Name: In vivo ve in vitro Entomopatojenik Nematodlar Yetiştiriciliğinin olarak (Steinernematidae ve Heterohabditidae) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Öğrenin entomopatojenik nematodların in vivo ve in vitro yetiştirme tekniklerini. Bu yöntemler biyolojik mücadele araştırmalarında kullanılan Steinernematidae ve Heterorhabditidae familyaları için temel oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Stock laboratuar geçmiş üyelerine teşekkür etmek istiyorum: Ming-Min Lee, Kathryn Plichta, Victoria Miranda-Thompson ve Sam-Kyu Kim bu protokollerin birçok iyileştirme katkıları için. Bu çalışma SP Stoku Ulusal Bilim Vakfı Hibe IOS-0840932 ve IOS-0724978 tarafından kısmen finanse edildi

Onların Symboitic Bakteriler Entomopatojenik Nematodlar 1. in vivo Yetiştiriciliği <ol><li> 100 x 15 mm&#39;lik bir plastik Petri kabı ters çevirin ve çanak kapakta filtre kağıdı (90 mm) iki diskler yerleştirin. </li><li> Eşit olarak, filtre kağıdı üzerinde (1.000-2.000 IJ / ml &#39;lik bir konsantrasyonda), IJ (infektif çocuklar) su süspansiyonundan 1 ml dağıtın. Not: IJs yüzeyi sterilize edilmiş olması gerekmez. </li><li> Çanak daha waxmoth Galleria mellonella 10 son dönem larvaları ekleyin. Hedefi, yaklaşık 100-200 IJs / larva sağlamaktır. </li><li> Petri kabı (Şekil 1) alt kısmı ile kapağı kapalı Petri etiketleyin. Aşağıdaki bilgileri Mansiyon: nematod türlerinin adı (biliniyorsa); kodu / atama izole; tarih enfeksiyon tuzak kuruldu. </li><li> Bir gevşek şekilde kapalı plastik bir torba içine tabağına yerleştirin (nem muhafaza etmek için) ve ya oda sıcaklığında ya da 20-25 ° C arasında bir kuluçka makinesi içinde karanlıkta tutun. Günlük yemekler edin NOT: topraktaki doğal enfeksiyon koşullarını taklit Darkness, nematod enfeksiyonu kolaylaştırır. </li><li> 3-5 gün sonra, modifiye Beyaz tuzak 7 nematod enfeksiyon belirtileri ile kadavra çıkarın. NOT: kadavra çürük kokusu varsa, bu kültür başarılı değildi ve / veya kirlenme olduğunu bir göstergesi olabilir. Nematod ve böcekler yeni bir parti ile yeni bir enfeksiyon odasını ayarlayın. </li></ol> Onların Simbiyotik Bakteriler Entomopatojenik Nematodlar 2. in vitro Yetiştiriciliği <ol><li> Karaciğer-böbrek Agar Yöntemi 9,19 <ol><li> Küçük parçalar (2 cm3 veya küçük) olarak karaciğer ve böbrek doğranır ve NaCl, ağar bir karıştırıcı içine koyun ve 300 ml su ve sıvı et hamuru, kalın bir macun veya püre haline gelene kadar karıştırılır. Daha sonra, 1 litrelik bir Erlenmeyer şişesine karışımı aktarın. </li><li> Blender kabına suyun nihai 200 ml ilave edilir ve herhangi bir geri kalan ortam süzünBir Erlenmeyer şişesi. 121 ° C&#39;de 15 dakika süreyle otoklavlanmaktadır. Izin Otoklavlamadan sonra ağar dökülmeden önce dokunmak soğumaya. NOT: Bu orta et parçalarını sahip olma eğilimi gösterir, çünkü orta Pipetleme tavsiye edilmez. </li><li> Elle ya da karıştırma ile Erleni dönen daha homojen bir ortam dökülür, 5 (veya 6) cm Petri kapları üzerine agarı ~ 20 ml dökün. Kadar gerekli ağar 4 ° C&#39;de katılaşır ve mağaza yemekleri izin ver NOT: Etin Petri kabı içine dökülmüş herhangi bir büyük parçalarını kırmak için bir alev sterilize metal bir spatula kullanın. </li></ol></li><li> Lipit 9,19 ağar yöntemi <ol><li> Besleyici et suyu, agar ve maya özütü karıştırılarak bir yağ agar ortamı hazırlamak ve 2 L&#39;lik bir Erlenmeyer şişesi içine karıştırmak dökün. 