Yüksek Verim Dizilimine tarafından MicroRNA ölçümü için Küçük RNA molekülleri, yüksek Verimli ligasyonu

Bu prosedürün genel amacı, yüksek verimli dizileme için mikroRNA'ları tarafsız bir şekilde hazırlamaktır. Bu, önce mikro RNA'nın üç asal ucuna bağlanma için yetkin olan DNA oligonükleotidlerinin hazırlanması veya satın alınmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, üç asal DNA oligonükleotidini mikro RNA'nın üç asal ucuna bağlamaktır.

Daha sonra, ligasyon ürünü jel saflaştırılır ve beş asal RNA oligonükleotid bağlayıcısı, mikro RNA'nın beş asal ucuna bağlanır. Son adım, hibrit molekülleri CDNA'ya dönüştürmek ve daha sonra CDNA'yı polimeraz zincir reaksiyonu ile amplifiye etmektir. Sonuç olarak, mikro RNA klonlaması ve yüksek verimli dizileme, mikroRNA'ların transkriptom geniş profilini bireysel nükleotid çözünürlüğünde kantitatif bir şekilde göstermek için kullanılır.

Tekniğimizin mikro dizileme, mikroışın, qPCR blot gibi mevcut tekniklere göre ana avantajı, tekniğimizin tek bir nükleotid çözünürlüğünde transkript çapında laboratuvar ölçeğinde gerçek mikro ışın seviyesini daha fazla yansıtmasıdır. Bu yöntem mikroRNA biyolojisi hakkında bilgi sağlayabilirken, HC klipsi ve RNA-Seq gibi diğer yüksek verimli dizileme teknolojilerine de uygulanabilir. Bu prosedür için DNA oligonükleotidleri, üç asal ligasyon reaksiyonu için tasarlanmıştır ve beş asal fosfat grubuna, beş asal uçta randomize bir dinükleotidi ve üç asal sitozin, DNA oligonükleotidlerini nükleaz içermeyen suda 100 mikromolar kısma seyreltmelidir.

Bu reaktif ajanları 200 piko mol üç asal bağlayıcı oligonükleotid, dört mikrolitre beş asal DNAA ventilasyon tamponu, dört mikrolitre TP, dört mikrolitre M-T-H-R-N-A, ligaz ve nükleaz içermeyen suyu 40 mikrolitrelik bir nihai hacme birleştirerek bir ventilasyon reaksiyonunu birleştirin. Reaksiyonu bir saat boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. Beş dakika boyunca 85 santigrat dereceye ısıtarak reaksiyonu sonlandırın.

2.5 hacim %100 etanol ve üçte bir hacim 10 molar amonyum asetat ekleyerek TED bağlayıcıyı çökeltin. Artık bir TP'yi çıkarmak ve gelecekteki reaksiyonlarda beklenmedik ligasyonları önlemek için, alkol, tuz ve oligonükleotid çözeltisini 20 dakika boyunca dört santigrat derecede bir mikro santrifüjde tam hızda döndürerek homojen hale getirin. Pelet% 70 etanol içinde havayla kurutun ve 50 ila 100 mikromolar havalandırılmış oligonükleotid elde etmek için peleti uygun hacimde nükleaz içermeyen suda yeniden süspanse edin.

%18'lik bir poli akrilamid jel üzerinde elektroforez ile oligonükleotidin ventilasyonunu onaylayın. Jeli, oda sıcaklığında çalışan bir XTBE çalışma tamponu ile 24 volt santimetre jel genişliğinde 30 dakika önceden çalıştırın. 30 dakika dolduğunda, kuyuları çalışan tamponla yıkayın.

Bu prosedür için DNA oligonükleotidleri, üç asal ligasyon reaksiyonu için tasarlanmıştır ve beş asal fosfat grubuna, beş asal uçta randomize bir dinükleotit ve üç asal oksitosine sahip olmalıdır. DNA oligonükleotidlerini nükleaz içermeyen suda 100 mikromolar dereceye kadar seyreltin. Jeli, bromo fenol mavisi jel direğinin dibine kadar olan yolun dörtte üçü olana kadar santimetre başına 24 voltta çalıştırın.

