Deneysel Servikal Spinal Kord Yaralanmalarında Sinir Öncü Hücreler ve Öz-montaj Peptitler sinerjik Kullanımı

Bu prosedürün genel amacı, sıçanlarda servikal SCI'nin bir kontüzyon kompresyon klipsi modelini ve SAP enjeksiyonu ve NPC transplantasyonunu içeren kombine tedavi için bir protokol sunmaktır. İlk olarak, omuriliğin etrafına bir anevrizma klipsi yerleştirilir ve bir dakika boyunca yerinde tutulur. Bu, bilateral kontüzyon kompresyon yaralanması ile sonuçlanır.

Daha sonra SAP'ler yaralanma merkez üssüne enjekte edilir, NPC'ler SAP enjeksiyonundan hemen sonra enjekte edilir. Büyüme faktörlerinin sürekli olarak verilmesi için subdural kateterli bir ozmotik pompa yerleştirilir. Bu prosedür, NPC'lerin yaralı omuriliğe verilmesiyle sonuçlanır.

NPC'lerin sağkalımı ve aşılanması, SAP'ler ve büyüme faktörleri ile kombinatoryal tedavi ile desteklenir. Bu tekniğin etkileri, travmatik omurilik yaralanması için bir tedaviye kadar uzanır, çünkü omurilik rejenerasyonunu destekleyen hücre bazlı COMBINATOR tedavilerini incelemek için kullanılabilecek klinik olarak ilgili bir model sağlar. Aşağıdaki deneysel protokol, Toronto Kanada'daki Üniversite Sağlık Ağı'nın Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmıştır ve Kanada Hayvan Bakımı Konseyi tarafından hazırlanan deney hayvanlarının bakımı ve kullanımına ilişkin kılavuzda belirlenen politikalara uygundur.

Tüm cerrahi prosedürler, steril ekipman ve solüsyonlar kullanılarak steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir ve kurum ve hükümet yönergelerine göre, bu prosedürde işleme başlamadan önce 250 ila 270 gram ağırlığında bir sıçan kullanılır. İşlem günü hayvanlara iki gün boyunca içme suyunda antibiyotik verin. Sıçanı bir anestezi odasına yerleştirdikten ve bir dakika boyunca bire bir oksijen ve nitröz oksit içinde% 5 ISO flor ile anesteziyi indükledikten sonra, ISO florini% 1.8 ila% 2.2'ye düşürün Lambik merhemi gözlere uygulayın ve bir pençe tutamlama yaparak cerrahi anesteziyi onaylayın.

Daha sonra fareyi ısıtılmış bir yastığın üzerine yerleştirin ve kafayı bir burun konisi ile stereotaksik bir çerçeveye sabitleyin. Servikal omurganın etrafındaki kürkü tıraş ettikten sonra, povidon iyot ile sürüntü alarak cildi dezenfekte edin, ardından C iki servikal omur bölgesinden T iki torasik vertebral gövdenin belirgin prosesisine orta hat kesisi yaptıktan sonra% 70 etanol uygulayın. Vertebra kaslarının dış tabakasını doğrudan orta hat üzerinde kranio coddle yönünde kesmek için cerrahi makas kullanın, proses, osis ve laminata ulaşılana kadar daha derin kas tabakalarını köreltmek için cerrahi makas kullanın.

İletki yerleştirin ve tutun. Kas katmanlarını açın, ardından T iki omur gövdesinin belirgin prosesis pozisyonunu yönlendirin ve laminektomi için hedeflenen seviyeleri belirleyin. Daha sonra 15 numara neşter kullanarak ligament derisini keserek lamini ve processis posis'i gevşetin.

Daha sonra, omuriliğe lateral laminusu kesmek için bir kemik makası kullanın ve omuriliği sıkıştırmadan laminusu nazikçe çıkarın. Şimdi, ortaya çıkan sinir köklerini kırpmaktan korumak için tanımlamak için bir dakikanızı ayırın. Daha sonra ventral durayı vertebral gövdelerin dorsal tarafından gevşetmek için bir kanca kullanın ve klips için bir koridor hazırlayın.

