Name: Retina Pigment Epitel Hücreleri üzerinde Fagositoz Tahliller için Domuz veya Sığır fotoreseptör dış Kesimleri Büyük Ölçekli Arıtma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Öğrenin, domuz veya sığır gözlerinden fotoreseptör dış kesimlerini büyük ölçekli arıtmak için ultrasantrifüjasyon yöntemini. Bu teknik, retina pigment epitel hücrelerinin fagositoz fonksiyonlarını incelemek için tekrarlanabilir malzeme stokları sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Agence Nationale de la Recherche (Jeunes Chercheuses / EFN için Jeunes Chercheurs), Fondation Voir et oyunsu ve Fondation Bettencourt Schueller (EFN Genç Araştırmacı Hibe), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, EFN için kalıcı pozisyon) tarafından desteklenen ve (SCF için R01-EY13295) Sağlık Ulusal Enstitüleri Ulusal Göz Enstitüsü. Ayrıca, Institut de la Vizyon Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale, Université Pierre et Marie Curie-Paris 6, Centre National de la Recherche Scientifique ve bölüm de Paris tarafından finanse edilmektedir.

Bu POS izolasyon deney zaman alıcıdır ve POS depolamadan önce etiketlenmiş eğer tamamlamak için 12 saat kadar gerektirebilir. protokol 1997 10 SC Finnemann ve arkadaşları tarafından 1987 31 RS Molday ve arkadaşları tarafından yayınlanan ve modifiye bir kağıt adapte edilmiştir. Hayvanlar Oftalmik ve Vizyon Araştırma Hayvanların Kullanım Vizyon ve Oftalmoloji (ARVO) Beyanında Araştırma Derneği göre ele alınmıştır. Protokoller gözden ve Üniversite Pierre ve Marie Curie-Paris 06 Charles Darwin Etik Kurulu ve Fordham Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. 1. Genel Kurma <ol><li> Mümkün Kesim sonrası taze domuz 80 veya inek gözleri gibi taze kısa sürede elde edilir ve karanlıkta soğutulmuş tutmak. Şirket aynı şekilde devam böylece sağlayıcısına talimatları sağlayın. Bu protokol, 80 gözler için optimize edilmiştir. IçinDaha fazla gözlerle devam ve büyük hisse almak (örneğin, 160 gözlerden), çözüm miktarları iki katına ve Ultrasantrifügasyon 2 mermi yerine; Havuz örnekleri daha sonra toplama aşamasında (adım 2.2.2 bakınız). </li><li> Kırmızı emniyet ışığı lamba, emici pedler bankta kurmak, (Malzeme tablosu) mendil. (... Vitreus kullanılmayan göz parçaları,) 15 cm yemekleri ve biyolojik tehlikeli atık toplama torbaları için hazırlayın. Dar Labcoat, eldiven, kol koruyucuları ve gözlük takın. </li><li> Önlemler: <ol><li> Sonra tüm çözümleri Öncesi soğuk her aşamasında soğuk tutmak. Mümkün olduğunca buz üzerinde soğutulmuş gözleri ve degradeler tutun. </li><li> Ultrasantrifüje edildikten sonra toplama aşaması görsel pigmentler ve photopigments aktif formunun turuncu-pembe bir renk kaybı ışıkla ağartma bilmek kadar mümkün olduğu kadar karanlıkta gözler ve elde edilen dokuların tutun. </li></ol></li></ol> 2. Protokol Eylemleri <ol><li> Çözüm ve geçişlerini hazırlayın: <ol><li> Çözülme taurin stoku tamamen 37 ° C su banyosu kullanılarak. </li><li> İnhibitörler, stok çözeltilerden tüm çözümler (Tablo 1, stok çözeltileri) hazırlayın ve iyice her çözelti için bir manyetik karıştırıcı kullanılarak, diğer katkı maddeleri ile sükroz karıştırın. <ol><li> % 20 sakroz nihai bir konsantrasyona kadar homojenleştirme çözeltisi 15 ml hazırlayın, 20 mM asetat pH 7.2 Tris, 2 mM MgCl2, 10 mM glikoz ve 5 mM taurin. </li><li> (% 70 sukroz stok kullanarak)% 25 sukroz, 20 mM Tris asetat pH 7.2, 10 mM glikoz ve 5 mM taurin bir son konsantrasyon elde