121 ° C&#39;de 15 dakika boyunca H2O ve MgCl2 • 6H 2 O ve otoklav damıtılmış ekleyin. </li><li> Mısır yağı ve mısır şurubu karışımı steril karışımı eklenir ve eşit bir şekilde dağıtmak için yağ damlacıklarını, genellikle ya kuvvetli bir şekilde karıştırıldı ve girdap. <br/&gt; Not: UV çapraz bağlayıcı olarak gerekli hacmi koyarak mısır yağı ve şurubu sterilize edin. Yağ sıvı içine çözülür, ama bu küçük damlacıklar olduğundan emin olun olmayacaktır. </li><li> 5 (veya 6) cm Petri kapları üzerine ~ 20 mi agar dökün ve ihtiyaç duyulacak zamana kadar ağar, 4 ° C&#39;de katılaşmaya ve mağaza yemekler için izin verir. </li><li> Şerit lipid agar plakası üzerinde simbiyotik bakteriler, istenen ve 24-48 saat boyunca 28 ° C&#39;de inkübe edin. NOT: gecede (12-16 saat) LB altkültür 100-200 ul yayıldı. </li><li> Bir gün sonra, yaklaşık olarak 0.4 mi yüzeyi sterilize nematod süspansiyonuna (yumurta ya da infektif juvenil) ekleyin ve karanlıkta ve 22 ± 3 ° C&#39;de bir kuluçka makinesi içinde, oda sıcaklığında inkübe edin. NOT: nematod büyüme olumsuz bir aşırı ıslak ortam oluşturmak gibi nematod süspansiyonun fazla 0,4 ml katmayın. </li><li> Günlük kültürleri izleyin. Kültürler yaklaşık 12 gün (Şekil 2) Ijs yeni nesil üretmek gerekir.</li><li> Nematodlar, modifiye edilmiş beyaz yakalamak için çanak (Şekil 3A) yanlarını tarama görüldüğünde agar ile alt çanak aktarın IJs (Şekil 3B) toplanması için (Orozco ve arkadaşları. 12). Ortamın kirlenmesini azaltmak için bir laminar akış başlığı altındaki bu adımı gerçekleştirin. </li><li> Ortaya çıkması üzerine modifiye Beyaz tuzak Ijs toplayın ve herhangi bir ortamda enkaz kaldırmak için IJ süspansiyon durulayın. Deposu (soğuk ısı enkübatör ya da soğuk bir odada), 10 ° C&#39;de steril damıtılmış su içinde, IJ ya da gerektiğinde, hemen kullanın. NOT: Araştırmanın amacına bağlı olarak, ya symbiont-kolonize veya aposymbiotic nematodlarla plakaları tohum. </li></ol></li></ol> 3. in vitro Aposymbiotic arasında Yetiştirme (Symbiont-serbest) Entomopatojenik Nematodlar <ol><li> 10-20 G. bulaştırmak İstediğiniz nematod türlerinin Ijs ile mellonella larvaları (bakınız bölüm 1). 3 veya 4 gün sonra (bu zamanda IJs olgunlaştı gerekirdiBirinci nesil yetişkinlere) kadavra toplar. NOT: vade ve türe göre değişir yumurta yeterli sayıda elde etmek için gerekli kadın sayısına zamanı. Daha fazla G. bulaştırmak Mellonella gerekirse larva ve erken onlar doğru gelişim aşamasında olup olmadığını değerlendirmek için 48 saat sonrası enfeksiyon gibi diseksiyonu başlar. </li><li> Tuzlu su çözeltisi (M9 tampon 18) ile bir Petri kabı içinde tek tek her bir kadavradan yerleştirin. Bir ince uçlu forseps ile başını çekerek bir kadavra ayır. </li><li> (Tercihen L-şekil) ince bir iğne ile kadın (iç yumurta) en az 20 Hastaların gravida toplayın ve M9 tampon (Şekil 4A) 10 ml içeren bir saat camı koyun. </li><li> Aşağıdaki maddeleri göz önüne alınarak, bir çözelti hazırlayın axenizing: damıtılmış su 6.75 ml, 1.25 mi, 5 N NaOH ve 2.25 ml ticari olarak temin edilebilen ağartma çözeltisi,% 3 hipoklorit seyreltilmiştir. NOT: NaOH çözüm eldiven, gözlük, temel ve koruyucu uygun diğer birkıyafetleri giyilmelidir. Not: ağartma ışık ayrıştığından taze axenizing çözüme her hazırlayın. Axenizing çözümün birkaç toplu hazırlayın ve birden izle gözlük yumurta yüzey sterilizasyonu ve istihsalinde. </li><li> M9 tampon tampon çözelti ile izlemek cam dolduran ve bir pipet ile tampon yalakalık kadınlarda en az üç kez durulayın. Kadın saat camı kalır emin olun. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın. </li><li> Hemen axenizing bir çözeltisi eklenmekte ve dişi 10-15 dakika fazla bu çözelti içinde kalmasını sağlar. (Axenizing çözeltisine dayanıklı olan) yumurta sağlam kalırken parçalanmaya başlıyor nematod dokuları gözlemleyin. </li><li> Manuel bir iğne veya bisturi (Şekil 4B, C) ​​ile keserek, süreci hızlandırmak için kadın bedenlerini bozabilir. , Bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine pipetle çözülmemiş her türlü doku ekleyerek kaçınarak yumurta çıkarın. NOT: m olarak kullanHerhangi bir mikrosantrifüj tüpleri gerekli yumurta toplamak için ve yumurtaların yaşama kabiliyetini axenizing çözeltisine maruz uzun bir süre boyunca azalacak şekilde, hızlı bir şekilde çalışır. </li><li> &quot;Yüksek hız ayarını&quot; kullanılarak 15 sn vorteks tüpler daha yumurta bağlı nematod dokuları kaldırmak için. Bir girdap kullanılamaz Alternatif olarak, eğer pipetlemeyin yukarı ve çözüm birkaç kez aşağı. </li><li> Yaklaşık 18.000 g 2 dakika boyunca santrifüj ile pelet yumurta. Yumurta yeterince pelet yapmazsan hızını artırın. Axenizing çözeltisini çıkarın ve 1 dakika boyunca 900 x g hızında steril damıtılmış su ve santrifüj ile bir kez daha mikrosantrifüj tüpü doldurmak suretiyle iki kez yıkayın. </li><li> Son yıkamadan sonra, steril damıtılmış su içinde 300-500 ul yumurta tekrar süspansiyon ve steril 3 cm Petri için veya steril saat camı yerleştirin. Yumurta şimdi yüzey sterilize olduğunu unutmayın, bu yüzden yumurta temizliğini korumak için steril pipetler ve / veya pippetter ipuçları ve su kullanın. </li><li>Onlar (Şekil 4D) sağlam olduğunu doğrulamak için bir mikroskop (30-50X büyütme) altında yumurta incelemek ve karaciğer-böbrek agar ile 5 cm plaka aktarabilirsiniz (bakınız bölüm 2.1) NOT: Agar aşırı ıslak yapacak gibi plakalar üzerinde yumurta süspansiyon fazla 400 ul ekleyin etmeyin. </li><li> Ilgili bilgileri etiket plakaları ve 28 ° C&#39;de karanlıkta dik saklayın. Yumurta Kuluçka belirgin bir gece boyunca olmalıdır. NOT: Su çanak kapağı üzerine yoğunlaşabilir ancak 1 ya da 2 gün sonra buharlaşır. Şu anda, agarı nem tutma ve kurumayı önlemek için bir plastik torba içinde koyunuz. </li><li> Periyodik yemekleri gözlemleyin ve mantar veya bakteriyel kontaminasyon belirtisi gösteren herhangi yemekleri atın. IJs Petri kabı duvar göç görülmektedir sonra, kapağı çıkarın ve modifiye Beyaz tuzak 12 ağar ile alt çanak aktarın. Modifie içine çanak aktarırken steril koşullarını dikkated Beyaz tuzak maruz medyanın kirlenmesini önlemek için. </li><li> Gerektiği gibi Beyaz Tuzakları ve hasat IJ izlemeye devam. NOT: Aposymbiotic nematod birçok gün ve hatta hafta Beyaz tuzak suya göç devam edecektir. </li></ol>

