyen H2O. </li><li> Çözelti girdaba çok viskoz olduğu gibi bağlı bir kez iyice karıştırılır PEG 8000 yüksek konsantrasyonu pipetleme tepkime karışımı ısıtılmış kapak ile, bir termal döngü reaksiyonu yerleştirin. 16 ° C&#39;ye kadar bloğu ayarlama, ve 4 saat süreyle inkübe edin. Not: Reaksiyon bağlanma verimliliği herhangi bir kayıp olmadan 20 ul bir son hacme kadar ölçeklendirilebilir. Çevre sıcaklığında 4 saat boyunca reaksiyona girmesi ya da gece boyunca 4 ° C &#39;de esas itibarıyla benzer bağlanma verimliliği elde edilir. </li></ol></li><li> Jel saflaştırma <ol><li> 3 &#39;Ligasyondan sonra, 2x RNA yükleyici tampon maddesinin eşit hacmi ile reaksiyona karıştırın. 5 dakika boyunca 70 ° C&#39;ye kadar ısı ve buz üzerinde serin ek. </li&gt; <li> PAGE arıtılması için bir% 15 poliakrilamid jeli üzerinde örnek çalıştırın. <ol><li> Adım 1.5&#39;te daha önce tarif edilene benzer bir şekilde, 7 M üre ihtiva eden bir% 15 poliakrilamid jelinde hazırlayın. </li><li> En az 30 dakika boyunca jel genişliği 24 V / cm jel ön çalıştırın. Öncesi dönemde aynı geriliminde güç kaynağı, floş kuyuları, yük örnek ve çalışma jel kapatın. </li><li> Örnek yükleyin ve Bromophenol mavi jel çıkıldı sadece kadar PAGE çalıştırın. Arzu edilen ürün, iksilen siyanol yakın hareket edecektir. </li></ol></li></ol></li><li> Boyama, Görselleştirme ve Eksizyon <ol><li> 15 dakika boyunca 1x çalışan tampon (TBE), 1x SYBR-altın ve kaya temiz tepsiye jel aparat ve yer jel sökmeye. </li><li> Boyanması çanak jel çıkarın ve temiz bir plastik wrap ile kaplı UV transilluminator&#39;de kutusunda görselleştirmek. Ligasyon ürünü, uzunluğu yaklaşık 45 nükleotid olacaktır. </li><li> Temiz bir Razo ile ligasyon ürünü içeren bölgeyi tüketim0.5 ml mikro-santrifüj tüpüne r bıçak ve yer. </li></ol></li><li> Ürün İzolasyon ve Yağış <ol><li> Pierce, 30 G iğne ile 0.5 ml mikrosantrifüj tüp alt ve ikinci bir temiz, düşük tutma deldi tüp yeri, 1.5 ml mikrosantrifüj tüp. ~ 15,000 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje. </li><li> Görme tüm jel dilim iç tüp delikten hareket ettiğini teyit etmektedir. Gerekirse, yakın deliğe bazı jel parçaları itmek için temiz bir pipet kullanın. </li><li> Boş 0.5 mi tüp atılır ve akrilamid bulamaca yüksek tuzlu kolon tamponu 400 ul (25 mM Tris-HCI pH 7.5,% 0.1 SDS HSCB 400 mM NaCl) ilave edin. Gece boyunca 4 ° C &#39;de kaya tüpü (s). </li><li> Geniş çaplı bir pipet kullanarak 0.22 mikron selüloz asetat spin kolon bulamaç aktarın. ~ 15,000 x g&#39;de, oda sıcaklığında 3 dakika boyunca santrifüje uzaklıkta akrilamid jel matrisi tüm sıvı toplamak. </li><li> Temiz, düşük tutma sıvı transfer, 1.5 ml tüp içerir20 mg / ml glikojen 1 ul ing. Bir izopropanol eşit hacim ve 10/1 inci hacim sodyum asetat ekleyin. Tüpü birkaç kez baş aşağı çevirerek çözeltisi karıştırın ve 20 dakika boyunca ° C sıcaklıkta dondurucuya -80 hızlandırabilir. </li><li> 20 dakika boyunca 4 ° C &#39;de tam hızda santrifüje nükleik asidi: pelet. Süpernatantı ve% 70 etanol içinde yıkayın. Havada kurutma, oda sıcaklığında 10 dakika süre ile pellet halindedir ve 5 &#39;bağlama adımı doğrudan devam edin. </li></ol></li></ol> Bağlayıcı Hybrid 3. Bağlayıcı ligasyon 5 &#39;miRNA-3 Sonu&#39; <ol><li> Tanelenmiş nükleik asit için, aşağıdaki bileşenler eklemek: 2 ul PEG 8000 (% 50 ağırlık / hacim), 0.5 ul 10x RNA ligaz tamponu, 0.5 ul ATP (10 mM), 0.5 ul NN-RNA, oligo (100 uM), ve H 4 ul bir son hacim 2 O. NOT: 5&#39;-ters dideoksi-TCUACAGUCCGACGAUCNN3 &quot;ifadesi ve üretici tarafından HPLC ile saflaştırıldı &#39;NN-RNA, oligo&#39; in bileşimi olup. </li><li> Karıştırmakaşağı defalarca yukarı pipetleme ve bu örnek. Pelet tamamen yeniden solübilize olmuştur emin olmak için bir süre (5 dk) için yapın. Yeniden-solübilizasyon sorunlu ise, 37 ° C örnek kısaca (3-5 dk) ısı ve karıştırmak için pipetlenmesini devam. </li><li> RNaz inhibitörü ve T4 RNA ligaz 1 (5 birim): 1&#39;lik bir karışımı topak çözelti içinde geri sonra, bir 1 1 ul içeren temiz bir PCR tüpü aktarılmaktadır. Yine aşağı yukarı pipetleme karıştırın. </li><li> 4 saat 37 ° C&#39;de bir termal döngü reaksiyonu inkübe edin. CDNA sentezi hemen geçin. </li></ol> 4. ters transkripsiyon / cDNA Sentezi <ol><li> 5 Aşağıdaki bileşenleri ekleme ligasyon reaksiyonu: 2 ul 5X RT tampon maddesi, 0,75 ul 100 mM DTT, 1 ul Illumina RT primer 5&#39;-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3 &#39;(1 uM) ve 0.5 ul dNTP (10 mM) getirilmiştir. </li><li> 5 dakika boyunca 65 ° C&#39;ye kadar pipetleme ve ısı ile karıştırın. Sonra yavaş yavaş tezgah t üzerinde soğumasınıop. </li><li> Reaksiyon, buz üzerinde, oda sıcaklığında, bir yer tüpüne soğutuldu ve ters transkriptaz enzimi ve RNase inhibitör her biri 0.5 ul ekleyin sonra. Imalatçının talimatlarında belirtildiği uzatma aşaması için ısı döngüleyici içinde pipetleme ve yerine göre karıştırın. </li><li> Tamamlandığında eklenti nükleaz içermeyen H2O 5 ul 15 ul kadar cDNA kütüphanesinin son hacmi getirmek. </li></ol> 5. Kütüphane hazırlanması <ol><li> Endeksleme PCR için, buz üzerinde, aşağıdaki reaksiyon monte: 6 ul 5x Phusion Tampon, 1 ul dNTP (10 mM), 0.9 ul DMSO, 0.75 ul 5 &#39;primer (25 uM), 0.75 ul 3&#39; primer (25 uM), 3 ul cDNA kütüphanesi (girdi miktarına bağlı olarak değişken konsantrasyon), 0.5 ul Phusion Polimeraz (1 ünite), 30 ul&#39;lik nihai bir hacme kadar nükleaz içermeyen H2O. Şablonun ve sıralama platformu ile uyumluluğu sağlamak için primer dizileri seçinseçim. <ol><li> 15 saniye için 72 ° C &#39;de