etmek üzere% 25 sukroz çözeltisi hazırlayın. </li><li> (Sakaroz tozu kullanarak)% 60 sakroz ve nihai bir konsantrasyona kadar% 60 sukroz çözeltisi hazırlayın, 20 mM asetat pH 7.2, 10 mM glükoz ve 5 mM tris taurin. </li><li> 20 mM Tris asetat pH 7.2 ve 5 mM taurin bir son konsantrasyon elde etmek üzere, yıkama 1 çözelti hazırlayın. </li><li> Yıkama 2 çözeltisi hazırlayın% 10 sukroz, 20 mM Tris asetat pH 7.2 ve 5 mM taurin bir nihai konsantrasyona seyreltildi. </li><li> % 10 sukroz, 20 mM sodyum fosfat pH 7.2 ve 5 mM taurin bir son konsantrasyon elde etmek üzere, yıkama 3 çözelti hazırlayın. </li></ol></li><li> Manyetik bir karıştırıcı ile gradyan yapıcı istikrarlı ve% 60 çözelti eklenir çıkmak için en yakın odası içinde bir karıştırma çubuğu ile ekleyin. Uygun döküm hızı elde etmek için, borunun çıkışında yerleştirilen bir kesme P200 pipet ucu kullanarak. </li><li> Ince seyreltilmesi ve önceden soğutulmuş ultrasantrifüjdeki tüpleri her çözümden (80 gözler için, yani toplam 6 tüpler) 12 ml kullanılarak% 25 biriyle% 60 sakaroz çözüm karıştırılarak doğrusal degradeler Cast. Iyi kademeli-seyreltilmesi% 60 sukroz solüsyonu karıştırın. Çok hızlı sorunsuz ve çözüm dökme, gradyan akış hızını sakinleştirmeye. NOT: Sürekli, doğrusal degrade almak için, sağ tamamı degrade kutu kurma için çözeltinin yüzeyinde pipet ucu açıklığı tutmakn. </li><li> Geçişlerini istikrar için yaklaşık 1 saat boyunca buz üzerinde bekletin. Yüklenen kadar soğutulmuş geçişlerini tutun. Degrade aksamaması için tüpler sallamayın. </li></ol></li><li> Doku koleksiyonu: <ol><li> Loş kırmızı ışık altında dokuları toplayın. Bir yandan içine bir göz atın ve uzak göz tutarken jilet kenarı ile ön karıştırmak (sıçramasını önlemek için, Şekil 1). 2 yarısı (kornea artı sklera içine en az 5 mm) içine ön gözün kesmek için jilet kullanın. Lensini çıkarın ve bir parmak böylece retinanın açığa ucu üzerinde tutulabilir böylece içini Göz yuvası çevirin. </li><li> Bir açıyla jilet kullanarak, yavaşça kolayca ayırarak ve Tapetum yüzeyinden, pembemsi bir tabaka olarak görünen ve optik sinir başı (Şekil 1) kesilmiş, retina kazımak. 2 x 50 mL tüpler buz üzerinde homojenizasyon çözeltisi 15 ml içeren, her tüm retina toplayın. </li><li> Retina homogenization: <ol><li> Farklı hücre tabakaları bozabilir PR hücre fragman POS geri kalanı kapalı POS kırmak ve retina süspansiyon homojen hale getirmek amacıyla 2 dakika süreyle elle kuvvetli bir şekilde süspansiyon çalkalayın. </li><li> Temiz bir gazlı bez bir çift katmanı üzerinden filtre 3x geniş doku parçaları kaldırmak ve akış yoluyla temiz 50 ml tüpler (Şekil 1) toplamak için. retina süspansiyon yavaşça, verimi en üst düzeye çıkarmak, her süzüldükten sonra geriye kalan parçalanmış dokuların serbest bırakmak için gazlı bez üzerine basın, oldukça kalın olan. </li></ol></li></ol></li><li> Fotoreseptör dış segment fragmanı (POS) izolasyon: <ol><li> % 60 sukroz gradyanı (Şekil 1) - 30 x 6 ml üzerinde ultrasantrifüjdeki tüpleri taze soğutulmuş sürekli 25 her içeren 24 ml tüp başına 7 ml - Yavaşça, 6 civarında ham retina hazırlık yatıyordu. Rotor kullanılacak uygun olarak karşı tüpleri dengeleyin. 4 ° C&#39;de 50 dakika boyunca 106,000 x g&#39;de ultrasantrifüj. </li&gt; <li> Aspirasyon (Şekil 2A) tarafından degrade üst üçte turuncu-pembe bandın üstünde çözümün en çıkartın. Bir behere bir cut-off P1000 ucu ile turuncu-pembe bant toplayın. Çamaşır suyu (biyolojik atık) kullanarak nötralize sonra geri kalanını atın. </li><li> Buz soğukluğunda Wash 1 çözelti 5 hacim -, 4 ile seyreltin. Gerektiği kadar 30 ml tüpler içine ayırın. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüjleyin. Dikkatle süpernatant atın. </li><li> Yukarıda ayrıntılı olarak 10 ml pelet tekrar 10 dakika boyunca 3.000 xg&#39;de 2 çözümü ve spin yıkayın. 15 ml pelet tekrar 3 kez yıkanır ve 10 dakika boyunca 3000 x g hızında tekrar dönerler. Wash 2 santrifüj önce gerekli tüplerin sayısını azaltmak ve 3 çözümleri yıkayın birkaç pelet süspansiyonlar birleştirin. </li></ol></li><li> POS etiketleme olmadan aliquoting: <ol><li> 20 ml DMEM - 10 süspanse POS. Seyreltme 10 490 ul DMEM (01:50) &#39;de ul ve whirled POS yanı sıra uzatılmış sayısıhücre sayım odası (Şekil 2B). ML başına POS parçacıklar halinde verim ve konsantrasyon hesaplayın. NOT: - 8 x 10 9 POS 80 domuz gözleri verim örneğin yaş ve gerginlik domuz / inek ve gözlerinin büyüklüğü, çoğunlukla bağlı olarak değişir, iyi bir hazırlık 5 değişmektedir. </li><li> Nihai DMEM hacmi karar (tipik olarak 10-20 mi) ve% 2.5 sükroz bir son konsantrasyon elde etmek üzere sukroz ekleyin. </li><li> Örneğin, istenilen büyüklükte alikotlarının hazırlayın / göz 40 ul, 96 oyuklu bir deney için 2 ml&#39;lik bir yeniden süspansiyon hacmi için tüp başına 5 x 10 7 POS. Oda sıcaklığında 2300 x g&#39;de 5 dakika boyunca 1 kısım Spin ve topak boyutunu değerlendirmek. POS kez donmuş ve çözülmüş olmaMAlıdır gibi farklı uygulama birimleri için çeşitli kısım boyutları hazırlayın. </li><li> Bir sonraki kullanıma kadar -80 ° C &#39;de, POS alikotları dondurun. NOT: Bu süspansiyonun tam bölenleri birçok ay boyunca stabildir. Bizim ellerde, etiketsiz veya etiketli POS en az bir yıl süreyle saklanabilir. </li></ol></li><li> POS etiketleme ve Alikotlama: NOT: Biz genellikle fagositoz deneyleri ölçümü için POS etiketlemek için FITC kullanın, ancak diğer boyalar kullanılan yanı sıra ihtiyaçlarına bağlı olarak olabilir. <ol><li> 1.4 ml 0.1 M Na-2 CO 3, pH 11.5 (Tablo 2, stok çözeltileri) ile 2.6 ml 0.1 M NaHCO 3 pH 8.4 karıştırılarak 0.1 M Na karbonat tampon pH 9.5 içinde 2.5 mg / ml bir konsantrasyonda yeniden süspanse 1: 10 mg FITC bir tüpe konulmuştur. Olmayan yeniden süspansiyon haline getirilmiş, FITC katı pelet maksimum hızda 5 dakika boyunca hafif ve spin korurken, oda sıcaklığında 1 saat süre ile döndürür. </li><li> Yıkama 3 çözeltisi (ya da DMEM), 10 ml POS pelet yeniden süspanse edin ve 80 gözler için FITC 2 ml solüsyon ilave edin. -80 ° C &#39;de dondurulmuş bir artık, FITC saklayın. Oda sıcaklığında en az 1.5 saat için döndürün. Alüminyum folyo kullanarak ışıktan koruyun. </li><li> Bölüm 2.3.4&#39;de tarif edildiği gibi, hemen hemen hiç FITC yüzer f görülmeyene kadar sonra bir kez ya da iki kez DMEM içinde iki kere yıkayın 3 çözeltisi kullanılarak etiketli POS yıkayınreaksiyona karşı. DMEM yeniden süspanse POS ve sayma ve şişelemeden (bölüm 2.4) için etiketsiz POS gibi devam edin. </li></ol></li><li> Deneylerde POS kullanılması: <ol><li> Çözülme oda sıcaklığında POS ve floresan etiketli ise mümkün olduğu kadar karanlıkta tutun. RT&#39;de 2.300 xg&#39;de 5 dakika Spin. Süpernatant aspire. </li><li> Deney tarafından belirlenen hemen tahlil çözeltinin uygun hacmi içinde yeniden süspanse edin. POS meydan farklı zamanlarda durumunda, mağaza birkaç saat zaman noktaları arasında karanlıkta oda sıcaklığında POS yeniden süspansiyon haline getirilmiştir. </li></ol></li></ol>