<ol><li>Akhurst, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+dimorphism+in+Xenorhabdus+spp.%2C+bacteria+symbiotically+associated+with+the+insect+pathogenic+nematodes%2C+Neoaplectana+and+Heterorhabditis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes, Neoaplectana and Heterorhabditis.</a> J. Gen. Microbiol. 121, 303-309 (1980).</li>
<li>Dunphy, G. B., Webster, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+monoxenic+culture+of+Neoaplectana+carpocapsae+DD+136+and+Heterorhabditis+heliothidis%5BTitle%5D)+AND+%22Revue+Nematol%22%5BJournal%5D)">The monoxenic culture of Neoaplectana carpocapsae DD 136 and Heterorhabditis heliothidis.</a> Revue Nematol. 12, 113-123 (1989).</li>
<li>Boemare, N. Biology, taxonomy and systematics of Photorhabdus and Xenorhabdus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoemare%2C+N+%22Entomopathogenic+Nematology%22">Entomopathogenic Nematology</a>. Gaugler, R. , CABI Publishing. Wallingford. (2002).</li>
<li>Boemare, N. E., Akhurst, R. A. The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoemare%2C+NE+%22The+Prokaryotes%22">The Prokaryotes</a>. Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -H., Stackebrandt, E. , Springer. New York, NY. 473-488 (2002).</li>
<li>Ehlers, R. U., Wulff, A., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenicity+of+axenic+Steinernema+feltiae.+Xenorhabdus+bovienii.+and+the+bacto-helminthic+complex+to+larvae+of+Tipula+oleracea+%28Diptera%29+and+Galleria+mellonella+%28Lepidoptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Invertebrate+Pathology%22%5BJournal%5D)">Pathogenicity of axenic Steinernema feltiae. Xenorhabdus bovienii. and the bacto-helminthic complex to larvae of Tipula oleracea (Diptera) and Galleria mellonella (Lepidoptera).</a> Journal Invertebrate Pathology. 69, 212-217 (1997).</li>
<li>Gaugler, R., Kaya, H. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGaugler%2C+R+%22Entomopathogenic+Nematodes+in+Biological+Control.+Boca%22">Entomopathogenic Nematodes in Biological Control. Boca</a>. , CRC Press. Raton, FL. (1990).</li>
<li>Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Xenorhabdus+nematophila+genes+required+for+mutualistic+colonization+of+Steinernema+carpocapsae+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes.</a> Molecular Microbiology. 45, 1337-1353 (2002).</li>
<li>Kaya, H. K., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic nematodes.</a> Annual Review of Entomology. 38, 181-206 (1993).</li>
<li>Kaya, H. K., Stock, S. P. Techniques in insect nematology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaya%2C+HK+%22Manual+of+techniques+in+insect+pathology%22">Manual of techniques in insect pathology</a>. Lackey, L. A. , Academic Press. London. 281-324 (1997).</li>
<li>Koppenhöfer, H. Bacterial Symbionts of Steinernema and Heterorhabditis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKoppenh%C3%B6fer%2C+H+%22Entomopathogenic+Nematodes%3A+Systematics%2C+Phylogeny+and+Bacterial+Symbionts%22">Entomopathogenic Nematodes: Systematics, Phylogeny and Bacterial Symbionts</a>. Nguyen, K. B., Hunt, D. J. , Brill. Leiden-Boston. 735-759 (2007).</li>
<li>Lunau, S., Stoessel, S., Schmidt Peisker, A. J., Ehlers, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+monoxenic+inocula+for+scaling+up+in+vitro+cultures+of+the+entomopathogenic+nematodes+Steinernema+spp+and+Heterorhabditis+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Nematologica%22%5BJournal%5D)">Establishment of monoxenic inocula for scaling up in vitro cultures of the entomopathogenic nematodes Steinernema spp and Heterorhabditis spp.</a> Nematologica. 39, 385-399 (1993).</li>
<li>Orozco, R. A., Lee, M., Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soil+sampling+and+isolation+of+entomopathogenic+nematodes+%28Steinernematidae%2C+Heterorhabditidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Soil sampling and isolation of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae).</a> J. Vis. Exp. (89), (2014).</li>
<li>Poinar, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+Achromobacter+nematophilus+in+the+infective+stage+of+a+Neoaplectana+sp+%28Steinernematidae%3A+Nematoda%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nematologica%22%5BJournal%5D)">The presence of Achromobacter nematophilus in the infective stage of a Neoaplectana sp (Steinernematidae: Nematoda).</a> Nematologica. 12, 105-108 (1966).</li>
<li>Poinar, G. O. Jr, Thomas, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+Achromobacter+nematophilus+sp.+nov.+%28Achromobacteriaceae%3A+Eubacteriales%29+associated+with+a+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Bull.+Bacteriol.+Nomencl.+Taxon%22%5BJournal%5D)">Significance of Achromobacter nematophilus sp. nov. (Achromobacteriaceae: Eubacteriales) associated with a nematode.</a> Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon. 15, 249-252 (1966).</li>
<li>Sicard, M., Brugirard-Ricaud, K., Pagès, S., Lanois, A., Boemare, N. E., Brehéli, M., Givaudan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+infection+during+the+tripartite+interaction+between+Xenorhabdus+nematophila%2C+its+nematode+vector%2C+and+insect+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stages of infection during the tripartite interaction between Xenorhabdus nematophila, its nematode vector, and insect hosts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6473-6480 (2004).</li>
<li>Sicard, M., Hinsinger, J., LeBrun, N., Pagès, S., Boemare, N., Moulia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecific+competition+between+entomopathogenic+nematodes+%28Steinernema%29+is+modified+by+their+bacterial+symbionts+%28Xenorhabdus%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Interspecific competition between entomopathogenic nematodes (Steinernema) is modified by their bacterial symbionts (Xenorhabdus).</a> BMC Evolutionary Biology. 6, 68-78 (2006).</li>
<li>Snyder, H., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+colonization+and+release+processes+of+Xenorhabdus+nematophila+and+the+morphology+and+ultrastructure+of+the+bacterial+receptacle+of+its+nematode+host%2C+Steinernema+carpocapsae%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">New insights into the colonization and release processes of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae.</a> Applied and environmental microbiology. 73, 5338-5346 (2007).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. ed, C. .elegans.W. ormB. ook. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org">http://www.wormbook.org</a> (2006).</li>
<li>Stock, S. P., Goodrich-Blair, H. Nematode parasites, pathogens and associated of insects and invertebrates of economic importance. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStock%2C+SP+%22Manual+of+Techniques+in+Invertebrate+Pathology%22">Manual of Techniques in Invertebrate Pathology</a>. Lacey, L. A. , Elsevier. Yakima, WA. 373-426 (2012).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Uygun bir ana bilgisayar kullanarak EPN in vivo yetiştirilmesinde başarılı bir anahtar faktördür. Genellikle, hem steinernematids ve heterorhabditids üretebileceği ve başarıyla büyük bal mumu güvesi Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) larvaları onların yaşam döngüsünü tamamlamak. Ancak, farklı aileleri ve / veya siparişlerin diğer böcek türleri olarak kabul edilebilir. Güncel olarak nematod türlerinin bir kaç özel bir böcek ev sahibi hücresi için özgüllüğe sahip olduğu bilinmektedir. Örneğin <...