Klipsin halka yayının istenen kuvveti sağlayacak şekilde ayarlandığından emin olun. Klips kuvveti, travma ve kompresyonun derecesini belirler. Açık klipsi omuriliğin etrafına yerleştirin ve kontüzyon yaralanmasına neden olmak için kapanmasına izin verin.

15 ila 35 gram arasındaki klips kuvvetleri genellikle omurilik yaralanması gerçekleştirildikten sonra bir dakikalık bir kırpma süresi ile kullanılır. Klipsi çıkarın ve kasları iki kat halinde kapatın, ardından cildi kapatın. Yara düzgün bir şekilde kapatıldıktan sonra, anesteziyi durdurun ve fareyi uyanırken gözlemleyin.

Hayvan sternal için yeterli bilinci yeniden kazandıktan sonra, yaslanmış olarak, fareyi temiz bir kafese yerleştirin. Bu tür yaralanmaların ciddiyeti nedeniyle, aşağıdaki ameliyat sonrası tedavilerin takip edilmesi zorunludur. İlk olarak, semptomlara bağlı olarak üç ila beş gün boyunca buprenorfin ve meloksikam gibi ağrı kesiciler uyguladığınızdan emin olun.

Ayrıca deri altından dehidrasyonu önleyin. Üç gün boyunca günde iki kez beş ila 10 mililitre salin enjekte edin ve beş gün boyunca içme suyunda antibiyotik sağlamaya devam edin. Ameliyat sonrası. İdrar kesesini günde iki ila üç kez, hayvanlar iyileşmiş gibi göründükten sonra bile mesane fonksiyonunun tutarlı bir şekilde iyileşmesi görülene kadar sıkın.

Ameliyat edilen hayvanları nörolojik eksiklikler ve fizyolojik durum açısından gözlemlediğinizden emin olun. Enjeksiyon, omurilik yaralanmasından 14 gün sonra yapılır. Ameliyata başlamadan önce, SAP'leri steril suda hacim başına% 1 ağırlıkta hazırlayın ve bir Hamilton şırıngasına bağlı 100 mikrometrelik bir cam kılcal doldurun.

Çözelti ile Hamilton şırıngasını stereotaksik çerçeveye takın. Anestezi uygulandıktan sonra, sıçan kafayı stereotaksik çerçeveye yapıştırır ve ameliyat bölgesini povidon iyot ve% 70 alkol ile dezenfekte eder. Daha önce olduğu gibi, bir kez daha, cildi açtıktan sonra, vertebral kas çiftini dikkatlice inceleyin ve ekartörleri yerleştirin.

Yara dokusunu duradan çıkarmak ve lezyon bölgesini yeniden ortaya çıkarmak için 15 numaralı bir neşter kullanın. Ardından durayı dikkatlice açmak için keskin bir iğnenin ucunu kullanın. Son olarak, stereotaktik olarak, cam kılcal damarı travmatize omuriliğe iki milimetre derinliğe yerleştirin ve SAP'leri enjekte edin.

SAP'leri enjekte ettikten sonra, enjekte edilen çözeltiyi yerleştirmek için doku gerilmesine izin vermek için kılcal damarın çıkarılmadan önce bir dakika boyunca enjeksiyon bölgesinde kalmasına izin verin. Ardından enjeksiyonu bir sonraki bölgede tekrarlayın. Burada, NPC'ler, yetişkin bir DS kırmızı faresinin paraventriküler bölgesinden izole edildi ve daha önce yayınlanmış prosedürlere göre yetiştirildi.

Mikro enjeksiyondan hemen önce, NPC'leri büyüme ortamında, hücre nakli için mikrolitre başına 50 kez 10 ila üçüncü canlı hücre konsantrasyonuna seyreltin ve bir Hamilton şırıngasındaki bir cam kılcal damara yükleyin. NPC'ler, SAP'lerin enjeksiyonundan hemen sonra enjekte edilir. Bunu yapmak için, Hamilton şırıngasının cam kılcal damarını yaralanma bölgesinin 0,2 milimetrelik bir rostraline ve omuriliğin sırt yüzeyinin 1,5 milimetre altına yerleştirin.