Yazarlar, rekabet eden herhangi bir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Üç adım veya durumlar optimize saflaştırma için önemlidir: dereceli döküm ve hassas gradyan borular manipülasyon kalitesi, soğutulmuş ve toplama aşamasında kadar karanlıkta dokuları tutarak, retina homojenatlarının çalkalama gücü PR geri kalanından uygun POS izolasyon elde etmek için hücresidir. Bazı sorunlar düzgün turuncu bant görmeye ortaya çıkarsa, bunlar dolayı yukarıdaki üç nedenden biri (aynı zamanda Sonuçları bölümün ikinci paragrafa bakın) büyük olasılıkla. Adım 33,21 gradyanlar <sup...

Retinasında, görme beyinde görsel alana kadar nöronlar arasındaki iletilebilir bir sinyal haline dönüştürülmeden önce, opsins adı ışığa moleküllerin izomerizasyonu ile tetiklenir. Bu moleküller, fotoreseptör hücrelerinin dış segment bölümlerini (PR) oluşturan krep benzeyen membranöz disklerin yığınlarının içinde gömülü. Işık ve oksidatif stres dolayısıyla önemli seviyelere sürekli maruz tabi olmak, PR sürekli potansiyel oksidatif hasarı sınırlamak için dış segmentleri yenilemek. Fotoreseptör dış segmentleri komşu retina pigment epitel (RPE) hücrelerinin apikal mikrovilluslu yakın temas halindeyiz. RPE hücreleri, kan-retina bariyerinin dış kısmını oluşturan ve melanin pigmentleri, fotoreaktif opsin bileşeni Retinal&#39;in yeniden izomerizasyonuna sağlayan besin ve g yoluyla ışık ışınları söndürme gibi fotoreseptör sağlık ve fonksiyonu 1 için çok önemli olan çok sayıda görev, sağlamakPR metaboliti bertaraf katılan faktörler rowth. Buna ek olarak, RPE hücreleri POS geçirdi ve onların bileşenleri, memeli retina 2,3 sirkadiyen ritim tarafından düzenlenen bir günlük işgal geri dönüşüm ortadan kaldırmak. sundurma POS boşluk PR hayatta kalmak için kesinlikle gereklidir. Tamamen kaldırılmıştır zaman, POS enkaz birikir ve PRs hızlı görme kaybı 4,5 neden dejenere. Ritmik profil kaybetti ve sabit aktivitesi ile değiştirilirse, PR ve RPE kusurlar yaş 6 birikir. Bu nedenle, bu da fonksiyon bozukluğu ile bağlantılı fenotipler anlaşılması için in vitro RPE fagositoz moleküler düzenleme karakterize etmek için çok önemlidir. İlginçtir, RPE hücrelerinde moleküler makineleri apoptotik hücreleri temizlemek için makrofajlar tarafından kullanılan bir çok benzer ve her ikisi de fagositik enkaz 7-9 maruz fosfatidilserin tanınması bağlıdır. Yine, RPE hücreleri ve makrofajlar ph düzenleyenmakrofajlar karşılaşma anda apoptotik hücrelerin hemen ortadan kaldırılması için tercih olarak agocytosis farklı, RPE hücreleri ritmik dış kesimleri ile sürekli temas rağmen bir günde sadece bir kez POS yutmak ise. Bu henüz tam olarak anlaşılmış değildir özgü düzenleme mekanizmalarını önerir. RPE fagositik makine implike moleküllerin bir çoğu bu tanımlanmış ya da izole edilmiş bir POS ve hücre kültürü fagositoz tahlillerin kullanımı sayesinde doğrulanmıştır. onun ligandı MFG-E8 ile koordineli olarak RPE apikal hücre yüzeyinde bulunan alfa beta5&#39;in integrin reseptörü, ardından MerTK tirozin kinaz reseptörü 13-15 yoluyla içselleştirilmiş olan POS 10-12, özellikle bağlanır. CD36 çöpçü reseptör POS alımı katılmak ve hızını 16,17 etkilemek için gösterilmiştir, ve POS yüzeyi 18 oksitlenmiş fosfolipidlerin bir sensör olarak kullanılabilir. Içselleştirilmesi F-aktin hücre iskeleti-eşek işe ihtiyacıBöyle anneksin 2 19, miyozin II 20 ve miyozin VIIA 21,22 olarak ociated proteinler. In vitro olarak doğal ya da oksitlenmiş POS da az sindirilmiş oksitlenmiş POS 23-28 birikimine bağlı, in vivo olarak, RPE hücreleri yaşlanma fenotipleri anlamak için kullanılmaktadır. akış önleme hücrelerinden hasıl RPE hücrelerinin üretimi, hayvanların ya da hasta 29,30,27 nakledilen önce hücrelerin özelliğe kanıtlamak için kullanılan izole edilmiş bir POS için yeni bir uygulama başlatmıştır. İlk 1987 yılında 31 Molday ve arkadaşları tarafından tarif, sığır POS izolasyonu için protokol (11- sis retina taşıyan) ağartılmamış retina photopigment karakteristik portakal görünümü gözlem sürekli sakaroz Yokuşta retina homojenatlarının bir Ultrasantrifügasyon adımını birleştirir. Geçtiğimiz 10 yıl içinde, deli dana hastalığı riskini en aza indirmek amacıyla alınan önlemler nedeniyle, domuz gözlerin kullanımı increasi haline gelmiştirngly belirgin. Burada açıklanan protokol domuz veya numune alınır ve uzun bir süre boyunca saklanabilir sığır gözlerden POS büyük miktarlarda elde etmek için nasıl kullanılacağını gösterir. Bu POS hazırlanması ve analiz 32,33,21,22 başına hayvan çok sayıda kullanımını gerektiren, kemirgen gözlerden POS hazırlanması ihtiyacını ortadan kaldırmaktadır. Buna ek olarak, floresan molekülleri kullanarak depolama önce POS etiketleme ile ilgili ayrıntılar ölçmek ve fagositoz tahlil 32,10 sonra etiketleme POS göre bazı uygulamalar için basitleştirilmiş ve karşılaştırılabilir bir şekilde POS görselleştirmek için, verilir. Bu nedenle, bu büyük stoklar deneyler birçok farklı tipte yeniden üretilebilirlik ve kullanım kolaylığı için izin verir.

