Name: A Novel In vitro İnsan Tüm Kan ve Endotelyumunun Arasındaki Etkileşimler incelenmesi için Model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Keşfedin, kan-endotelyal hücre etkileşimlerini incelemek için yeni bir in vitro model. Bu yöntem, trombin-antitrombin kompleks oluşumunu ve TNF-alfa'nın lökosit rekrütmanına etkisini değerlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma n 602.699 (DIREKT) ° hibe sözleşmesi kapsamında İsveç Araştırma Konseyi (90.293.501, A0290401, A0290402), Avrupa Topluluğu Yedinci Çerçeve Programı hibe tarafından desteklenen, Novo Nordisk Vakfı, Gurli ve Edward Brunnberg Vakfı, Tedavi, Vleugel Kök Vakıf ve Åke Wiberg Vakfı.

NOT: Kan Uppsala Etik Değerlendirme Kurulu (Izin sayılı 2008/264) ile onayı açık sistem Venipunktür sağlıklı bireylerden çizildi. 1. Tohum Hücreler <ol><li> T75 şişeleri içinde% 5 37 ° C&#39;de CO2 ile kültür primer insan göbek damar endotelial hücreleri (HUVEC), PBS pH 7.4 içinde% 1 jelatin ile kaplanan. </li><li> T75 HUVEC ihtiva eden bir şişeye (ya da primer insan endotelyal hücreleri bir türden) kültür ortamı çıkarın ve PBS pH 7.4 içinde 2.1 mM EDTA ile hücrelerin yıkayın. 37 ° C, 3 dakika - 1 mi,% 0.25 tripsin-EDTA ekleyerek ve 2 inkübe edilerek hücreleri ayırın. </li><li> PBS pH 7.4 içinde 9 ml% 10 FBS ile balon durulanarak hücrelerini toplamak ve 15 ml&#39;lik bir tüp hücre süspansiyonu aktarın. 5 dakika boyunca 735 xg&#39;de hücreleri aşağı doğru döndürün. </li><li> Süpernatantı ve endotel hücre büyüme ortamı mikrovasküler (AT GMMV) dikkatli bir hücre pelletini tekrar süspansiyon ve bir Bürker bölmesi içinde hücreleri sayın. 21,000 c Seedarşın / 1-kuyulu hücre kültürü slaytlar cm2 ve 37 ° C&#39;de inkübe edin. Kültür - 2 gün HUVEC sonra 1 birleştirilebilmeli olacaktır. Bir ışık mikroskobu altında hücre morfolojisi ve kaynaşma gazetesine izleyin. </li></ol> Tüm Kan 2. Hazırlık <ol><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak hareketsizleştirilen heparin (CHS) içindeki bir çift tabaka ile kan ile temas halinde olan tüm yapay yüzeylerin hazırlayın. Tozdan, CHS Kaplanmış malzemeler fonksiyon kaybı olmaksızın 6 aya kadar oda sıcaklığında saklanabilir. </li><li> Kan endotel odası deneye başlamadan önce kısa bir süre sağlıklı bir donörden (&lt;30 dakika) kan çekmek için açık sistem Damara kullanın. Dikkatli bir CHS kaplı 50 ml tüp kan toplama önce: (2 mm iç çap) çift bir derialtı iğne CHS kaplamalı silikon tüp için (18 G 50 mm x). Fraksiyonlanmamış heparin ile Ek kan 0.75 IU / ml&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek üzere. Inve yavaşça kan karıştırın- 3 kez tüpü 2 rting. </li></ol> 3. Kan Endotel Odası Modeli <ol><li> PMMA slayt (25 x 75 mm) &#39;ye yapıştırılmıştır iki silindir (yükseklik 8 mm çapı 9 mm)&#39; den oluşan akrilik polimetil metakrilat (PMMA) &#39;de, kan bölmeyi (üstten bakış Şekil 1A) imal. Kültürlü endotel hücreleri (Şekil 1B) ile cam slaytlar karşı kan odası mühür kauçuk O-halkaları ile yukarı bakacak silindir kenarlarına uyacak. Daha sonra dikey bir pozisyonda (Şekil 1C), endotel hücreleri ile kültür sürgüye bağlı olan, kan odaları döndürün. </li><li> Kan etkinleştirmek için değil kamara alarak dikkat kaplı her CHS içine 1.5 ml kan aktarmak için bir CHS kaplı pipet kullanın. </li><li> MK ul 0,34 3 EDTA 30 ihtiva eden bir mikrosantrifüj tüplerine transfer 1 ml kan kullanılarak yapılan ilk plazma protein konsantrasyonlarının belirlenmesi için, 10 mM K 3 EDTA bir son konsantrasyon elde etmek üzerebir enzim immün testi (ELISA). Dikkatle kan