uzanmaktadır, birinci 4 çevrim için, 3 dakika boyunca 98 ° C de ilk denaturasyon 15 sn için 50 ° C&#39;de 15 saniye, tavlama için 98 ° C denatüre: PCR, aşağıdaki ayarlarla bir reaksiyondan . NOT: giriş malzemenin miktarına bağlı olarak, toplam PCR çevrim numaraları değişir. Tipik olarak, toplam RNA 1-2 ug bir giriş için, 13 toplam PCR döngüleri mıR-Dizi kütüphane oluşturmak için yeterlidir. </li><li> Tavlama ve uzatma çevrimi bir araya getirilmiş ve 30 sn için ve denatürasyon için 70 ° C sıcaklıkta gerçekleştirilmektedir, iki aşamalı bir şekilde, örneğin daha sonraki aşamalarda, durulamalar, 5-12, yürütmek tekrar 15 sn için 98 ° C &#39;dir. Not: Reaksiyon hacmi PCR programı duraklatma izin veren ve arzu edilen ürün bir görünüm için izlemek için önceden belirlenmiş bir döngü sayılarında, 10 ul bir kısım kaldırmak üzere 30 ul. Tipik haliyle, çevrimleri 10, 13 ve 16 toplam RNA numunesinin test için seçilir. </li></ol></li><li> Hazırlamak% 40 akrilamid ve 2 ml 10x TBE 1 ml, ve H2O 10 ml karıştırılarak% 8 denatüre edici olmayan akrilamid jeli. Daha sonra% 10 APS 100 ul ve TEMED 10 ul ekle. Jel dökün ve set edelim. <ol><li> 30 dakika boyunca jel genişliği, 12 V / cm jel ön çalıştırın. Floş kuyular. 10x yükleme tamponu 1 ul ekle (15% Ficoll 400, 66 mM EDTA, 20 mM Tris-HCI, pH 8.0,% 0.1 (ağ / mavi / hacim) bromofenol hac) SDS,% 0.01 () 10 ul ekle boyutları her çukuruna 5 mm x 1 mm x 15 mm numune. Tipik olarak, her iyi örneklerin 30 ul yükleyebilirsiniz. Bromofenol mavi boya sadece jel alt bitene kadar 1x TBE tamponu içinde, jel genişliği 10 V / cm &#39;de örnek jel üzerinde çalıştırıldı. </li><li> Leke ve aşama 2.3&#39;de tarif edildiği gibi jel görselleştirmek. </li><li> 146 baz çift bant pulu ve Bölüm 2.4 de tarif edilene benzer bir şekilde, HSCB 0.25 ml, gece boyunca tasfiye edilir. Bir izopropanol eşit hacimde ve 10/1 inci hacim sodyum asetat DNA hızlandırabilir. % 70 e yıkama peletTE tamponunda -metanol ve tekrar süspansiyon. </li><li> Üreticinin tavsiyelerine göre PicoGreen kullanarak kütüphane niceliğini. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-ligase-dependent+biases+in+miRNA+representation+in+deep-sequenced+small+RNA+cDNA+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries.</a> RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).</li>
<li>Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+RNA+cloning+enables+accurate+quantification+of+miRNA+expression+by+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing.</a> Genome Biology. 14 (10), 109(2013).</li>
<li>Consortium, T. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ENCODE+%28ENCyclopedia+Of+DNA+Elements%29+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) Project.</a> Science. 306 (5696), 636-640 (2004).</li>
<li>Consortium, T. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Linsen, S. E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+and+possibilities+of+small+RNA+digital+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling.</a> Nature Methods. 6 (7), 474-476 (2009).</li>
<li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39 (21), 141(2011).</li>
<li>McLaughlin, L. W., Romaniuk, E., Romaniuk, P. J., Neilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+Acceptor+Oligoribonucleotide+Sequence+on+the+T4+RNA+Ligase+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Effect of Acceptor Oligoribonucleotide Sequence on the T4 RNA Ligase Reaction.</a> European Journal of Biochemistry. 125 (3), 639-643 (1982).</li>
<li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+bias+in+T4+RNA+ligase-mediated+3%E2%80%B2-adapter+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation.</a> Nucleic Acids Research. 40 (7), 54(2012).</li>
<li>Harrison, B., Zimmerman, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer-stimulated+ligation%3A+enhanced+ligation+of+oligo-+and+polynucleotides+by+T4+RNA+ligase+in+polymer+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions.</a> Nucleic Acids Research. 12 (21), 8235-8251 (1984).</li>
<li>Torchia, C., Takagi, Y., Ho, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archaeal+RNA+ligase+is+a+homodimeric+protein+that+catalyzes+intramolecular+ligation+of+single-stranded+RNA+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Archaeal RNA ligase is a homodimeric protein that catalyzes intramolecular ligation of single-stranded RNA and DNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (19), 6218-6227 (2008).</li>
<li>Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Abundant+Class+of+Tiny+RNAs+with+Probable+Regulatory+Roles+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An Abundant Class of Tiny RNAs with Probable Regulatory Roles in Caenorhabditis elegans.</a> Science. 294 (5543), 858-862 (2001).</li>
<li>Yi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DGCR8-dependent+microRNA+biogenesis+is+essential+for+skin+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">DGCR8-dependent microRNA biogenesis is essential for skin development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 498-502 (2009).</li>
<li>Leung, A. K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+Ago2+binding+sites+from+mouse+embryonic+stem+cells+with+and+without+mature+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of Ago2 binding sites from mouse embryonic stem cells with and without mature microRNAs.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 18 (2), 237-244 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.