<table><tbody><tr><td colspan="4"> Özel Malzeme/Ekipman</td></tr><tr><td>2 Odacıklı gradyan yapıcı</td><td></td><td></td><td>30 ml hazneli degrade yapıcı</td></tr><tr><td>Degrade döküm için</td><td>3 mm çapında silikon boru</td><td></td><td></td> borusu</tr><tr><td>Küçük boyutlu manyetik karıştırma çubuğu</td><td></td><td></td><td>Degrade yapıcı haznesine takılan karıştırma çubuğu</td></tr><tr><td>Kırmızı safelight lambası</td><td></td><td></td><td>Diseksiyon için inaktinik lamba koyu</td></tr><tr><td>Ultra Şeffaf 25 x 89 cm tüpler</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>Ultrasantrifüj tüpleri</td></tr><tr><td>PP Meşe Sırtı tüpleri</td><td>Nalgene</td><td>3119-0050</td><td>30 ml santrifüj tüpleri</td></tr><tr><td>Optima LE-80K</td><td>Beckman Coulter</td><td>365668</td><td>Ultrasantrifüj</td></tr><tr><td>SW 32Ti salıncak rotoru</td><td>Beckman Coulter</td><td>369694</td> Ultrasantrifüj Avanti J-26 XP <td>için salıncak rotoru</td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>393124</td><td>Santrifüj</td></tr><tr><td>JA-25.50 rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>363058</td><td>Avanti J-26 XP santrifüj için rotor</td></tr><tr><td>FITC Isomer I</td><td>Life Technologies</td><td>F-1906</td><td>Floresan boya</td></tr><tr><td colspan="4">Diğer Malzeme/Ekipman</td></tr><tr><td>Sayma haznesi (Neubauer veya Malassez gibi)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kapaklı</td><td></td><td></td> koyu renkli buz kovaları<td></td></tr><tr><td>Teraziler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manyetik karıştırıcı ve tutma direği</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soğutmalı mikrosantrifüj</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 ° C; C su banyosu-80</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>& derece; C freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Sarf malzemeleri</td></tr><tr><td>Labcoat</td><td></td><td></td><td>Sağlık ve güvenlik</td></tr><tr><td>Eldivenler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kol koruyucuları Gözlükler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Emici pedler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biyolojik tehlike çöp torbaları ve kutuları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weck-Prep bıçakları</td><td></td><td>Diseksiyon</td><td>60 mm/2,25 inç genişliğinde tıraş bıçağı</td></tr><tr><td>15 cm plastik tabak</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steril gazlı bez levhalar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ve 50 ml tüpler</td><td></td><td></td><td>Ortak sarf malzemeleri</td></tr><tr><td>Mikrotüpler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum folyo</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

retina pigment epitel hücreleri üzerinde fagositoz tahliller için domuz veya sığır fotoreseptör dış kesimleri büyük Ölçekli arıtma

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Retina pigment epitel (RPE) hücreler, fotoreseptör dış segmentleri (POS) harcanan yaşlı uzak parçalarının fagositoz hayati fonksiyonlarından biri Analizi in vitro yapılabilir. Fototransdüksiyon makineleri içeren membranöz diskler yığınları ile fotoreseptör dış segmentleri sürekli retinada yenilenmektedir. Harcanan POS RPE hücreleri tarafından günlük olarak elimine edilir. Kemirgen, domuz / sığır ve insan RPE hücreleri, benzer bir şekilde, çeşitli türlerden POS tanır. Küçük değişkenlik deneylerin büyük bir dizi performans sağlamak için, POS büyük bir stok domuz gözlerinin izole edilir ve eşit miktarlarda dondurulmuş olarak saklanır. Bu protokol, karanlıkta muhafaza edildiğinde, turuncu bir renk gösterir photopigments özelliklerini yararlanır. Loş kırmızı ışık altında, yarım kesilmiş açılan eyecups bir tampon içinde retinae toplanır. retinal hücre süspansiyonu, homojen bir devamlı sükroz gradyanı üzerinde süzüldü ve sütuna yüklenir. Cen sonratrifugation POS karakteristik turuncu bir renge sahiptir gradyanının üst kısmında ayrı bir bant bulunur. POS daha sonra toplandı, bükülmüş, yıkama tampon içinde yeniden süspansiyon haline getirildi, sırasıyla, sayılır ve bölünür. Bu şekilde elde edilen POS fagositoz tahlilleri ve POS uygulamasından sonra, çeşitli zamanlarda protein aktivasyonu, lokalizasyonu veya etkileşim analizi için kullanılabilir. Alternatif olarak, POS ör. Florofor ile etiketlenebilir örn., FITC, daha sonra floresan bağlayıcı POS miktarının veya yutulma için aliquoting önce. Diğer olası uygulamalar oksidatif stres ya da RPE hücrelerinin yaşlanma etkilerini incelemek için stres koşulları ile birlikte modifiye POS veya POS meydan kullanımını içerir.

lineer sakroz derecesi ve ultra-santrifüj kombinasyonu yoğunluğu retinal süspansiyon, farklı bileşenlerin ayrılmasına izin verir. Ağır büyük retina döküntü ve RPE hücreleri gradyanı (Şekil 2A) tabanına veya yakınındaki batar. Retinadan Çakmak POS ve hafif tek tek hücreler veya hücre enkaz santrifüj dönemi sonunda degrade üst yarısını ulaşmak için ayrı bantları göç. Santrifüj adım sonrasına kadar karanlıkta gözleri ve örnekleri tutarak, POS içeren grup derhal parlak turuncu rengi ile ayırt edilebilir. Bu...

Bu makale, homojenizasyon ve sükroz gradyan santrifüjlemesi kullanılarak domuz/sığır retinasından ultrasantrifüjleme yoluyla fotoreseptör dış segment fragmanlarının (POS) saflaştırılması için protokolü açıklamaktadır. Bu protokol, daha sonra -80 °C'de saklanabilen, etiketli veya etiketsiz büyük POS stoklarının hazırlanmasına izin verir.