Jeli tek bir XTBE'de bir x siber altın çözeltisi ile boyayın ve bir UV translüminatör kutusunda görselleştirin. Üç asal ligasyon reaksiyonu için M-T-H-R-N-A ligaz tarafından ventilasyona tabi tutulan DNA oligonükleotidinin boyutunda tek bir nükleotid kayması olmalıdır. Aşağıdaki bileşenleri bu sırayla buz üzerine monte edin.

Bir mikrolitre% 50 PEG 8, 000 0.5 mikrolitre 10 XRNA ligaz tamponu. Bir mikrolitre ventilasyonlu üç asal bağlayıcı, 0.5 mikrolitre RNA inhibitörü, 0.5 ila sekiz mikrogram toplam RNA, 0.5 mikrolitre T, dört RNA, Ligaz iki ve beş mikrolitrelik nihai hacme kadar nükleaz içermeyen su. İyice karıştırdıktan sonra pipetleyerek reaksiyonu karıştırın.

Reaksiyonu ısıtılmış kapaklı bir termal döngüleyiciye yerleştirin. Bloğu 16 santigrat dereceye ayarlayın ve dört saat inkübe edin. Reaksiyonun, ligasyon verimliliğinde herhangi bir kayıp olmaksızın 20 mikrolitrelik bir nihai hacme kadar ölçeklendirilebileceğini unutmayın.

Üç ana ligasyonun ardından, reaksiyonu eşit hacimde iki XRNA yükleme tampon ısısı ile beş dakika boyunca 70 santigrat dereceye kadar karıştırın ve buz üzerinde soğutun. Sonraki jel. Numuneyi %15'lik bir poli akrilamid jel üzerinde saflaştırın.

Jeli en az 30 dakika boyunca 24 volt santimetre jel genişliğinde önceden çalıştırın. Güç kaynağını kapatın ve kuyuları çalışan tamponla yıkayın. Numuneyi yükleyin ve jeli, bromo fenol patlamış jelden yeni çıkana kadar ön çalıştırma ile aynı voltajda çalıştırın.

İstenen ürün, poli akrilamid jel elektroforezi tamamlandığında ksilen camgöbeğine yakın hareket edecektir. Jeli bir x çalışan tampon ve bir x siber altın ile temiz bir tepsiye koyun ve 15 dakika boyunca sallayın. Jeli boyama kabından çıkarın ve temiz plastik sargı ile kaplı bir UV translüminatör kutusu üzerinde görselleştirin.

Ligasyon ürünü yaklaşık 45 nükleotid uzunluğunda olmalıdır. Bu ligasyon ürünü genellikle görünmediğinden, ligasyon ürününü içeren bölge olan temiz bir tıraş bıçağı exci kullanılarak bitişik şeride pozitif kontrol sentetik RNA örneğinin dahil edilmesi önemlidir. Sentetik RNA örneğinin konumları ve boyut standartları tarafından yönlendirilir.

Tüketim jeli parçasını 0,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin. 0.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpünün altını 30 gauge iğne ile delin ve delme tüpünü yaklaşık 15.000 kez beş dakika boyunca ikinci bir temiz düşük tutmalı, 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpü santrifüjüne yerleştirin. G. Tüm jel diliminin iç tüpteki delikten geçtiğini görsel olarak onaylayın.

Gerekirse, bazı jel parçalarını deliğe yaklaştırmak için temiz bir pipet ucu kullanın. Boş 0.5 mililitrelik tüpü atın ve akrilamid bulamacına 400 mikrolitre yüksek tuzlu sütun tamponu ekleyin. Ertesi gün tüpü gece boyunca dört santigrat derecede sallayın.