Bu tarifnamede anlatılan yöntemler, bağlama verimliliği, yani PEG, randomize bağlayıcıların kullanımı yüksek konsantrasyonlarda ve bağlayıcıların 2,6,9 yüksek konsantrasyonu en üst düzeye çıkarmak için birkaç anahtar değişkenlerden kullanır. Bu yaklaşım, total RNA örnekleri 2 güvenilir kantitatif sıralama kütüphaneleri izin verir. Biz giriş RNA&#39;nın çoklu titrasyonlarını yaptık ve önceki metodoloji (veriler gösterilmemiştir) 1-8 mikrogram aralığında toplam RNA tutarlar için en uygun olduğu sonuc...

Yüksek verim sıralama tabanlı metodolojileri yaygın ölçüde biyolojik sistemlerin 3,4 moleküler karmaşıklığı anlayışımızı genişleyen son yıllarda birçok biyolojik numunelere uygulanmıştır. Ancak, yüksek sekanslama için RNA örneklerinin hazırlanması çoğu zaman, bu güçlü teknikleri potansiyel kullanımını sınırlayan çalışan yönteme özgü belirli bir yanlılığı kazandırır. Bu yöntem, belirli önyargıları iyi ligasyon-temelli, küçük RNA kütüphane hazırlıkları 1,2,5,6 için belgelenmiştir. Bu önyargıları 1,000 kat varyasyon çılgınca değişken ve hata eğilimli sıralama verilerinden miRNA bereket çıkarsama yapma, eşit molar sentetik miRNA&#39;ların için sayıları okur sonuçlanabilir. Faj türevli, T4 RNA ligazların özelliklerine odaklanarak çalışmalar enzimler yüksek verimli sekanslama deneylerde belirlendiği gibi yanlı kitaplıkları ortaya nükleotid bazlı tercihleri ​​7, olduğu belgelenmiştir adres <s1,2,8&gt; kadar. RNA, ligazlar tarafından kazandırılan hatalarını en aza indirmek için, birden fazla stratejiler kullanılmıştır; makromoleküler, 9 boğmakta ligasyon siteye 6 proksimalinde adaptör üzerinde nükleotid dizisi randomizing ve ligasyon adaptörü 2 yüksek konsantrasyonlarda istihdam. Bu üç yaklaşımların bir kombinasyonu sayesinde yüksek verimlilik sıralaması (Şekil 1) uyumlu küçük RNA kütüphanelerin tarafsız hazırlanması için bir iş akışı geliştirdik. Mevcut protokoller ve optimize edilmiş bir yöntemle arasında doğrudan karşılaştırmalar için, bizim son raporunda 2 başvurun. Bu optimize edilmiş yöntem her iki 3 &#39;ve 5&#39; aşamalarında% 95&#39;ten ligasyonu verim alınmasını sağlamaktadır, sentetik ve biyolojik örnekler 2 küçük RNA moleküllerinin tarafsız bağlanmasını izin verir.

