Kerevit ve yüzgeç Sistemi: Sinir Kordon ve Motorlu Pattern Extracellular Recordings ve Diseksiyon için Pratik Kılavuzu

Bu prosedürün genel amacı, elektrofizyolojik çalışmalarda kullanmak için abdominal sinir kordonunu kerevitten ayırmaktır. Bu, önce kerevitin uyuşturulmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, kerevitin ventral plakasını izole etmek için brüt bir diseksiyon yapılır.

Daha sonra merkezi sinir sistemini raik gangliyonlardan abdominal gangliyonlara tamamen izole etmek için ince bir diseksiyon yapılır. Altı. Son olarak, elektrofizyolojik deneyleri kolaylaştırmak için ganglion kılıfı tüm gangliyonlardan çıkarılır.

Sonuçta, abdominal ganglion zinciri ekstra veya hücre içi kayıtlar için kullanılır. Merkezi örüntü üreteçlerinin koordinasyonunu incelemek veya tanımlanmış nöronların morfolojisini ve sinaptik bağlamını araştırmak. Bu yöntem, izole sinir sistemindeki kurgusal FLA kargaşasını kaydedebilmek veya abdominal gangliyonların veya belirli nöronların morfolojisini karakterize edebilmek için sinir ağı işlevi üzerinde uygulamalı deneyim sağlamak gibi sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu yöntem kerevitlerin yüzme oranı sistemi hakkında fikir verebilir. Kerevitlerde kuyruk çevirme davranışını yönlendiren nöronal bir ağ gibi diğer sistemlere de uygulanabilir: Kerevit ile çalışmak, Pacific Stacia, Linea, Guus. Bir hayvanı metin protokolüne göre uyuşturduktan sonra, ventral tarafı yukarı kaldırın ve her iki pençeyi de göğüs kafesine yakın tabanlarından kesmek için güçlü bir makas kullanın.

Ardından sol ve sağ euro bölmelerini çıkarın. Pençe açıklığından perfüze etmek için soğuk salin kullanmadan önce hayvanın ventral tarafı yukarı bakacak şekilde siyah sard ile kaplı bir diseksiyon kabına yerleştirin. Ardından, kerevit balığının gözlerinin hemen arkasında tek bir enine kesim yapmak için güçlü bir makas kullanın ve kafasını çıkarın.

Ardından, karnı son torasik segmentlerle birlikte toraksın geri kalanından izole etmek için taban eklemlerinin yakınındaki tüm yürüme bacaklarını çıkarın. Makasın ucunu ikinci yürüme bacağının açıklığına sokun ve karşı tarafa kesin. Kesiği göğüs kafesinden her iki tarafa uzattıktan ve metin protokolünde anlatıldığı gibi bazı iç organları açığa çıkardıktan sonra, göğüs kafesinin ön kısmını çıkarın.

Şimdi iç organları çıkarın ve hayvanı soğuk tuzlu suyla durulayın. Diseksiyona, sternal plakanın tüm uzunluğu boyunca lumon ve yüzücü sıçanlar arasında maksimum yanal pozisyonda bir kesi ile devam edin. Aynı kesimi diğer tarafta da yapın.

Kerevit balığının karın tarafı ventral tarafı yukarı bakacak şekilde diseksiyon kabına yerleştirin. Numuneyi arkaya, tellson'a ve anterior olarak karabaz kalıntılarına sabitlemek için böcek pimleri kullanın. Çanağı, numuneyi kaplayacak şekilde kerevit tuzlu su ile doldurun.

Yürüyen bir bacak açıklığından tutmak için sol elinizde kaba forseps kullanın ve numuneyi çekerek açın. Büyük iki dorsal fleksör kas zincirini tanımlayın. Onları sabitleyin ve ventral tabanlarını ve sternal arteri kesin.

İlk abdominal gangliyonları A'yı ve ilişkili sinirleri N, bir, N, iki'yi ortaya çıkarın. Şimdi ikinci karın segmentine geçiyoruz. Ventral tabana yakın kas ipliklerinin temelini çıkarın.

Abdominal ganglion A iki, ilişkili sinirler N bir, N iki ve N üç ile şimdi görülebilir. Sinir kordonundan en uzak pozisyonda N üç sinirini kesin. Abdominal gangliyonları olan sonraki üç abdominal segment için bu adımları tekrarlayın.

Üçe beş. Abdominal gangliona ulaşırken, altı. Sternal plakayı altılı bir sinirin arkasına doğru kesin.

Ventral kısmı tutun ve sabitleyin. Mikroskop altında tuzlu su ile doldurulmuş tabakta sırt tarafı yukarı. Sefalon torasik kıç tarafının en ön kısımlarını çıkarmak için forseps kullanın.

Sonra kalan dış iskelet yapıları arasındaki kasları kesin. Ventral sinir kordonunun ön ucunu dikkatlice kaldırdıktan sonra, torasik sinirleri yanal olarak kesin. Bir'e odaklanın ve birin N ve N iki sinirlerini sabitlemek için en fazla bir santimetre uzunluğunda kesin.

Ardından, A ikiye geçin ve bu segmentin N bir, N iki ve N üç sinirlerini tanımlayın. Abdominal gangliyonların birinde sinirler, iki ila beş. Her segmentteki kıvrımlarda iki sternal kütiküler arasında bulunur ve kas sistemi ile kaplıdır.