Bulamacı, geniş delikli bir pipet ucu santrifüjü kullanarak oda sıcaklığında yaklaşık 15.000 kez üç dakika boyunca 0.22 mikronluk bir selüloz asetat döndürme kolonuna aktarın. Tüm sıvıyı akrilamid jel matrisinden uzaklaştırmak için G. Sıvıyı, mililitre glikojen çözeltisi başına 20 miligramlık bir mikrolitre içeren temiz, düşük tutmalı 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Eşit hacimde izopropanol ve 10'uncu hacimde bir sodyum asetat ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek çözeltiyi karıştırın. Eksi 80 santigrat derece dondurucuda 20 dakika çökeltin. 20 dakika boyunca dört santigrat derecede tam hızda santrifüjleyin.

Nükleik asidi peletlemek için snat'ı çıkarın ve %70 etanol havada yıkayın. Peletleri oda sıcaklığında 10 dakika kurutun ve doğrudan beş ana ligasyon adımına geçin. Bu işleme başlamak için, daha önce peletlenmiş nükleik aside aşağıdaki bileşenleri, iki mikrolitre PEG 8, 000 0.5 mikrolitre RNA Ligaz tamponu, 0.5 mikrolitre TP 0.5 mikrolitre bağlayıcı, RNA oligonükleotid ve dört mikrolitrelik bir son hacme kadar su ekleyin.

Peletin tamamen yeniden çözündüğünden emin olmak için bu numuneyi beş dakikaya kadar tekrar tekrar pipetleyerek karıştırın. Pelet çözelti içine girdikten sonra, içeriği bir mikrolitre bire bir RNA inhibitörü ve T dört RNA ligaz karışımı içeren temiz bir PCR tüpüne aktarın, biri yukarı ve aşağı pipetlenerek karıştırılır. Reaksiyonu dört saat boyunca 37 santigrat derecede bir termal döngüleyicide inkübe edin.

Reaksiyon tamamlandığında, RNA'nın üç asal ucuna bağlayıcı ligasyonunu ve reaksiyonların sayfa analizini takiben protokol metninde açıklandığı gibi hemen CD NA sentezine geçin. Jelin 100 ila 300 nükleotid bölgesinde keskin yüksek moleküler ağırlıklı bantlar belirgindir, bu da kullanılan toplam RNA örneğinin yüksek kalitede olduğunu gösterir. Jelin 25 nükleotid bölgesindeki çok parlak sinyal, aşırı bağlanmamış üç asal bağlayıcı sentetik RNA'dır, beş sentetik mikro RNA pikomol ve jel saflaştırılmış üç asal bağlayıcı ile gerçekleştirilen bir ligasyonu gösterir.

Burada, P 32 5 prime ve etiketli sentetik mikro RNA ile gerçekleştirilen üç prime ligasyon reaksiyonunun bir otomatik radyogramı gösterilmektedir. Reaksiyonun ilerlemesine izin verilen saat sayısı en üstte belirtilir ve alttaki sayılar, bağlanmamış ve bağlanmış toplamın yüzdesi olarak bağlanan miktarları gösterir. Bu oto radyogram, P 32 5 asal uç etiketli sentetik mikro RNA üç asal bağlayıcı hibrid ile gerçekleştirilen beş asal ligasyon reaksiyonundan oluşur.

Alttaki sayılar, bağlanmamış ve bağlanmış toplamın yüzdesi olarak bağlanan miktarları gösterir ve yüksek konsantrasyonda PEG 8, 000 küçük R-N-A-D-N-A kullanmanın önemini ortaya koymaktadır. Yüksek verimli dizileme için uyumlu kitaplıklar daha sonra PCR tarafından oluşturulur. Uygun PCR döngüsü sayısı ampirik olarak belirlenir.

Bu örnekte, beklenen DNA ürününün boyutu 146 baz çiftidir Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik sadece iki gün içinde düzgün bir şekilde gerçekleştirilebilir. Bu tekniği uygularken, tüm uçları ve tüpleri RNA'lardan uzak tutmayı unutmamak önemlidir.