<table><tbody><tr><td>3' Bağlayıcı (5' fosforillenmiş, 3' bloke edilmiş)</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>özel</td><td></td></tr><tr><td>5' Bağlayıcı</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>özel</td><td>5' bloke edilmiş, HPLC saflaştırılmış</td></tr><tr><td>T4RNL2 (1-249 K227Q)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0351S</td><td>Önceden adenillenmiş DNA adaptörlerinin ligasyonu için uzmanlaşmıştır</td></tr><tr><td>10x Ligasyon tamponu (ATP olmadan)</td><td>New England </td><td>M0351S</td><td></td></tr><tr><td>10x Ligasyon tamponu ile Birlikte Verilen Biolabs (ATP ile)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Polietilen glikol ile Birlikte Verilir (mol. Wt. 8,000)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td> <td>ile DahildirBir damıtma cihazından toplanan suyun eşit kalitede olduğunu bulduk.</td></tr><tr><td>T4RNL1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III RT kiti</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Phusion PCR kiti</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Illumina RP1 astarı</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>özel</td><td>Dizi bilgileri Illumina'dan temin edilebilir Illumina</td></tr><tr><td>RT astarı</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>özel</td><td>Dizi bilgileri Illumina'dan temin edilebilir</td></tr><tr><td>Illumina indeks primer(ler)iEntegre</td> <td>DNA Teknolojileri</td><td>özel</td><td>Illumina'dan temin edilebilen dizi bilgileri</td></tr><tr><td>%40 Akrilamid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP14081</td><td></td></tr><tr><td>Üre</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum persülfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametilendiamin (TEMED)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>2x Denatüre RNA yükleme tamponu</td><td>New England Biolabs</td><td>Dahil M0351S</td><td></td></tr><tr><td>Tıraş bıçakları</td><td>ile VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>SpinX Centricon tüpleri</td><td>Costar</td><td>CLS8161</td><td></td></tr><tr><td>Düşük tutma mikrofüj tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>Sybr Altın</td><td>Invitrogen</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>Adenilasyon kiti</td><td>New England Biolabs</td><td>E2610L</td><td></td></tr></tbody></table>