karıştırın ve buz üzerinde tüpler tutmak. </li><li> PBS pH 7.4 içinde Hücreleri yıkamak dikkatli bir şekilde, üretici talimatlarına uygun olarak hücre kültürü cam slaytların plastik duvarlar çıkarın ve. Sonradan slaytlar mümkün olduğunca çok sıvı çıkarmak için emin olun. Hücreler kurumasına izin vermeyin. </li><li> Kan bakan hücreleri ile kan bölmelerin üzerine slayt yerleştirin. Kan endotel hücre odasının etrafında bir kelepçe koyarak slayt sabitleyin. Kelepçenin yerleştirirken hücre kültürü cam slayt kırılmasını önlemek için ek destek için plastik bir slayt kullanın. </li><li> Bir 37 ° C su banyosu içinde dönen bir tekerlek üzerinde, kan endotel hücre bölme saptamak (40 cm çapında), bir yer. 30 dakika boyunca 0.5 xg&#39;de tekerleğin her odasına döndürün. </li><li> İnkübasyondan sonra, kan endotel hücre bölme ortadan kaldırmak. F PBS pH 7.4 &#39;da hücre kültürü slaytlar yıkayıp (PFA), buz gibi soğuk% 1 paraformaldehid içinde hücrelerin tespit edilmeleriya da 10 dakika. | Il 0.34 MK 3 EDTA 30 ihtiva mikrosantrifüj tüplerine her bölmeden transfer 1 ml kan, 10 mM K 3 EDTA bir nihai konsantrasyona ulaşmak ve Tüpleri yavaşça karıştırın. Buz üzerinde tüpler tutun. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 4560 x g&#39;de tüpler santrifüjleyin. Daha fazla analiz edilinceye kadar -70 ° C&#39;de yeni bir mikrosantrifüj tüpleri ve saklamak için kan plazması aktarın. </li></ol> Kan Endotel Etkileşimleri 4. Analizi <ol><li> İkinci keçi anti-fare Alexa 488 ve falloidin-TexasRed ardından fare anti-insan CD16 ile immünofloresan boyama yapın. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile, her boyama adımı gerçekleştirmek ve her adım arasında PBS pH 7.4 slaytlar yıkayın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca DAPI ile çekirdek Counterstain. Görüntü analizi gibi CellProfiler gibi uygun resim analiz yazılımı kullanılarak kombinasyon halinde floresan mikroskobu altında endotel hücrelerine bağlı kan bileşiklerinin analiz edin. </li><li> QuantiFY plazma numunelerinin üreticinin talimatlarına göre trombin antitrombin (TAT) ELISA ile, kan bölmesine reaksiyonları. </li><li> Uygun istatistiksel araçlar, örneğin kullanın., Eşleşmemiş bir t testi, verileri analiz etmek. </li></ol>

<ol><li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+Mice+and+Not+Men%3A+Differences+between+Mouse+and+Human+Immunology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology.</a> J Immunol. 172 (2), 2731-2738 (2004).</li>
<li>Seok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+responses+in+mouse+models+poorly+mimic+human+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).</li>
<li>Hong, J., Ekdahl, K. N., Reynolds, H., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vitro+model+to+study+interaction+between+whole+blood+and+biomaterials.+Studies+of+platelet+and+coagulation+activation+acid+the+effect+of+aspirin%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A new in vitro model to study interaction between whole blood and biomaterials. Studies of platelet and coagulation activation acid the effect of aspirin.</a> Biomaterials. 20 (7), 603-611 (1999).</li>
<li>Doctor, A., Spinella, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Processing+and+Storage+on+Red+Blood+Cell+Function+In%5BTitle%5D)+AND+%22Vivo.+Semin+Perinatol%22%5BJournal%5D)">Effect of Processing and Storage on Red Blood Cell Function In.</a> Vivo. Semin Perinatol. 36 (4), 248-259 (2012).</li>