Retina Pigment Epitel Hücreleri üzerinde Fagositoz Tahliller için Domuz veya Sığır fotoreseptör dış Kesimleri Büyük Ölçekli Arıtma

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

Bu prosedürün genel amacı, savaş işaretinden veya sığır gözlerinden arındırılmış büyük ölçekli fotoreseptör dış segment stokları oluşturmaktır. Retina pigmentinin en önemli fonksiyonlarından biri olan epitel hücrelerini, ritmik günlük OC asit aktivitelerini incelemek. Bu, önce ultrasantrifüj tüplerinde gradyanlar olan %25 ila %60 sükrozun dökülmesiyle gerçekleştirilir.Daha sonra domuz veya sığır gözleri diseke edilir ve Rey toplanır ve homojenize edilir. Daha sonra, yeniden filtrelenir ve fotoreseptör dış segmentlerini ayırmak için sakaroz gradyanına ve santrifüje yüklenir. Son olarak, fotoreseptörün dış segmentlerini içeren turuncu bant ya olduğu gibi saklanan bir alikotta toplanır ya da Ali'den önce etiketlenir, alıntılanır ve saklanır.Sonuç olarak, otomatik floresan taraması, floresan mikroskobu veya immüno-bloklama, hücre hatlarının, kök hücrelerden türetilen farklılaşmış hücrelerin veya çeşitli koşullarda birincil kültürlerin fagositik aktivitesini incelemek için kullanılır. Bu tekniğin, her deney için oto segmentlerin kütleden veya gözlerden izole edilmesine göre ana avantajı, aynı malzeme havuzunun birkaç deney için kullanılabilmesi ve böylece daha yüksek derecede tekrarlanabilirliğe izin vermesidir. Bu yöntemin görsel gösterimi pratiktir, çünkü kritik bir adım iyon dökümünde yatmaktadır, çünkü izole edilmiş dış segmentlerin aralığını koşullandırır.Prosedürü gösteren, bir yüksek lisans öğrencisi ve laboratuvarımdan memnun bir teknisyen olan Celia Parino olacak Metin protokolüne göre 80 taze domuz veya gözü elde ettikten sonra, onları karanlıkta tutun ve mümkün olduğunca buz üzerinde soğutun. Görsel pigmentlerin foto ağarmasını ve tezgah üzerine kurulan turuncu pembe renk kaybını önlemek için, kırmızı güvenli ışık lambası emici pedler ve mendiller. Atık toplama ve tıraş bıçakları için 15 santimetrelik bir çanak biyolojik tehlike torbası hazırlayın.Tüm çözeltiler hazırlandıktan sonra, metin protokolüne göre, önceden soğutun ve tüm adımlar boyunca soğuk tutun. Degrade yapıcıyı manyetik bir karıştırma plakası üzerinde sabitleyin ve karıştırma çubuğunu %60'lık çözeltinin döküleceği çıkışa en yakın odaya yerleştirin. Her biri %200 ve %25 sükroz çözeltisinden 12 mililitre ile uygun döküm hızı elde etmek için borunun çıkışına yerleştirilmiş bir kesme P 60 pipet ucu kullanın.Ve %60'lık çözeltiyi karıştırırken, pipet ucunun açıklığını sürekli yükselen gradyan çözeltisinin yüzeyinde tutarak önceden soğutulmuş bir santrifüj tüpüne doğrusal bir sükroz gradyanı dökün. Doku toplama işlemini gerçekleştirmek için, kesme yüzeyi ters çevrilmiş halde bir elinizle gözünüzü tutarken loş kırmızı ışık altında sıkı oturan bir laboratuvar önlüğü, eldiven, kol koruyucuları ve gözlük takın, gözün önünü delmek için bir tıraş bıçağının kenarını kullanın. Ardından ön göz küresini ikiye bölmek için tıraş bıçağını kullanın.Lensi çıkarın ve göz kapağını tek parmağınızın ucunda tutulabilecek şekilde ters çevirin. Böylece, tıraş bıçağını belirli bir açıyla kullanarak retinayı açığa çıkararak, kolayca ayrılacak ve tetum yüzeyinden pembemsi bir tabaka olarak görünecek ve optik sinir başından kesecek olan retinayı nazikçe kazıyın. Retinaları, buz üzerinde 15 mililitre homojenizasyon çözeltisi içeren iki ila 50 mililitrelik tüplerden birine aktarın.Tüm retinaları topladıktan sonra, süspansiyonu iki dakika boyunca elinizle kuvvetlice çalkalayın. Farklı hücre katmanlarını bozmak için, fotoreseptörün dış segmentlerini kırın veya fotoreseptörlerin geri kalanını POS'tan ayırın, POS'u parçalayın ve retina süspansiyonunu homojenize edin. Büyük doku parçalarını çıkarmak için, süspansiyonu üç kez 50 mililitrelik bir tüpe filtrelemek için çift kat temiz gazlı bez