Entomopatojenik nematodlar (EPN) Steinernema ve Heterorhabditis spp. (Steinernematidae, Heterohabditidae) ve bakteriyel simbiont, Ksenorhabdus ve Fotorhabdus spp (Enterobacteriaceae) karasal hayvan-mikrop simbiyotik ilişkiler 2-4,6,10,19. Ksenorhabdus ve Fotorhabdus spp acil bir model olarak kabul edilir. Ayrıca, enfeksiyon juvenil (IJ) veya 3. aşamasında genç 8,10,13 infektif olarak bilinen nematodların sadece serbest yaşayan aşamasının bağırsakta simbiont olarak harbored. Bakteri-nematod çifti böceklerin geniş bir yelpazede için patojen olduğunu ve başarılı biyolojik kontrol ve entegre zararlı yönetimi programlarında, dünya çapında 6,8 uygulamaya konmuştur. Bu yazıda in vivo ve sık sık laboratuar koşullarında EPN beslenmesinde icra in vitro teknikleri bir seçim göstermektedir. Iin vivo koşullarda yöntem nematodların yetiştirmesi için bir böcek ev sahibi tasarlamaktadırlar. Genellikle, çeşitli böcek emir (yani Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, vb.) Olgunlaşmamış aşamaları uygun ana olarak kabul edilir. Yöntemler genellikle laboratuvarda nematod kültürlerin bakım için kabul edilir in vivo. Nematodların seri üretim söz konusu olduğunda, bu yöntem uygun olmayabilir. Haşere büyük miktarlarda daha fazla zaman ve böcek yetiştirme ile ilgili ek bir maliyet gerektiren bu amaç için gerekli olabilir. Entomopatojenik nematodlar da çeşitli medya üzerinde in vitro kültür edilebilir. Çalışmanın amacına bağlı olarak; in vitro yöntemler medyada simbiyotik bakterilerin katılmasını düşünebilirsiniz ya. Bu sunumda, EPN yayılması için iki yaygın kullanılan yöntemler açıklanmaktadır. Medyanın maddeler simbiyotik bakteri a için besin kaynağı sağlamaknd nematod için bir sterol kaynağı. in vitro yöntemler bir böcek konak olmadan Advantage EPN bir yetiştirme sunuyoruz. Uygun böcek ana mevcut olmadığında Başlangıçta, gelişmiş in vitro ortam maddesinin bir çok EPN çoğalması için kullanılmıştır. Ancak, son yıllarda, in vitro yetiştirme yöntemleri yaygın olarak EPN ve simbiyotik bakteriler 17,19 arasındaki Mutualistik ilişkiyi anlamak amacıyla araştırma istihdam haline gelmiştir. Bu sunumda ayrıntılı teknikler Stock Laboratuvarı, Arizona (Tucson, AZ, ABD) Üniversitesi tarafından çeşitli yazarlar tarafından açıklanan ve rafine karşılık gelir. Bu teknikler, haşere yönetimi için, bu organizmaların seri üretiminde kullanılan tekniklerin gövdesinden ayrıdır.