Daha sonra karnın yan kenarından başlayarak, posterior sternal kütiküler kıvrım boyunca bir kesi yapın ve metin protokolüne göre N'yi ortaya çıkardıktan sonra orta hatta doğru ilerleyin. Gerekirse, siniri mümkün olduğunca distal olarak kesin. Karşı tarafa ilerleyin ve N sinirini ganglionun yakınındaki orta hattan izole etmeye başlayın, posterior sternal kütiküler sargı boyunca keserek lateral kenara doğru ilerleyin.

Şimdi bu ganglionun iki sinirini iğnelemek için uygun bir uzunlukta kesin. Ardından abdominal gangliyonlar için gösterilen adımları tekrarlayın. Mümkün olduğunca distal olarak üç ila beş için bir iki.

Ganglionun sinirlerini altı kesin. Ganglionu kaldırmak ve ganglion zincirini sternal plakadan izole etmeye başlamak için altılı birden fazla siniri tutmak için forseps kullanın. Sinir kordonunu tamamen izole ettikten sonra, ganglion zincirini şeffaf eşik koruması ile kaplı bir petri kabına aktarın ve hafif bir streç dokunuş uygularken paslanmaz çelik telden kesilmiş küçük pimler kullanarak tuzlu su ile doldurun.

Ganglion zincirini, sinir kordonu sırt tarafı yukarı gelecek şekilde düz bir çizgide sabitleyin. Sadece son iki torasik gangliyonu tutun ve torasik sinirleri yana doğru sabitleyin. Birinin sinirlerini, sinir kordonuna göre 90 derecelik bir açıyla sabitleyin.

Daha sonra ikiye ilerleyin ve sinirleri N iki, sinir kordonuna göre 35 ila 45 derecelik bir açıyla sabitleyin. N bir sinirler metin protokolüne göre ayrılıp sabitlendikten sonra, N sinirinin ön dalını sinir kordonuna 90 derecelik bir açıyla sabitleyin. Daha sonra N sinirinin arka dalını, bir ön N bir dal ile sinir N iki arasına sabitleyin.

Tüm abdominal gangliyonların kılıfına çıkarılması gerektiğinden, ganglionun arkasındaki ganglion kılıfından ve N iki ve N üç sinirleri arasında küçük bir yanal kesi yapmak için ince yaylı makas kullanın. Bağın üzerindeki kılıf boyunca enlemesine kesin. Ardından, kılıfı çıkarmadan önce ganglionun yan sınırları boyunca kesmeye devam edin.

Gerekirse, hücre dışı kayıtları gerçekleştirmek için kılıfı kaldırmak için ince forseps kullanın. Metin protokolünde listelenen aletlerin ve reaktiflerin kurulumunu takiben, ganglion zincirini mikroskop tablasına yerleştirin ve aşağıdan aydınlatın. Kayıt elektrodunu hedef sinire yakın sil korumasına ve referans elektrodu gangliyonlara yakın ancak lateral bir konuma yerleştirin.

Ardından hedef siniri kaydın etrafında bükün. Siniri gerdikten ve sabitledikten sonra, hedef siniri banyo solüsyonundan izole etmek için vazelin ile doldurulmuş bir şırınga ve yuvarlak uçlu 20 gauge bir iğne kullanın. Aktivitesinin kaydedilmesi gereken tüm sinirler için bunu tekrarlayın.

Son olarak, burada gösterildiği gibi kayda başlayın, ipsilateral PS iki ila PS beş motor nöronlarının hücre dışı PS aktivitesi, beşte bir PS patlaması ile başlar ve uyarma dalgası ön yönde yayılır. Ek olarak, her segmentte bir patlamanın başlangıcından bir sonraki patlamanın başlangıcına kadar ölçülen süre sabit kalır ve ritim periyotlarının ve patlamanın periyodu olarak tanımlanır. Süreler farklı hazırlıklar arasında değişebilir, ancak segmentler arasındaki faz gecikmesi, ritmin frekansından bağımsız olarak döngünün yaklaşık dörtte birinde sabit kalır.

Bu koordinasyon modelleri en iyi burada görülen faz histogramlarında görülebilir. Burada keskin mikro elektrotlar kullanılarak, Ps.Motor nöronlarının dendritlerinden elde edilen hücre içi kayıtlar, aynı hemi ganglionunun tüm PS motor nöronlarının hücre dışı olarak kaydedilen aktivitesi ile bireysel nöronların enfaz salınımlarını gösterir. Hücre içi olarak kaydedilen nöronları tanımlamak için, hücreler keskin mikro elektrotlar ve iyontoforez kullanılarak doldurulabilir.

Bu şekilde, iki di dolu PS motor nöronunun ventral sodası, N sinirinin tabanının arkasına yerleştirilmiştir. Birincil nörit anterior olarak çıkıntı yapar ve lateral nöro hap içinde dallanır. Akson, N bir sinirinin arka dalından kas sistemine uzanır.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 45 dakika ila bir saat arasında yapılabilir. Bu prosedürü denerken, sinir dokusunu sağlıklı tutmak için salini düzenli aralıklarla değiştirmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, hücresel koordinasyon mekanizmasını analiz etmek, iyonik akımları ölçmek veya nöromodülatörlerin belirli hücrelerin ritmik aktivitesi üzerindeki etkisini incelemek gibi ek soruları yanıtlamak için motor nöronların veya nöronlar arası nöronların hücre içi kaydı gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.