kullanın.Kalan parçalanmış dokuları serbest bırakmak için gazlı beze hafifçe bastırın. Her filtrasyondan sonra, ham retina preparatını altı ila 24 mililitre,% 25 ila 60 sükroz gradyanları üzerine nazikçe yerleştirin. Tüpleri dengeledikten sonra Ultra santrifüj 106.000 Gs'de dört santigrat derecede 50 dakika boyunca.Sıkma tamamlandığında, çözeltinin çoğunu gradyanın üst üçte birlik kısmındaki turuncu pembe Bandın üzerine aspire edin. Daha sonra bir P 1000 ucu kullanarak turuncu pembe bandı bir behere toplayın. Çözeltiyi seyreltmek için yaklaşık dört ila beş hacim yıkama kullanın ve gerektiği kadar 30 mililitrelik tüplere alikot yapın.Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 3000 GS'de santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice atın. Daha sonra iki çözelti reus yıkayın, tekrar döndürmeden önce peletleri askıya alın. Peletleri yıkamak için üç yıkama solüsyonu kullanın.Üçüncü kez. Hücreleri yeniden askıya almak için 10 ila 20 mililitre DMM kullanın.Ardından, 10 mikrolitre hücreyi seyreltmek için 490 mikrolitre DMM kullanın ve mililitre başına POS parçacıklarındaki verimi ve konsantrasyonu yeniden hesaplayın. Nihai bir DMM hacmine karar verin ve% 2.5'lik bir nihai konsantrasyona sükroz ekleyin. İstenen alikotları hazırlayın. Oda sıcaklığında üç ila beş dakika boyunca 2, 300 GS'de tek bir alikot döndürün.Pelet boyutunu değerlendirin ve bir kereden fazla donarak çözülmeyi önlemek için çeşitli alikot hacimleri hazırlayın. Eloqua watting'den önce hücreleri etiketlemek için. 10 miligramlık bir ZI şişesini mililitre başına 2,5 miligramlık bir konsantrasyona yeniden süspanse etmek için 0.1 molar sodyum karbonat tamponu kullanın.Karanlıkta oda sıcaklığında bir saat döndürün ve kalan ZI katılarını peletlemek için beş dakika maksimum hızda döndürün. 10 mililitre yıkama üç solüsyonu veya dmm kullanarak POS peletini yeniden süspanse edin ve 80 göz için iki mililitre Fite solüsyonu ekleyin. Işıktan korumak için alüminyum folyo kullanın ve en az 1,5 saat döndürün.Oda sıcaklığında. Hücreleri videoda daha önce anlatıldığı gibi iki kez yıkamak için üç yıkama solüsyonu kullanın ve ardından süpernatantta neredeyse hiç serbest fite görülmeyene kadar bir ila iki kez DM EM kullanın. POS'u askıya almak ve burada görüldüğü gibi etiketlenmemiş POS'a benzer bir quat saymak için DM EM'yi kullanın.Santrifüjleme adımından sonraya kadar gözleri ve numuneleri karanlıkta tutarak, POS içeren sükroz gradyan yasağı, parlak turuncu rengiyle hemen tanınabilir. Ve eğer hasar görürlerse, biraz tozlu bir arka plan gibi, çok daha küçük parçalar olarak görünürler. Tipik olarak, düzgün bir şekilde izole edildiğinde, POS uzun, düz veya bükülmüş görünmelidir.Mikroskop altında gözlemlendiğinde, mikroskoptaki odak düzlemine bağlı olarak karanlık veya parlak görünebilirler. Düzgün bir şekilde yeniden askıya alınmazlarsa, kümeler halinde kalırlar. İzole edilmiş POS, mutant RPE hücrelerinin fagositik yeteneğini doğrudan test etmeye yarar.Bu örnekte, POS, vahşi tip farelerden alınan birincil RPE hücreleri tarafından kolayca fagositoz olurken, beta beş integrin ve MFG sekiz nakavt fareden elde edilen hücreler aynı sürede daha az POS içerir. POS fagositozunun miktar tayini, mikroskop resimlerinde FSE etiketli POS'u manuel olarak sayarak, floresan yoğunluğunu ölçerek veya hücre tripsininden sonra akış sitometrisi ile yapılabilir. Bu şekil, immünofloresan, kolokalizasyon testleri kullanılarak protein alımını analiz eder ve protein alımı veya aktivasyonu, immünopresipitasyondan sonra immünobloklar üzerinde veya geliştirilmesinden sonra fosforilasyonu kontrol ederek doğrulanabilir.Bu teknik, fosfat sein aracılı fagositoz alanındaki araştırmacıların, retinal pigment petal hücrelerindeki moleküler mekanizmayı keşfetmeleri ve karakterize etmeleri ve bulguları makrofajlar gibi diğer fagositik hücrelerle karşılaştırmaları için yol açtı.