<table><tbody><tr><td colspan="4">In vivo Enfeksiyonlar</td></tr><tr><td>100 x 15 Petri kabı</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>Filtre kağıdı, 9 cm derece 1 selüloz</td><td>Whatman/VWR</td><td>28450-081</td><td>Grade 1 filtre kağıdı önerilir</td></tr><tr><td>Böcek konakları</td><td>Timberline</td><td>http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG</td><td>Galleria mellonella vardır Önerilen</td></tr><tr><td colspan="4">Karaciğer-böbrek için Agar (500 ml için)</td></tr><tr><td>60 x 15 mm Petri kapları</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>Sığır karaciğeri, 50 g</td><td>Yerel kaynaklı; kasap veya süpermarket</td><td></td><td>Kalan kısım ileride kullanılmak üzere dondurularak ve çözülerek saklanabilir</td></tr><tr><td>Sığır böbreği, 50 g</td><td>Yerel kaynaklı; kasap veya süpermarket</td><td></td><td>Kalanlar ileride kullanılmak</td></tr> <tr><td>üzere dondurulabilir ve çözülebilirSodyum klorür 2,5 g (%0,5 nihai konsantrasyon)</td><td>Acros/VWR</td><td>200002-434</td><td>herhangi bir araştırma sınıfı NaCl kullanılabilir</td></tr><tr><td>Agar, 7,5 g (%1,5 agar, nihai konsantrasyon)</td><td>HiMedia/VWR</td><td>95026-642</td><td>herhangi bir ortam sınıfı agar kullanılabilir</td></tr><tr><td>500 ml damıtılmış H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Lipid Agar için (1 L için)</td></tr><tr><td>100 x 15 Petri kapları</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>Besin suyu, 8 g</td><td>BD/VWR</td><td>90002-660</td><td></td></tr><tr><td>Maya özütü, 5 g</td><td>EMD/VWR</td><td>EM1.03753.0500</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür hekzahidrat 10 ml (0.2 g/ml)</td><td>EMD/VWR</td><td>EM-MX0045-1</td><td></td></tr><tr><td>Mısır yağı, 4 ml</td><td>Herhangi bir marka</td><td>Yerel kaynak; süpermarket</td><td>Her marka mısır yağı kullanılabilir</td></tr><tr><td>Mısır şurubu, 96 ml 7 ml mısır şurubunu 89 ml ısıtılmış H2O'da birleştirin ve homojenlik için girdap</td> yapın <td>Karo</td><td>Yerel kaynaklı; süpermarket</td><td></td></tr><tr><td>Agar, 15 g</td><td>HiMedia/VWR</td><td>95026-642</td><td>herhangi bir ortam sınıfı agar kullanılabilir</td></tr><tr><td>Damıtılmış H2O, 890 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo ve in vitro entomopatojenik nematodlar yetiştiriciliğinin olarak (steinernematidae ve heterohabditidae)

