RNA dizileme Analizi ile EML Hematopoetik Öncü Hücreler Self-yenileme ve farklılaşma Düzenlenmesi Anahtar Faktörler belirlenmesi

Bu prosedürün genel amacı, RNA dizileme teknolojisini kullanarak fare EML hücresinin kendini yenilemesi ve farklılaşmasının potansiyel anahtar düzenleyicilerini belirlemektir. Bu, ilk olarak yüzey işaretleyicilerine dayalı olarak soy negatif CD 34 pozitif ve soy negatif CD 34 negatif EML hücrelerinin ayrılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, mRNA'yı izole etmek, mRNA'yı cDNA'ya dönüştürmek ve kütüphaneyi dizileme için hazırlamaktır.

Daha sonra, DNA kütüphanesi yüksek verimli dizilemeye tabi tutulur. Son adım, sıralama sonuçlarını analiz etmek ve diferansiyel olarak ifade edilen transkripsiyon faktörlerini aramaktır. Sonuç olarak, RNA dizileme teknolojisi, soy negatif CD 34 pozitif ve soy negatif CD 34 negatif EML hücrelerinde diferansiyel olarak ifade edilen transkripsiyon faktörlerini göstermek için kullanılır.

RNA diziliminin mikroray gibi diğer G ekspresyonu prolen yöntemlerine göre temel avantajı, daha yüksek hassasiyete, doğruluğa ve daha geniş dinamik aralığa sahip olması ve önceden var olan gen açıklama bilgilerine dayanmamasıdır. Bu yöntem, hücrenin kendini yenilemesini ve farklılaşmasını düzenleyen temel transkript faktörlerinin neler olduğu gibi kök hücre alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin anlamı, hematopoetik öncü hücreleri kontrol eden anahtar düzenleyicinin daha iyi anlaşılması, kendini yenilemesi ve farklılaşması etkili tedavilerin geliştirilmesine yol açabileceği için kan hastalığının tedavisine kadar uzanır.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişi mücadele edecektir çünkü sıralama analizi için çeşitli biyoformatik araçlar gereklidir. Kök hücre faktörü toplanması için bebek hamster böbreği veya BHK hücreleri, 25 santimetrekarede% 10 FBS içeren dmem ortamında, 37 santigrat derecede şişede ve% 5 CO2'de kültürlenir. Hücreler% 80 ila 90 birleşim tripsin gözlerine ulaştığında ve bunları oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200 Gs'de santrifüjleme ile topladığında, snat'ı atın ve hücre paletini 10 mililitre taze BHK hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin.

Hücre süspansiyonunun iki mililitresini 75 santimetre karelik yeni bir şişeye aktarın, bir uygulama ve 48 mililitre taze BHK hücre kültürü ekleyin. Şişe kültürüne orta. İki gün boyunca BHK hücreleri.

İki gün sonra, kültür ortamını toplayın ve 45 mikrometrelik bir nokta filtreden geçirin. Ortamı eksi 20 santigrat derecede saklayın. Bu protokolde kullanılan fare eritroid, miyeloid ve lenfositik veya EML hücreleri, 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de BHK hücre kültürü ortamı içeren EML bazik ortamında süspansiyon halinde kültürlenir.

EML hücrelerini, mililitre başına 600.000 hücreden daha az bir tepe yoğunluğuna sahip düşük hücre yoğunluğunda tutun. Hücreleri her iki ila üç günde bir, hücrelere bir ila beş geçiş oranında nazikçe bölün, ancak soy pozitif hücreleri tüketmek için 10 nesilden fazla olmamalıdır. EML hücrelerini beş dakika boyunca 200 Gs'de santrifüjleme ile hasat edin.

Hücreleri PBS ile bir kez yıkayın ve süpernatanı attıktan sonra tekrar santrifüjleyin. Hücreleri PBS'de yeniden askıya alın ve hücreleri bir hemo sitometre ile sayın. Bir sonraki adımda antikor konsantrasyonunu belirlemek için hücre sayısına ihtiyaç vardır.

Üreticinin talimatlarına göre bir soy antikoru kokteyli ve manyetik olarak etkinleştirilmiş bir hücre sıralama sistemi kullanarak soy negatif veya çizgi negatif hücreleri izole edin. Bu işleme başlamak için, lin negatif hücreleri beş dakika boyunca 200 Gs'de döndürün. Hücre peletini PBS ile yeniden süspanse edin ve hücreleri bir hemo sitometre ile sayın.

Hücreleri faks arabelleği ile iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, hücreleri beş dakika boyunca 200 Gs'de pelet haline getirin. Beş adet 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpünü sırasıyla 1, 2, 3, 4 ve beş sayılarıyla etiketleyin.

Hücreleri, 100 mikrolitre başına 1 milyon hücre konsantrasyonuna kadar uygun bir hacimde gerçek tamponu ile yeniden süspanse edin. Daha sonra, beş mikro santrifüj tüpünün her birine 100 mikrolitre hücre süspansiyonu alın. Birinci tüpe ve ikinci tüpe bir mikrogram anti fare CD 34 FE antikoru ekleyin.

Tüpleri karıştırın, tüm tüpleri karanlıkta bir saat boyunca dört santigrat derecede nazikçe inkübe edin. Daha sonra, 25 mikrogram PE konjuge antika, bir antikor ve 20 mikrolitre bir PC konjuge soy ekleyin. İki tanesine kokteyl antikorları, üçüncü tüpe 25 mikrogram PE konjuge antika bir antikor ve 20 mikrolitre bir PC konjuge soyu ekleyin.

Dördüncü tüpe karşı kokteyl antikorları. Tüpleri nazikçe karıştırın ve hücreleri karanlıkta 30 dakika daha dört santigrat derecede inkübe edin. 30 dakika sonra, tüm tüplere 300 mikrolitre faks tamponu ekleyin ve hücreleri beş dakika boyunca 200 Gs'de döndürün.