Dakikada yaklaşık 0,5 mikrolitre oranında iki mikrolitre hücre süspansiyonu enjekte edin. İlk enjeksiyon tamamlandıktan sonra, kılcal damarın daha önce olduğu gibi bir dakika omurilikte kalmasına izin verin, ardından kılcal damarı geri çekin, bitişik bir bölgeye taşıyın ve enjeksiyon prosedürünü tekrarlayın. Bir dakika bekledikten sonra, daha önce olduğu gibi, kılcal damarı geri çekin ve iki milimetre boyunca yaralanma bölgesine doğru hareket ettirin.

Bu konumda iki adet iki mikrolitrelik enjeksiyon yapın. Bu görüntü, omurilik yaralanmasına göre tüm enjeksiyon bölgelerini göstermektedir. Büyüme faktörü desteği için subdural mini ozmotik pompaların implantasyonu, NPC enjeksiyonlarından hemen sonra gerçekleştirilir.

İlk önce bir implantasyon bölgesi seçin. Tercih edilen bölgeler, pompanın kendisinin neden olduğu rahatsızlığı önlemek için torakoabdominal bölgenin yan yanlarıdır. Bölgeyi dezenfekte ettikten sonra, daha önce olduğu gibi, pompa için deri altı bir girinti hazırlanır.

Daha sonra, omurilik yaralanmasına bitişik üst veya alt omurların atlama laminektomisini gerçekleştirin. Burada, omurilik yaralanması C yedi T bir'de yapıldı ve bu nedenle laminektomi C beş'te yapıldı. Şimdi pompayı deri altı girintisine yerleştirin, ardından kateteri gerekli uzunlukta kesin ve son olarak omur kası çiftine sabitlemek için 6.0 dikiş kullanın.

Herhangi bir hareketle ilişkili çıkıktan kaçınmak. Laminektominin altındaki durayı açmak için keskin bir iğnenin ucunu kullanın. Daha sonra kateteri subdural boşluğa yerleştirin ve direnç göstermeden ve kordonu yaralamadan bir coddle yönünde kaymasına izin verin.

Şimdi, kateterin düzgün çalıştığını ve burada gösterildiği gibi herhangi bir bükülme veya kıvrım olmadığını kontrol edin. Daha sonra dikişler veya klipsler kullanarak kasları katman katman kapatın ve ardından cildi kapatın. Yara düzgün bir şekilde kapatıldıktan sonra, anesteziyi durdurun ve uyanırken hayvanı gözlemleyin.

Hayvan sternal yaslanma için yeterli bilinci yeniden kazandıktan sonra, fareyi temiz bir kafese koyun. Hayvanın izlenmesi ve cerrahi sonrası analjezi dahil olmak üzere tüm ameliyat sonrası tedavi prosedürlerini uyguladığınızdan emin olun. İmmünsüpresyon tedavisini NPC enjeksiyonundan iki gün önce ve transplantasyondan yedi gün sonrasına kadar ve kurban edilene kadar uygulayın.

Bu floresan mikroskobu görüntüsü, bir sıçanın travmatize edilmiş omuriliğinin uzunlamasına bir bölümünü göstermektedir. Boyama, QL altı ile etiketlenmiş DPI floresan SAP'lerdir. Fite yeşil görünür ve lezyonun merkez üssünde toplanmıştır.

Enjekte edilen DS kırmızı pozitif NPC'ler, kırmızı floresan ile gösterilen rostral ve coddle yönlerinde yayılmıştır. Ölçek çubuğu beş milimetreyi temsil eder. Burada bir taramalı elektron mikroskobu görüntüsü, birleştirilmiş SAP'lerin nanofiber iskele oluşumunu göstermektedir.

Ölçek çubuğu bir mikrometreyi temsil eder. Bu videoyu izledikten sonra, klip sıkıştırma, SCI ile ilgili cerrahi prosedürleri ve SAP'ler ve NPC'lerle kombine tedavinin umut verici yaklaşımının bu modelde nasıl incelenebileceğini iyi anlamalısınız.