yüksek verim dizilimine tarafından microrna ölçümü için küçük rna molekülleri, yüksek verimli ligasyonu

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA klonlama ve yüksek verim sıralama, miR-Dizi, tek nükleotid çözünürlükte miRNA&#39;lar ölçmek için bir transcriptome geniş bir yaklaşım olarak tek başına duruyor adlandırılır. Bu teknik MiRNA moleküllere 3 &#39;ve 5&#39; oligonükleotid adaptörler takılarak miRNA&#39;lar yakalar de novo miRNA keşif sağlar. Güçlü yeni nesil dizileme platformları ile birleştirilmesi sonucu, miR-Seq miRNA biyoloji çalışmaya vesile olmuştur. Ancak, oligonükleotid ligasyon adımlarla tarafından tanıtıldı önemli önyargılar doğru bir kantitasyon aracı olarak istihdam edilmesini miR-seg engellemiştir. Önceki çalışmalar, mevcut miR-Dizi yöntemleri önyargıları genellikle bazı miRNA&#39;ların 1,2 1.000 kata kadar hataları ile yanlış miRNA miktar yol açtığını göstermektedir. RNA ligasyonu ile kazandırılan bu önyargıları gidermek için, biz de 3 &#39;ve 5&#39; ligasyon adımlar için% 95&#39;in üzerinde ligasyonu verimliliği ile sonuçlanan bir küçük RNA ligasyonu yöntemi geliştirdik. Bu im Kıyaslamasürekli beklenen değerden az iki kat sapmayla numaraları okur verir, eşit molar veya farklı olarak karışık sentetik miRNA&#39;lar kullanarak kitaplık inşaat yöntemi olduğunu kanıtladı. Ayrıca, bu yüksek verimli miR-Dizi yöntem in vivo toplam RNA örneklerinde 2 doğru genom miRNA profilleme izin verir.