Son yıkamadan sonra hücreleri 500 mikrolitre faks tamponu ile üç kez yıkayın. Resus, her bir hücre peletini 500 mikrolitre faks tamponunda askıya alır, floresanla aktive edilmiş hücre sıralama ile tüp birde lin negatif SCA pozitif CD 34 pozitif ve lin negatif SCA negatif CD 34 negatif hücreleri izole eder. Toplam RNA, lin negatif CD 34 pozitif ve lin negatif CD 34 negatif hücrelerden triol kullanılarak ekstrakte edilir ve kontamine DNA, deoksiribo nükleaz kullanılarak çıkarılır.

Üreticinin protokolünü izleyerek, üreticinin talimatlarını izleyerek bir biyoanalizör kullanarak toplam RNA'nın kalitesini değerlendirin, mRNA ekstraksiyonu ve sonraki kütüphane yapım prosedürleri için yalnızca RNA bütünlük numarası veya RIN'i dokuzdan büyük olan RNA örnekleri kullanılır. Bu şekil, 9.4'e eşit bir RIN ile yüksek kaliteli bir RNA örneğinin sonucunu göstermektedir. Burada kullanılan kütüphane yapım protokolü, Illumina RNA dizileme platformuna özgüdür ve bir RNA numune hazırlama kiti kullanır.

Bu videoda yalnızca seçilen adımlar gösterildiği için üretici tarafından sağlanan yönergeleri izleyin. Oligo DT manyetik boncuklar kullanarak poli MNA'yı pozitif olarak seçerek başlayın. Ardından, poli mRNA'yı parçalayın, mRNA'yı CD NA'ya dönüştürmek için rastgele primerler kullanarak ters transkripsiyon gerçekleştirin. Daha sonra, sentezlenen ikinci iplikçik CD NA, çift sarmallı DNA oluşturmak için kullanılır.

Daha sonra, üç asal çıkıntı çıkarılır ve beş asal çıkıntı, DNA polimeraz denate ile doldurulur. CD NA parçalarının birbirine bağlanması için üç asal uç. Sıralama için çift sarmallı CD NA'nın her iki ucuna multipleks indeksleme adaptörleri ekleyin.

Son olarak, bir spektrofotometre kullanarak fragmanlar için CD NA'nın zenginleştirilmesi için PCR gerçekleştirin, amplifiye edilmiş DNA'nın iki 60 aşırı absorbans iki 80'ini ölçün. Kütüphanenin konsantrasyonu hakkında bilgi edinmek için, kütüphane kalitesini değerlendirin ve bir biyoanalizör kullanarak DNA parçalarının boyut aralığını ölçün. RNA dizileme veri analizi yöntemleri, eşlik eden protokol Metninde bulunur ve aşağı akış analizi için veri dosyası işlemeyi, yeni transkriptleri tespit etmeyi ve ekspresyon seviyesini değerlendirmeyi, diferansiyel olarak ifade edilen genleri tespit etmeyi ve diferansiyel olarak ifade edilen transkripsiyon faktörlerini tanımlamayı içerir.

Soy negatif EML hücreleri anti CD 34, antika bir ve soy kokteyli antikorları ve lin negatif, kafatası pozitif, CD 34 pozitif ve lin negatif sca ile boyandı. Negatif CD 34 negatif hücreler, sadece floresanla aktive edilmiş hücre sıralaması kullanılarak ayrıldı. Lin negatif hücreler, SCA one ve CD 34 ekspresyonunun analizi için kapıya alındı.

Kütüphane inşaatı bittiğinde iki EML hücresi popülasyonu gözlendi. Kütüphanedeki DNA parçalarının boyutu bir biyoanalizör kullanılarak kontrol edildi. Bu temsili veriler, iyi kalitede bir kütüphane gösterir, ancak parça boyutu yaklaşık 300 baz çiftinde zirve yapar.

D-E-S-E-Q algoritması, diferansiyel olarak ifade edilen transkripsiyon faktörlerine odaklanarak diferansiyel ekspresyon analizi için kullanıldı, çünkü transkripsiyon faktörleri sülfat tayini için çok önemlidir. Lin negatif CD 34 pozitif ve lin negatif CD 34 negatif arasında 1,5 kattan fazla değişen transkripsiyon faktörleri bulundu ve bu ısı haritasında gösterildi. Özellikle, lin negatif CD 34 pozitif hücrelerde TCF yedi'nin nispi ekspresyon seviyesi, lin negatif CD 34 negatif hücrelerdekinden 100 kat daha yüksektir.

Bu nedenle, EML hücrelerinde kendini yenileme ve farklılaşmanın düzenlenmesindeki işlevini doğrulamak için daha fazla kromatin immünopresipitasyon ve sıralama analizi ve fonksiyonel test için TCF yedi seçildi. Bir kez ustalaştıktan sonra, RNA kütüphanesi birkaç gün içinde tamamlanabilir ve düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse tüm prosedür yaklaşık bir ay içinde tamamlanabilir. Bu teknoloji, B hücreleri ve malign B hücreleri gibi çeşitli hücre tipleri ve dokular arasında farklı gen ekspresyonunu keşfetmeye istekli araştırmacıların yolunu açtı.

Bu prosedürü denerken, yüksek CAR TRNA kullanmayı unutmamak önemlidir çünkü bu, tüm RNA hasta prosedürünün temelidir. Bu videoyu izledikten sonra, EML hücre hücresi yenilenmesini ve farklılaşmasını kontrol eden temel düzenleyicileri nasıl tanımlayacağınızı daha iyi anlamış olmalısınız.