Fare Koklear Eksplantlarından uzun vadeli Time Lapse Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, beş gün boyunca 30 dakikalık aralıklarla bir floresan raportör fareden alınan embriyonik bir kokleayı görüntülemektir. Bu, ilk olarak floresan raportör farelerden embriyonik gün 13 kokleasının toplanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, koklea in vitro olarak kültürlenir.

Daha sonra koklear ekzplan kültürleri inkübatör mikroskobuna yerleştirilir. Son olarak, otomatik bir görüntüleme rutini oluşturulur ve koklea E görüntülenir. Sonuç olarak, koklear ekzplan kültürlerin uzun süreli hızlandırılmış görüntülemesi, bir bütün olarak koklear epitelin morfogenetik hareketlerinin yanı sıra zaman içinde raportör gen ekspresyonundaki değişiklikleri ve yavaş etkili farmakolojik ajanların etkilerini göstermek için kullanılabilir.

Bu tekniğin, X fon kültürlerini bir zaman boyunca manuel olarak fotoğraflamak gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bu sistemin tamamen otomatik olmasıdır. Daha fazla zaman noktasının toplanmasına izin verir ve düzensiz doku kültürü inkübatöründe büyürken, koklear veya hücre kümesinin aynı bölgesinin her zaman noktasında aynı oryantasyonda görüntülenmesini sağlar. Ekteki metin protokolüne göre KO'nun modifiye edilmiş kartal ortamını veya DMEM ve Hank'in denge tuzu çözeltisini veya HBSS'yi tamamladıktan sonra.

Laminer bir akış başlığı altında, yeniden askıya almak için beş mililitre unsu takviyeli DMEM kullanın, 200 mikrolitre bazal membran substrat pipeti, 35 milimetre çapında cam tabanlı bir kültür kabının her 10 milimetrelik kuyusunun merkezine 150 mikrolitre pipetleyin. 35 santigrat derecede bir CO2 inkübatöründe 40 dakika inkübe edin. İş istasyonunu ve aletleri hazırlamak için laminer akışlı temiz tezgahı açın ve püskürtmek ve forseps, kaşık ve siyah silikon kaplı bir tabağı ıslatmak için %70 etanol kullanın.

Temiz iş istasyonunda, uygun gebeliğin embriyolarını buzda toplayın. Soğuk HBSS% 1 yığınları ile desteklenmiştir. Bir floresan stereo mikroskop kullanarak, harici olarak veya görünür bir organ içinde raportör aktivitesi sergileyen embriyoları tanımlayın ve bunları soğuk bir ışık kaynağı ve ince forseps kullanarak temporal kemikleri toplamak için% 1'lik yığınlarla taze buz gibi HBSS'ye aktarın.

Kafaları toplamak için servikal omurları ve çenenin altını kırpmak için hızlı bir şekilde çalışın. Embriyo kafalarını metin protokolüne göre topladıktan sonra, kafatasını dikkatlice açın, ardından başın önündeki beyin kesimini çıkarın ve arka kafatasını taze buzlu bir tabağa aktarın. Soğuk. HBSS yığınları, fıstık şeklindeki temporal kemikleri dikkatlice inceleyin ve vestibüler sistemi sağlam tutmaya özen gösterin.

Kokleayı incelemek için, temporal kemikleri buz gibi HBSS yığınları halinde siyah silikon elastomer kaplı bir kaba aktarın. Temporal kemiği stabilize etmek ve forsepsler için yer açmak için pimleri eğik bir açıyla sokarak kemiğin vestibüler bölgesini sabitleyin. Daha sonra, forsepslerin bir bağını koklea tabanının dış kenarındaki kıkırdağa sokarak ve kıkırdakta bir delik açarak kokleayı çevreleyen kıkırdağı dikkatlice çıkarın.

Kapsülün üst kısmından yatay ve çapraz olarak klipsleyin ve dikkatlice kaldırın. Kalan kıkırdak ile kanal arasına forsepsin bir ucunu yerleştirin ve kalan kıkırdağı nazikçe kesin. Kokleanın apikal yüzeyi artık açığa çıkmıştır.

Tabandan başlayarak kanalın çatısının koklear epitel ile birleştiği alanı yakalayın ve koklear kanalı açın. Gerektiğinde çatı kaplamasını tamamen çıkarılana kadar nazikçe soyun. Kanalın medial tarafında kalan zar kısımlarını kesin.

Daha sonra fazla mezenkimal doku kanalını temizleyin ve kanalı vestibüler sistemden kültür implantlarına ayırın. Bir lümen yüzeyini, alt tabaka kaplı cam tabanlı kültür kabının ortasına yerleştirin. Sıvıyı dikkatlice çekin ve iki dakika bekletin.