large-scale-purification-porcine-or-bovine-photoreceptor-outer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, in vivo ve ex vivo çalışmalar için birincil kültürlerini elde etmek üzere domuz gözlerinden iris ve retina pigment epitel hücrelerini izole etmek için bir tekniği açıklıyoruz. Bu pigment hücreleri, oküler bozuklukları tedavi etmek için rejeneratif yaklaşımları incelemek için genetik olarak değiştirilebilir.

IPE ve RPE Hücrelerinin İzolasyonu: İzole Domuz Gözünden Pigmente Epitel Hücreleri Elde Etme Tekniği

Bu video, retina pigment epitel veya RPE hücrelerini ve iris pigment epitel veya IPE hücrelerini hasat edilen sığır gözlerinden izole etme prosedürünü gösterir. İzole edilen hücreler, oküler hastalıkların tedavisindeki rollerini incelemek için kültürlenebilir.

Sığır Gözünden RPE ve IPE Hücrelerinin İzole Edilmesi: Sığır Primer Pigment Epitel Hücrelerinin Hasat ve Kültür Prosedürü

Burada, birincil iris ve retina pigment epitel hücrelerini çeşitli memelilerden (fareler, sıçan, tavşan, domuz ve sığır) izole etmek ve transfekte etmek için bir protokol sunulmaktadır. Yöntem, insanlara aktarılabilir ex vivo analizleri ve in vivo çalışmalar için çeşitli kurulumlarda oküler gen tedavisi yaklaşımlarını incelemek için idealdir.

Viral Olmayan Gen Tedavisi için Memeli Primer Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu, Kültürü ve Genetik Mühendisliği

İlk olarak 20161'deFernandez-Godino ve arkadaşları tarafından bildirilen bu protokol, Transwell plakalarında bir hafta içinde işlevsel ve polarize bir RPE monolayer oluşturan fare RPE hücrelerini verimli bir şekilde izole etmek ve kültüre etmek için bir yöntem tanımlamaktadır. İşlem yaklaşık 3 saat sürer.

Birincil Fare Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli Diseksiyonu ve Kültürü

Bu protokol, protein analizi için murin çubuk fotoreseptörlerinin hücre altı bölmelerini izole etmek için iki teknik sunar. İlk yöntem, çubuk dış segmentlerini ayırmak için canlı retina ve selüloz filtre kağıdı kullanırken, ikincisi çubuk iç ve dış segment katmanlarını soymak için liyofilize retina ve yapışkan bant kullanır.

Protein Analizi için Fare Retinasındaki Fotoreseptör Hücre Bölmelerinin İzolasyonu İçin İki Peeling Yöntemi

Bu yazıda retinal pigmente epitel (RPE) hücrelerinin fare gözlerinden kademeli olarak izole edilmesi için basitleştirilmiş bir protokol anlatılmaktadır. Protokol, fare gözlerinin enükleasyonunu ve diseksiyonunu, ardından RPE hücrelerinin izolasyonunu, tohumlanmasını ve kültürlenmesini içerir.

Primer Fare Retinal Pigmentli Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

Burada, primer domuz retinal pigment epitel hücrelerinin in vitro olarak kültürlenmesi için takip edilmesi kolay bir yöntem sunulmaktadır.

Domuz Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Primer Kültürü

Retinal pigment epitel (RPE) hücrelerinin hücrelerini genç pigmentli kobayların gözlerinden izole etmek için basit ve etkili bir yöntem sunuyoruz. Bu prosedür, gen ekspresyon analizleri de dahil olmak üzere izole RPE üzerinde moleküler biyoloji çalışmalarının izlenmesine izin verir.

Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Guinea Pig Gözlerinden İzolasyonu

Bu protokol, yüksek oranda farklılaşmış ve polarize olmuş insan retinal pigment epitelyal (RPE) kültürlerinde bir lipofussin birikim modelini ve RPE'nin toplam OS tüketimini/bozulma kapasitesini saptamak için geliştirilmiş bir dış segment (OS) fagositoz testini tanımlamaktadır. Bu yöntemler, önceki lipofussin modellerinin ve klasik nabız kovalama dış segment fagositoz testlerinin sınırlamalarının üstesinden gelmektedir.

Yüksek Polarize İnsan Retinal Pigment Epitel Kültürlerinde Geliştirilmiş Lipofussin Modelleri ve Dış Segment Fagositoz Kapasitesinin Ölçülmesi

Bu protokol, lokal kaynaklı domuz gözlerinden primer retinal pigment epitel (RPE) hücrelerinin elde edilmesi ve kültürlenmesi prosedürünü özetlemektedir. Bu hücreler, kök hücrelere yüksek kaliteli bir alternatif olarak hizmet eder ve in vitro retinal araştırmalar için uygundur.

İn Vitro Modelleme için Primer Domuz Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

Retina pigment epiteli (RPE), koroid ve retina arasında çok önemli bir bariyer görevi görür ve fotoreseptörler gibi retina hücre tiplerinin sağlığını ve işlevini destekler. Burada, yetişkin murin RPE'yi izole etmek ve kültürlemek için basit ve etkili bir protokol açıklıyoruz.

Yetişkin Farelerden Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Öğrenin, domuz veya sığır gözlerinden fotoreseptör dış kesimlerini büyük ölçekli arıtmak için ultrasantrifüjasyon yöntemini. Bu teknik, retina pigment epitel hücrelerinin fagositoz fonksiyonlarını incelemek için tekrarlanabilir malzeme stokları sağlar.

Retina Pigment Epitel Hücreleri üzerinde Fagositoz Tahliller için Domuz veya Sığır fotoreseptör dış Kesimleri Büyük Ölçekli Arıtma (Video) | JoVE Journal

Retina Pigment Epitel Hücreleri üzerinde Fagositoz Tahliller için Domuz veya Sığır fotoreseptör dış Kesimleri Büyük Ölçekli Arıtma

Daha fazla video keşfet