Yukarıdaki yöntemi için beklenen sonuçlar, ilk (Şekil 2) Mde RNA ligaz ile PCP tabi tutuldu DNA oligonükleotidin büyüklüğünde tek bir nükleotid vardiya (artış) gözlenmesi gerekir. 3 'bağlanmasından sonra, akrilamid jel görselleştirme (bakınız Şekil 3), jel, 100-300 nükleotid bölgesinde barizdir net, yüksek molekül ağırlıklı bant gösterir. Bu kullanılan toplam RNA numunesi yüksek kalitede olduğunu gösterir (bozulmuş değil). İkinci olarak, bir aşırı olan jelli 25 nükleotid bölges...

MicroRNA'lar (miRNA'lar), yaygın olarak korunan bir düzenleyici molekül sınıfıdır. Burada, iki güçlü ligasyon adımına ve ardından yüksek verimli dizilemeye dayanan bir miRNA klonlama yöntemini açıklıyoruz. Yöntemimiz, miRNA'ların genom çapında doğru bir şekilde kantitasyonuna izin verir.

Yüksek Verim Dizilimine tarafından MicroRNA ölçümü için Küçük RNA molekülleri, yüksek Verimli ligasyonu

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Bu prosedürün genel amacı, yüksek verimli dizileme için mikroRNA'ları tarafsız bir şekilde hazırlamaktır. Bu, önce mikro RNA'nın üç asal ucuna bağlanma için yetkin olan DNA oligonükleotidlerinin hazırlanması veya satın alınmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, üç asal DNA oligonükleotidini mikro RNA'nın üç asal ucuna bağlamaktır.Daha sonra, ligasyon ürünü jel saflaştırılır ve beş asal RNA oligonükleotid bağlayıcısı, mikro RNA'nın beş asal ucuna bağlanır. Son adım, hibrit molekülleri CDNA'ya dönüştürmek ve daha sonra CDNA'yı polimeraz zincir reaksiyonu ile amplifiye etmektir. Sonuç olarak, mikro RNA klonlaması ve yüksek verimli dizileme, mikroRNA'ların transkriptom geniş profilini bireysel nükleotid çözünürlüğünde kantitatif bir şekilde göstermek için kullanılır.Tekniğimizin mikro dizileme, mikroışın, qPCR blot gibi mevcut tekniklere göre ana avantajı, tekniğimizin tek bir nükleotid çözünürlüğünde transkript çapında laboratuvar ölçeğinde gerçek mikro ışın seviyesini daha fazla yansıtmasıdır. Bu yöntem mikroRNA biyolojisi hakkında bilgi sağlayabilirken, HC klipsi ve RNA-Seq gibi diğer yüksek verimli dizileme teknolojilerine de uygulanabilir. Bu prosedür için DNA oligonükleotidleri,

highly-efficient-ligation-small-rna-molecules-for-microrna

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada örnek sınırlı miktarda çalışma, özellikle microRNA (miRNA) ekspresyon düzeyleri için bir maliyet ve zaman etkili yüksek verimli bir tarama aracı olarak mikroakışkan platformu ile birlikte optimize edilmiş bir multiplex ters transkriptaz kantitatif PCR (QRT PCR) protokolü açıklamak.

Yüksek Verimli MicroRNA Profil: Optimize edilmiş, Multiplex QRT-PCR Fluidigm Dinamik ArrayTM IFCS Nanoliter Ölçeğinde

Biz beyin omurilik sıvısı (BOS) microRNA profili gerçek zamanlı PCR bir protokol açıklar. RNA ekstre etme protokolleri hariç, prosedür diğer vücut sıvıları, kültürlenmiş hücreler ya da doku örneklerinden elde edilen RNA ile uzatılabilir.

Kantitatif Real Time PCR kullanarak Beyin Omurilik Sıvısı MicroRNA Profil

Sirkülasyon mikroRNAlar son zamanlarda çeşitli kanser ve diğer hastalıklar için umut verici ve yeni biyolojik belirteçler olarak ortaya çıkmıştır. Bu makalenin amacı üç farklı prob-tabanlı gerçek zamanlı PCR platformları ve ölçmek ve microRNA dolaşan bereket belirlemek için kullanılabilir yöntemleri tartışmaktır.