<li>Andersson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+heparin+surface+concentration+and+antithrombin+binding+capacity+as+evaluated+with+human+non-anticoagulated+blood+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Optimal heparin surface concentration and antithrombin binding capacity as evaluated with human non-anticoagulated blood in vitro.</a> J Biomed Mater Res A. 67 (2), 458-466 (2003).</li>
<li>Ekdahl, K. N., Hong, J., Hamad, O. A., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+blood+compatibility+of+materials%2C+cells%2C+and+tissues%3A+basic+concepts%2C+test+models%2C+and+practical+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the blood compatibility of materials, cells, and tissues: basic concepts, test models, and practical guidelines.</a> Adv Exp Med Biol. 735, 257-270 (2013).</li>
<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+dynamics+of+the+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal dynamics of the endothelium.</a> J Thromb Haemost. 3 (7), 1392-1406 (2005).</li>
<li>Cines, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+in+physiology+and+in+the+pathophysiology+of+vascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders.</a> Blood. 91 (10), 3527-3561 (1998).</li>
<li>Kirchhofer, D., Tschopp, T. B., Hadvary, P., Baumgartner, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+stimulated+with+tumor+necrosis+factor-alpha+express+varying+amounts+of+tissue+factor+resulting+in+inhomogenous+fibrin+deposition+in+a+native+blood+flow+system.+Effects+of+thrombin+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells stimulated with tumor necrosis factor-alpha express varying amounts of tissue factor resulting in inhomogenous fibrin deposition in a native blood flow system. Effects of thrombin inhibitors.</a> J Clin Invest. (5), 2073-2083 (1994).</li>
<li>Esmon, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+circuits+in+thrombosis+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Molecular circuits in thrombosis and inflammation.</a> Thromb Haemost. 109 (3), 416-420 (2013).</li>
<li>Rosenberg, R. D., Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular-Bed%E2%80%93Specific+Hemostasis+and+Hypercoagulable+States%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Vascular-Bed–Specific Hemostasis and Hypercoagulable States.</a> N Engl J Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

<html> Kan ve damar duvarı arasında çok sayıda etkileşim nedeniyle normalde endotelyumun yapıştırıcı olmayan ve anti-trombotik yapılı bir hareketsiz bir halde muhafaza edilmektedir. 7 iltihabı kapsayan patolojik durumlar esnasında, endotel yapışma reseptör ifadesi 8&#39;de ortaya çıkan bir artış ile aktive edilir ve Bir yeteneği azalır inhibe hemostaz. sırayla kan kaskad sistemlerin 9 aktivasyonu daha tromboz ve lökosit neden endotel trombojenisiteyi güçlendirir. 10 endotelyal hücreler ve tam kandan arasındaki bu hassas etkileşimleri daha iyi bir anlayış kazanmak için, biz var kültürlenmiş endotel hücreleri, tam kan ile temas içinde yerleştirilir bir in vitro yöntem roman geliştirdi. Bildiğimiz kadarıyla, bizim kurulum daha uzun süreler için hiçbir ile tam insan kanı ya da çok az antikoagülan ile kuluçkaya endotel hücreleri göstermek için ilk. nt &quot;&gt; Bu sistemin duyarlılığı kan ile temas halinde yerleştirilen tüm yüzeyler üzerinde immobilize heparin koruyucu bir tabaka ile kombinasyon halinde açık sistem delme ile etkinleştirilir., kan tedarik esnasında açık bir sistem kullanılması damar delinerek sırasında kademeli sistemlerinin aktivasyonu azaltır pıhtılaşma önleyici bir kendi kendine belirlenmiş bir miktarının kullanımına olanak iken. Ticari olarak temin edilebilen boşaltılmış kan tüplerinden Bununla birlikte, araştırmanın amaçlanan nihai noktalara bağlı olarak kullanılabilmektedir. piyasada bulunan kapalı bir sistem tüplere ilave antikoagülan nihai konsantrasyon duyarlı önleyebilir ve aksi sabit kurulumunda, etkileşimini incelemek. 