Sonra damla damla. X explan'a 150 mikrolitre takviye edilmiş DMEM ekleyin, alt tabakaya yerleşebilmesi için rahatsız etmemeye dikkat edin. Nemi korumak için cam alt tabakları 12 santimetre çapında derin bir Petri kabına küçük bir steril su kabıyla yerleştirin.

Kültürleri gece boyunca 35 santigrat derecelik bir inkübatöre koyun, böylece explan'ın alt tabakaya yapışması ve canlı görüntüleme yapmak için düzleşmesi için. Numuneleri seçtikten sonra, ekilen her kokleanın durumunu değerlendirmek için bir floresan stereo mikroskop kullanın ve yalnızca kanalın sağlam olduğu ve tabandan tepeye kadar cama tutturulduğu eksplantları seçin. İnkübatörü kültüre %5 CO2 ile 35 santigrat dereceye ayarlayın.

Koklear doku, takviye edilen DMEM'i kültürlerden nazikçe aspire eder ve en az 500 mikrolitre taze bir besiyeri ile değiştirir. Explan'ın gevşek bir şekilde takıldığı durumlarda, tabağın kenarına orta boy bir halka pipetleyin. Bu ekstra sıvı, matrise yapışmaya devam ederken dış planı bozmadan minyatür bir nemlendirilmiş oda yapacaktır.

Bu örnekteki mikroskop, laminer akış başlığının altında 8 adet 35 milimetrelik numune kabı tutan dönen bir platforma sahiptir. Plastik kapakları cam kapaklarla değiştirin ve bulaşıkları numune tutucusuna yerleştirin. Deney süresince ortamı değiştirmek gerekirse.

Kalıbı bozmamak için, çanak mikroskopta yuvasında kalırken kapakların açılmasına izin verecek menteşeli çanak kapakları kullanın, numune kabı tutucusunu inkübatör mikroskobunun içine yerleştirin, ekşamentörün tabağın altından çıkmamasına veya ortamı bozmamaya dikkat edin. Görüntüleme rutinini ayarlamak için mikroskop UV lambasını ve kamerayı açın ve görüntüleme yazılımını açın. Bulunan her örnek için, yalnızca başlangıç anındaki explan'ın görünümünü değil, aynı zamanda dokunun çalışma sırasında nasıl hareket edeceğini de göz önünde bulundurarak, odak ve pozlama için bir görüntüleme alanı düzlemi seçin.

Floresan kanalında, seçilen odak düzlemini merkeze alan bir Z yığını ayarlayın. Ardından, deney için örneklemenin sıklığını ve uzunluğunu ayarlayın. Bu, hızlandırılmış bir sürenin sonunda bir film oluşturmak için görüntülerin toplanması için geçen süre ile sınırlı olacaktır.

Örnek bir kare için görüntü dosyalarını kare kare açmak için METAMORPH gibi bir yazılım kullanın. İlgilenilen hücre popülasyonunu göstermek için en iyi odak düzlemini seçin. Son olarak, görüntüleri bir nokta VI dosyasına dönüştürün veya görüntü işleme yazılımında açılıp analiz edilebilecek veya diğer biçimlere dönüştürülebilecek bir dizi görüntü oluşturmak için bunları bir montaj olarak dışa aktarın.

Burada, organotipik bir koklear ekplanın kaplandığında nasıl büyüyeceğini gösteren bir film gösterilmektedir. E 13.5'te, duyusal olmayan bölgelerin hücreleri bölünüp hareket ederken, pros duyusal bölgesini yeşil renkte görüldüğü gibi görselleştirmek için bir SOX iki muhabir faresi kullanıldı. Yeşil renkteki proliferatif olmayan duyusal bölge, doku yeniden düzenlemelerine ve yakınsak uzama hareketlerine maruz kalır.

Farklı bir koklear ekplantın orta tabanını merkeze alan ikinci bir zaman atlamalı deney, artıları genişlettikçe bunu göstermektedir. Duyusal bölge kültürde ilk kez daralır. Doku kalınlığı, ekspresyon bölgelerini tanımlamayı mümkün kılar, ancak tek tek hücreleri tanımlamayı mümkün kılmaz.

Bununla birlikte, kültürde üç gün sonra, doku önemli ölçüde düzleşmiştir ve bu prosedürü takiben tek tek floresan hücrelerin görselleştirilmesini mümkün kılmıştır. Gen ekspresyonundaki değişiklikleri moleküler düzeyde değerlendirmek için immünofloresan boyama veya protein ve RNA ekstraksiyonu gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, kokleanın nasıl diseke edileceğini ve kültürleneceğini ve bir gün boyunca tüm ekte canlı görüntüleme yapmak için bir inkübatör mikroskobunun nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.