In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae)

Photorhabdus heterorhabditids arasında simbiont ise entomopatojenik nematod (EPN) (Steinernematidae ve Heterorhabditidae) Enterobacteriaceae. Ksenorhabdus bakteri steinernematids nematodlar ile ilişkili aile, Gram-negatif Gamma Proteobacteria bir Mutualistik ortaklık var. Birlikte nematodlar ve bakteriler, bir yakın ve belirli ortak olarak böcek türlerinin geniş bir yelpazede öldüren da güçlü bir insektisid kompleksi oluşturur. Bu yazıda, in vivo ve yaygın laboratuar koşullarında bu nematodlarının yetiştirilmesinde kullanılan in vitro teknikler göstermektedir. Dahası, bu teknikler EPN&#39;dir kültürlerin başarılı kurulması için önemli adımlar temsil ve ayrıca araştırma bu organizmaları kullanan diğer biyoanalizlerin için temelini oluşturur. Aposymbiotic (symbiont-serbest) nematod üretim genellikle ortak yaşam çalışmaya derinlemesine bir ve çok yönlü bir yaklaşım için önemlidir. BuProtokol antibiyotik eklenmesini gerektirmez ve standart laboratuar ekipmanı ile kısa bir miktarda yapılabilir. Muhafaza açısından hayatta kalma kullanılan türlere bağlı olarak değişebilir, ancak bu şekilde üretilen Nematodlar nispeten sağlamdır. Bu sunumda ayrıntılı teknikler P. Hazır Laboratuvarı, Arizona Üniversitesi (Tucson, AZ, ABD) çeşitli yazarlar tarafından açıklanan ve rafine karşılık gelir. Bu teknikler, haşere yönetimi için, bu organizmaların seri üretiminde kullanılan tekniklerin gövdesinden ayrıdır.

In vivo yetiştirme yöntemi nematod büyüme ve üreme için ev sahibi olarak canlı böcekleri kullanır. Enfeksiyon odaları böcekler Ijs sergilemek için etkili bir yöntemdir. Bu, başka bir böcek ev sahibi hücresi, bakteriyel vektörleri symbionts nematodlara yaşam döngüsünün tek bir aşamadır. 1 bir enfeksiyon bölmesi hem de bu bölme oluşturmak için gereken malzemeler için ayarlanmış göstermektedir. In vitro yetiştirme yöntemleri sağlar EPN Bir böcek ev sahibi olmadan büyümesi...

Bu sunumun amacı in vivo ve entomopatojen nematodların yetiştirmesi için in vitro teknikleri göstermektir., In vitro yöntemler zengin ağar medya kullanmak ise in vivo yöntemler, bir böceğin bu nematodların yetiştirme düşünün.

In vivo ve in vitro Entomopatojenik Nematodlar Yetiştiriciliğinin olarak (Steinernematidae ve Heterohabditidae)

Entomopathogenic nematodes (EPN) (Steinernematidae and Heterorhabditidae) have a mutualistic partnership with Gram-negative Gamma-Proteobacteria in the ...

Bu prosedürün genel amacı, entero patojenik nematodların yetiştirilmesi için in vivo ve in vitro teknikleri göstermektir. İn vivo yöntem, ilk olarak büyük balmumu güvesi garia melanomunun instar larvalarının enfektif juvenil veya IJ süspansiyonu ile inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, nematod ile enfekte olmuş kadavralar, toplanabilmeleri için modifiye edilmiş beyaz bir tuzağa aktarılır.İn vitro kültür yöntemi, önce karaciğer, böbrek veya lipid agar plakalarının onarılmasıyla gerçekleştirilir ve istenen simbiyotik bakteriler dışarı atılır. Daha sonra plakalara IJ süspansiyonu eklenir ve nematodların gelişmesine izin verilir. Son olarak, agar kabı, nematodların toplanması için modifiye edilmiş beyaz bir tuzağa aktarılır.Sonuç olarak, bu teknikler EPN kültürlerini başarılı bir şekilde oluşturur ve aynı zamanda bu organizmaları araştırma için kullanan diğer biyo-tahliller için temel oluşturur. Bu sunumda gösterilen inbivo ve in vitro yöntemler sadece patojenik nematodlarla yapılan araştırmalar için değil, aynı zamanda ProCard ve eary etkileşimlerini anlamayı amaçlayan çok çeşitli deneyler için de kullanılabilir. Laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi olan John McMullen p

in-vivo-vitro-rearing-entomopathogenic-nematodes-steinernematidae

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Floresan Mikroskobu kullanılarak Nematodlar Bakteriler görselleştirme

Entomopatojenik nematodlar böcek geniş bir yelpazede parasitize toprakta yaşayan yuvarlak solucan bulunmaktadır. Sırasıyla toprak örneklerinin ve enfekte olmuş böcek kadavra, nematod geri kazanılması için böcek kızdırma ve modifiye edilmiş beyaz tuzak: iki teknikler kullanılarak topraktan bu nematod izolasyonu için kullanılan örnekleme yöntemlerini göstermektedir.