6 koruyucu heparin yüzeyi, bundan başka, endotel hücreleri dışında herhangi bir yüzey ile yüzey teması kanın aktivasyonunu ortadan kaldırır. 5 Gerçekten de, fraksiyonlanmamış heparin, az miktarda ilave edilmiş tüm kanın inkübasyona CHS koruma olmadan oda pıhtı oluşmasına neden oldu. <pSınıf = &quot;jove_content&quot;&gt; hazne içerisindeki hava kabarcığı endotel hücreleri ile inkübasyon sırasında kan karıştırılmasını sağlar. Hava baloncuk büyüklüğünün etkisini değerlendirmek için, iki farklı kan hacmine kullanılır. Bu modelde, HUVEC ile inkübe odalarına bağımsız olarak hava kabarcığı boyutu içindeki TAT seviyeleri ölçüldü. TAT, ancak tam CHS daha küçük bir hava kabarcığı boyutu ile artan odaları muamele edilmiş oldu. Bu, daha önce tarif endotel hücre özellikleri 11 uygun olarak, atıl CHS bölmesi içinde eksik olan endotel hücreleri tarafından sağlanan pıhtılaşmasının artması aktivasyonu üzerine düzenleyici bir etkisi gösterir. Sistemde hava kabarcığı bölmenin dönüş hareketi üzerine bir hava akımı yaratır. Balonun büyüklüğü bu dönen sistem içinde güçleri etkileyecektir. Bu küçük bir kabarcık, kan yani üzerine bir azalma kuvveti temsil eden yüksek TAT değerleri oluşturur Şekil 2B bizim sonuçlarla vardı gösterilir, kan hareketihaznesinin alt ve kaskadlı sistemin böylelikle aktivasyonu daha yüksek bir düzeye kadar ayrılması cereyan içinde. Bu sistemde, bizler, duvarlar ve merkezi düşük boyunca en yüksek hız ile bölmesi üzerinde hız farklı olacak bir döner akış oluşturma olduğu belirtilmelidir. Bu tabii ki endotel hücreleri için akış açısından ve makaslama kuvvetleri ile optimal bir ortam değil, ama yine de biz istikrarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar üreten bir sistem var. Diğer uygun koşullar türbülans olmadığında laminer akış sirkülasyon içerir. Bu, burada gösterilen modelde, ancak, mümkün değildir, bizim bilgimize göre, böyle bir sistem Şu an için mevcut değildir. , Sisteme eklenen antikoagülan için hiç veya düşük seviyeleri ile tam kan ile birleştirmek mümkün olmayan çok sayıda mikro-akışkan sistemleri piyasada mevcut olmasına rağmen bu şekilde, kan ve endotelyal hücrelerde bulunan tüm bileşenler arasındaki etkileşimlerin uygun hassas değerlendirilmesine olanak başarısız. Ayrıca, TNFa, bağımsız bir kan hacminin TAT&#39;ın bir kat oluşumu ile birlikte, HUVEC aktive yönelik kan hücrelerinin işe bir 2-kat daha yüksek olmuştur. Bu model sisteminin stabilitesini doğrular ve ayrıca, bütün kandan ile kombinasyon halinde bir aktive endoteli kullanma olasılığını göstermektedir. Kan endotel hücre bölmesi çeşitli koşullar ve aktivasyon safhaları altında hücreleri üzerinde ifade edilen markerler arasında çeşitli aktive edilmiş endotel hücrelerine karşı daha fazla kan hücre alımını incelemek için kullanılabilir Gelecekteki. Model ayrıca iltihaplı durumların üzerindeki etkileri değerlendirmek için yapılan farmakolojik maddeler ile kombinasyon halinde kullanılabilmektedir. Özetle, biz vasküler hastalık ilgili araştırmalar yapmaya vitro sistemde tam bir beşer yaratacağım insan kanı ve damar hücreleri ile bir odası modeli birleştirerek büyük fayda göstermektedir.