Probe-tabanlı Real-time PCR microRNA Kantitatif Ölçüm Yaklaşımları

Bu protokolün amacı, aşağı akış RNA analizi için heterojen prostat dokularından saf hücre tipi popülasyonlarını izole etmek için etkili bir yöntem olarak lazer yakalama mikro-diseksiyonunu kullanmaktır.

RNA Analizi İnsan Prostat Epitelinin Lazer yakalama mikrodiseksiyon

Burada, küçük RNA'ları yalıtmak, mikroRNA'lar için zenginleştirmek ve yüksek iş elde etme sıralaması için numune hazırlamak için adım adım bir strateji tanımlıyoruz. Daha sonra açık kaynak araçlarını kullanarak sıra okumaları nasıl işleyip mikroRNA'lara hizalayan açıklarız.

MikroRNA'ları Yalıtmak ve Sıralamak ve Açık Kaynak Araçlarını Kullanarak Analiz Etmek Için Komple Bir Boru Hattı

Standart yöntemlere göre daha az önyargılı ve 2'-O-metil RNA'lar için artan hassasiyetiçeren ayrıntılı bir küçük RNA kütüphane telafi protokolü saiyoruz. Bu protokol maliyet tasarrufu veya kolaylık sağlamak için kitleri kullanarak ev yapımı reaktifler kullanılarak izlenebilir.

Küçük RNA-seq iyileştirilmesi: Daha Az Önyargı ve 2'-O-Metil RNA'ların Daha İyi Tespiti

Bu yöntem, toplam RNA ekstresinden miRNA'ları tespit etmek için kuzey hibridizasyon tekniğinin kullanımını göstermektedir.

Bitki MikroRNAlarının Saptanması ve Ölçülmesi için RNA Leke Analizi

Mutlak miktar tayini RNA dizilimi (AQRNA-seq), biyolojik karışımlardaki tüm küçük RNA'ların manzarasını ölçmek için geliştirilmiş bir teknolojidir. Burada, açlığın neden olduğu uyku hali sırasında Mycobacterium bovis BCG'deki transfer RNA (tRNA) havuzundaki değişiklikleri ölçen AQRNA-seq'nin hem kütüphane hazırlama hem de veri işleme adımları gösterilmektedir.

Küçük RNA'ları Ölçmek için AQRNA-seq

Protokol, mikroRNA ve çoğullanmış proteinleri aynı anda tespit etmek ve ölçmek için formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku ile tandem bir immünofloresan hibridizasyon testini tanımlar.

Yeni Bir Tespit ve Miktar Belirleme Yöntemi Olarak Kilitli Nükleik Asit Yerinde Hibridizasyon Yoluyla MikroRNA Amplifikasyonu ve Tanınması

Bu yöntem, Gaussia lusiferaz (GLuc) geni içeren lineerize edilmiş bir plazmidden hem kaplı hem de kaplanmamış mRNA'nın yüksek verimli in vitro sentezini tanımlamaktadır. RNA saflaştırılır ve kaplanmamış RNA'nın bir kısmı Vaccinia virüsü kaplama enzimi kullanılarak enzimatik olarak kaplanır. Son adımda, mRNA HeLa hücrelerine transfekte edilir ve hücre kültürü süpernatantları lusiferaz aktivitesi için analiz edilir.

HeLa Hücre Transfeksiyon Ardından Gaussia Lusiferaz mRNA in vitro transkripsiyon ve Kapatma yılında

Öğrenin, mikroRNA klonlama ve yüksek verimli dizileme yöntemiyle genom çapında mikroRNA ölçümünü. Bu teknik, gen düzenlemesindeki rollerini anlamak için transkriptom genelinde profil oluşturur.

Yüksek Verim Dizilimine tarafından MicroRNA ölçümü için Küçük RNA molekülleri, yüksek Verimli ligasyonu

Daha fazla video keşfet