Toprak Örnekleme ve Entomopatojenik Nematodlar İzolasyonu (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Yabani Caenorhabditis nematodları, genellikle bağırsak lümeninde veya bağırsağı enfekte eden birçok mikropla ilişkilidir. Bu protokol, dauer lütikülün direncinden yararlanarak bağırsağı kolonlaştıran kültürsüz mikropları zenginleştirmek için bir yöntemi detaylandırıyor.

Bağırsak Mikrobiyom Bakterileri İçin Zenginleştirmek için Yabani Caenorhabditis Nematodlarının Seçici Temizliği

Entomopatojenik nematodlar bakterilerle simbiyoz içinde yaşarlar ve birlikte doğuştan gelen bağışıklık sistemlerini zayıflatarak böcekleri başarılı bir şekilde enfekte ederler. Nematod enfeksiyonunun genetik temeli üzerine araştırmaları teşvik etmek için, entomopatojenik nematodları korumak ve genetik olarak manipüle etmek için yöntemler açıklanmaktadır.

Entomopatojenik Nematodların Kültürlenmesi ve Genetik Olarak Manipüle Edilmesi

Bu makale, entomopatonik (EPN: böcek-parazitik) nematod ve gelişmekte olan bir genetik model olan Steinernema hermaphroditum'da CRISPR-Cas9 aracılı genom mühendisliğini göstermektedir. Anlatılan teknoloji, mutantların yaratılması için faydalıdır ve nematod biyolojisinde karşılıklı ve parazitik simbiyozla ilgili gen fonksiyonlarının aydınlanmasını sağlar.

Entomopatotik Steinernema hermaphroditum nematodunda CRISPR-Cas9 tabanlı mutageze ve mutant hatların korunması

Çiftçilere entomopatogenik nematodları biyo-böcek ilaçları olarak toplu olarak yaymaları için iki yöntem sunuyoruz. İlk yöntem, nematod kültürleme alt tabakası olarak poliakrilamid jel kullanırken, ikinci yöntem kültür substratı olarak polimer kaplı pamuk yünü kullanır. Her iki yöntem de böcek kadavralarında nematodların in vivo yayılmasına dayanır.

Yetiştirici Temelli Entomopatotik Nematodların In Vivo Yayılması

Perfüzyon decellularization organ ekstraselüler matriks kompozisyonu ve mikromimarisini korur tüm karaciğer iskeleleri üretmek için yeni bir tekniktir. Burada, hepatositler ile perfüzyon decellularization ve sonraki repopulation kullanarak tüm organı iskeleleri hazırlama yöntemi açıklanmıştır. Fonksiyonel ve transplante karaciğer greft tekniği kullanılarak oluşturulabilir.

Tüm karaciğerleri Decellularization ve Recellularization

Uzun zincirli altın Alkan tiyoller oluşan Kendinden monte mono tabakaları (SAMs), protein desen ve hücre hapsi oluşumu için iyi tanımlanmış substratları sağlar. Microcontact baskı ile dolgu takip polidimetilsiloksan (PDMS) damga kullanarak hexadecanethiol glikol-sonlandırılır Alkan tiyol monomer damgalı hexadecanethiol bölgede sadece protein ve hücreler adsorbe bir desen üretir.

Protein ve hücre Etrafının İki Boyutlu Desenli Yüzeyler Oluşturma

Özel, gerçek zamanlı bir konfokal tarama görüntüleme sistemi komple inşaat açıklanmıştır. Video hızı mikroskopi ve mikroendoskopi için kolayca kullanılabilen bu sistem, maliyetinin bir kısmını, standart ticari konfokal sistemlerini kullanarak erişilebilir değil görüntüleme geometrileri ve uygulamaları bir dizi sağlar.

Video-rate Tarama Konfokal Mikroskop ve Mikroendoskopi

Bu kağıt sağlam izole Langendorff transmembran potansiyeli (Vm) ve geçici hücre içi kalsiyum (CAT) optik haritalama sırasında diseksiyon prosedürü, enstrümantal kurulum ve deneysel koşullar fare kalpleri perfüze.

Fare Kalp Aksiyon Potansiyelleri ve Kalsiyum Geçici Optik Haritalama

Öğrenin entomopatojenik nematodların in vivo ve in vitro yetiştirme tekniklerini. Bu yöntemler biyolojik mücadele araştırmalarında kullanılan Steinernematidae ve Heterorhabditidae familyaları için temel oluşturur.

In vivo ve in vitro Entomopatojenik Nematodlar Yetiştiriciliğinin olarak (Steinernematidae ve Heterohabditidae)

Daha fazla video keşfet