Kardiyovasküler hastalık kan-damar etkileşimlerini analiz yöntemleri genel hayvan araştırma deneyleri içeren. Deneysel araştırmalar hayvan modellerinde oluşturulur Bununla birlikte, sonuçlar. Insan hastalıkları için çok az veya hiç bir etkisi vardır, 1,2 olabilir, kan bölmesi ve vasküler endotel hücrelerinde arasındaki hücresel etkileşimlerini incelemek üzere in vitro modellerde iyi ve güvenli bir ihtiyaç vardır Bir insan gibi sistem. Bu nedenle bir kan endotel hücre odası modelini kurduk. Bu biyomalzeme ve insan bütün kan arasındaki etkileşimi araştırmak için kullanılan daha önce tarif edilen modeline dayanır., Genellikle saflaştırılmış bileşenler, sınırlı sayıda diğer in vitro kurulumları 3 aksine örneğin, trombositler, lökositler ya da endotel hücrelerinde mevcuttur, bu model, tüm kapsar Bileşenler, bir kan damarı içinde mevcut. Kan endotel c kurulumuell odası modeli çok az veya hiç katma antikoagülan ile taze çekilmiş insan kanının kullanımını sağlamak için tasarlanmıştır. Uzun süreler boyunca depolanan kan yüzden eritrositlerin parçalanması kan ve endotel hücreleri arasındaki hassas etkileşim engel olabilir depolama lezyonlar olarak adlandırılan edinirler. 4 Ex vivo olarak bütün kanın kullanımı sırasında, pıhtı oluşumunu önlemek için antikoagülan veya kan ile temas halinde olan tüm madde olmayan aktive olması yüksek dozlar istenmektedir. Olmayan yüzey aktivasyonu laboratuar ortamında nadir olduğu için, malzeme seçenek olarak hareketsiz heparin bir koruyucu tabaka ile donatılmış olabilir. Hareketsizleştirilmiş heparin Koruyucu bir kat, kan iletişim Pıhtılaşma şelalesinin aktivasyonu neden olmaksızın ortaya çıkan bir yüzey oluşturarak çok malzeme tatbik edilebilir (buradan sonra Corline heparin yüzey (CHS) olarak anılacaktır). 5 Bu durumda, olan kabinleri mobilya tarafından CHS, kan endotel ceII haznesi modeli kan antikoagulan çok düşük konsantrasyonlarda kullanılmasını sağlar. Kan endotel odası modelinde antikoagülan yüksek konsantrasyonlarda ilave kaçınmak aksi maskelenebilir olabilecek bir kan damarının içindeki hassas etkileşimler üzerinde çalışmak mümkün kılar. 6 Plastik mikroskop lamı:;: (9 mm yarıçapı 8 mm yüksekliği) kan endotel hücre odası modeli plastik silindirler bağlanmasıyla oluşturulan iki odadan oluşmaktadır. Silindirlerin üzerinde yukarı bakacak şekilde kenarları hücre kültürü lâm odacıkları kapatılması için kullanılan lastik O-halkası ile donatılmıştır oluklar ile donatılmıştır. Bölmeler, yalnızca kısmen bölmeler daha sonra dik bir konumda (Şekil 1) döndürüldüğü zaman bölme içinde kalan bir hava hareketinin içine kan tutar olarak kan ile doldurulur. Modelin işlevselliğini değerlendirebilmek için, biz ya da tamamen CHS, kaplanmış olan deneyler yaptıkodası veya İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücreleri (HUVEC). İki ayrı kan hacmi deneye tabi tutuldu ve trombin antitrombin (TAT) komplekslerinin (pıhtılaşmasının dolaylı bir göstergesi) oluşumu enzim bağlantılı immunosorbent tahlil (ELISA) ile ölçüldü. Daha sonra kan miktarı ve tümör nekroz faktörü (TNFa), resim analizi ile lökosit göçünün endotel hücrelerini stimüle etkisini değerlendirmiştir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52112/52112fig1highres.jpg"> Kan endotel hücre odası modeli 1. Setup Şekil. (A), en iyi PMMA yapılan kan odasının şematik bir çizimi görüntülemek. (B): Primer insan endotel hücreleri, 1-çukurlu oda slaytlar üzerinde kültürlenmiştir. Taze, insan bütün kan, bir mikroskop lamı üzerine iki bölme eklenir. Kan işlemek için kullanılan odaları ve tüm malzeme koruyucu HS kaplama ile tedavi edilir. Ce duvarlarını çıkardıktan sonrall kültür slayt, hücreler kana karşı karşıya yerleştirilir ve sistemin kapalı kenetlenir. (C) Kan endotel hücre bölmeler daha sonra 37 ° C olarak dönme altında inkübe edilir. Daha sonra, kan bölmesine reaksiyonlar ELISA ile analiz edilebilir ve endotel hücreleri mikroskopi ile analiz edilebilir.

<table><tbody><tr><td>İnsan Umbilikan Ven Endotel Hücreleri (HUVEC)</td><td>PromoCell</td><td>C-12200</td><td>Başka herhangi bir birincil insan endotel hücresi türü kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Endotel Hücre Büyüme Ortamı MV (ECGM MV)</td><td>PromoCell</td><td>C-22120</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-2500</td><td>PBS'de% 1 jelatin hazırlayın, bir T75'te 5 ml'yi 15 dakika inkübe edin ve hücreleri kültürlemeden önce çıkarın.</td></tr><tr><td>TAT ELISA</td><td>Enzim Araştırma Laboratuvarı</td><td>TAT-EIA-C</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-insan CD16</td><td>DAKO</td><td>F7011</td><td>Seyreltme 1:100</td></tr><tr><td>Keçi anti-fare Alexa 488</td><td>Moleküler Problar</td><td>A11001</td><td>Seyreltme 1:500</td></tr><tr><td>Phalloidin-Texas Kırmızı</td><td>Moleküler Problar</td><td>A22287</td><td>Seyreltme 1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Moleküler Problar</td><td>D1306</td><td>Seyreltme 10 & mu; g/ml</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-6758</td><td></td></tr><tr><td>%0.25 Tripsin-EDTA</td><td>Gibco Yaşam Teknolojileri</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>1 kuyulu hücre kültürü slaytları</td><td>BD Falcon</td><td>354101</td><td></td></tr><tr><td>Kan Odaları</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Kan Odası, PMMA'da veya mümkün olan herhangi bir plastikte üretilebilir. bağlamak CHS</td></tr><tr><td>Kelepçeleri</td><td>Ofis Deposu</td><td>2052204</td><td></td></tr><tr><td>Corline Heparin Yüzey (CHS)</td><td>Corline Sistemleri AB</td><td>945-00</td><td></td></tr><tr><td>Hipodermik iğne</td><td>Terumo</td><td>NN-1850R</td><td>Boyut: 18 G x 5 mm</td></tr><tr><td>Fraksiyone Olmayan Heparin (UFH)</td><td>Leo Pharma</td><td>585679</td><td></td></tr><tr><td>K3EDTA</td><td>Alfa Aesar</td><td>1709958</td><td>miliQ H2O cinsinden 0,34 M'lik bir stok çözeltisi hazırlayın</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6148</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>80i</td><td></td></tr><tr><td>Işık mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü analiz yazılımı</td><td>Broad Institute</td><td>CellProfiler</td><td>www.cellprofiler.org'da ücretsiz olarak mevcuttur</td></tr></tbody></table>

a novel in vitro İnsan tüm kan ve endotelyumunun arasındaki etkileşimler incelenmesi için model

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

Tüm bilinen hastalıkların çoğunluğu kalp-damar sistemi bozukluklarının eşlik eder. Kalp-damar hastalıklarının sırasında aktif etkileşim yollarının karmaşıklığı çalışmalar, sağlam ve fizyolojik olarak ilgili yöntemler eksikliği ile sınırlıdır. Patolojik vasküler olayları modellemek için biz endotel ve bütün kan arasındaki etkileşimi incelemek için in vitro bir analiz geliştirdik. Tahlil, insan tüm kan ile temas halinde yerleştirilir primer insan endotel hücreleri oluşur. Yöntem, bir kan damarı içinde mevcut moleküler ve hücresel bileşenleri arasındaki hassas etkileşimlerin çalışma sağlayan, hiç veya çok az pıhtılaşma önleyici ile natif kan kullanmaktadır. Biz ile ya da insan göbek bağı damarı endotel hücrelerinin (HUVEC) olmadan inkübe farklı kan hacmine göre pıhtılaşma aktivasyonu karşılaştırarak tahlilin özelliğe incelenmiştir. Daha büyük bir kan hacmi katkıda Oysatrombin antitrombin oluşumunda bir artış (TAT) kompleksleri, HUVEC varlığı koagülasyon indirgenmiş aktivasyonunu göstermiştir. HUVEC tümör nekroz faktörü (TNFa) ile uyarıldı ve kan temas sonrası, uyarılmamış hücrelere kıyasla, TNFa uyarılmış hücrelerde anlamlı olarak yüksek olduğu CD16 + hücrelerinin varlığı kurmak için Bundan başka, lökosit eklenme görüntü analizi uygulandı. Sonuç olarak, bu analiz, endotel ve kan bölmesi arasında etkileşimler altüst vasküler patolojiler, çalışma için tatbik edilebilir.

CHS Kaplama Gerekliliği Endotel hücreleri tarafından ortaya kişilerce belirli tam kanda tepkisini ölçmek için, kan endotel hücre bölmesi için kullanılan bütün malzeme kullanım öncesi CHS, bir kaplama ile temin edilmelidir. Şekil 2A, (sol) ve 30 dakika sonra, kaplanmamış odasını göstermektedir açıkça görülebilen bir pıhtı varken kan teması. Öte yandan, CHS ile bölmesi (Şekil 2A, sağ) tedavi edilmesi sonuçları, endotel hücre kan etkileşimler nedeniyle sağlanması, kontrolsüz aktivasyonu kan korur. Odasına Kan Hacminin Etkisi Aktive edilmiş koagülasyon faktörleri arasındaki etkileşim olasılığı artar gibi pıhtılaşma aktivasyonu durgun kan daha büyük ihtimal olması. Kan endotel hücre bölmesi modelinde kan bağlı bölmesi içinde hava kabarcığı dolaşımına hareket tutulur. O daSarf nedenle de hava kabarcığı boyutunu kan hacmindeki değişikliklerin etkisini belirlemek, ve, bir CHS kaplı odası, 1.5 ml veya 30 dakika boyunca 1.75 ml tam kan ile test edildi bir CHS kaplı cam slayt bağlandı. Kan 1.75 ml kan 1.5 mi (Şekil 2B) kullanılması durumuna kıyasla bölmeye eklendiğinde bir hava kabarcığı herhangi bir hareketi olmaksızın kan hacmi 2.5 kat daha büyüktür. Ölçülen TAT değerleri artmış kan hacmi (Şekil 2D) ile TAT-oluşumunu arttırmıştır önerdi. HUVEC (Şekil 2C), bütün haldeki kan, 1.5 veya 1.75 ya ml ile inkübe edildiğinde, herhangi bir fark endotel hücreleri, pıhtılaşmanın aktivasyon (Şekil 2D) etkili olabileceğini düşündürmektedir, iki grup arasında not edilmiştir. Kan Hücresi Elemanların TNFa'nin Etkisi ve pıhtılaşma aktivasyonu Lökosit istihdamına TNFa etkisini incelemek amacıyla, HUVEC tedavi edildi20 ng ed / ml TNFa 4 saat kan teması önce. Kan temas - ya 1.5 ml ya da 1.75 ml kan -, kültür slaytlar, CD16 (Şekil 2F) için boyandı ve bundan sonra, 30 dakika boyunca sürdürüldü görüntülenmiş ve CD16 + hücrelerinin sayısı hesaplandı edildi. CD16 + hücrelerin işe 1.5 ml kan ile 100 256 CD16 + hücre / mm 2 (p &lt;0.0001) ve TNFa tedavisi (Şekil 2E) ile önemli ölçüde artmıştır ve 172 1.75 ml kan ile 378 (P &lt;0.0001). TAT komplekslerin oluşumu ya da TNFa, işlenmiş ve işlenmemiş hücreleri (Şekil 2G) ile inkübe kan ilgili plazma örneklerinde ölçülmüştür. Muamele edilmemiş hücreler ile karşılaştırıldığında, TNFa uyarılmış hücrelerin TAT komplekslerinin yaklaşık iki katına çıkmasına neden oldu. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52112/52112fig2.jpg" width="600"> Incirobilyaları 2: Kan endotel hücre odası modeli İşlevsellik. CHS olan veya olmayan (A), Chambers, tam kan ile inkübe edildi. CHS olmadan, bir pıhtı 30 dakika sonra kuruldu. CHS yokken kuluçkaya kanda trombin antitrombin (TAT) kompleksleri, pıhtılaşma dolaylı işaretleyici, ölçülmesi&gt; 6000 ug / ml idi. (B), kan hacmi, farklı kan miktarı değişecektir, dönen hava kabarcığı hareket muhafaza. Bu 1.75 ml ilavesi ile 0.74 ml artacak ise kan 1.5 ml ilave edilmesiyle, bu hacim, 0.3 ml olacaktır. Konfluent tek tabaka faz kontrast mikroskopisi, tipik olarak endotel hücre morfolojisi önce (C), HUVEC görüntülü farklı kan hacimleri eklendiğinde kan teması. (D) tamamen CHS kaplı odaları için TAT değerleri hafif bir farklılık göstermektedir. 1.5 ml kan ilave 85 sonuçlandı 1.75 ml e ± 11 ug / ml (n = 7) göre 35 ile sonuçlanmıştır77; 70 ug / ml, TAT (s = 8). HUVEC aynı kan hacmi ile kuluçkaya yatırılır, bu fark, artık mevcut değildir; 1.5 ml 66 ± 55 ug / ml (n = 5) ve 66 ± 29 1.75 ml (n = 7), uyarılmamıştır ve TNFa ya da üzerinde CD16 + hücrelerinin sayısı. (D) miktarının belirlenmesi, mevcut sonra HUVECler uyarımlı için ug / ml kan teması. Ya da 1.75 ml (bazal:;: TNFa ya da 1.5 ml (256 ± 121 hücre / aa TNFa 100 ± 40 hücre / mm bazal) ile inkübe edilen hücreleri stimüle olan CD16 + hücre sayısı önemli ölçüde artmıştır 172 ± 67 hücre / mm; TNFa: tam kan, 378 ± 185 hücre / mm) (F), HUVEC falloidin (kırmızı için boyandı stimüle stimüle edilmemiş ve TNFa temsili görüntüleri), CD16 (yeşil) ve DAPI (mavi).. Ölçü bar = 250 um kan (1.5 mi ile inkübe edilen, tedavi edilmeyen hücrelere kıyasla TAT komplekslerin formasyonu yaklaşık TNFa ile iki katına (G) hücreler uyarılmış. 2.1 ± 0.1 kat daha fazla TAT, n = 3; 1.75 mi: 1.7 ± 1.0 kat daha fazla TAT, n = 4). Tüm değerler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur; p değerleri eşleşmemiş t testi ile hesaplanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52112/52112fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

İnsanlarda vasküler kan etkileşimlerini araştırmak için güvenilir modellerin erişilebilirliği eksiktir. Hem kandaki (ELISA) hem de vasküler kompartmandaki (mikroskopi) hücresel etkileşimleri araştırmak için insan tam kanı ile birleştirilmiş kültürlenmiş primer insan endotel hücrelerinin in vitro bir modelini sunuyoruz.

A Novel In vitro İnsan Tüm Kan ve Endotelyumunun Arasındaki Etkileşimler incelenmesi için Model

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Bu prosedürün genel amacı, yeni bir kan endotel odası testi kullanarak kan ve endotel hücreleri arasındaki etkileşimleri incelemektir. Bu, önce sağlıklı bir gönüllüden açık sistem damar delinmesi ile kan alınarak gerçekleştirilir. İkinci adımda, kan, endotel hücre kültürü kaplı slaytlara bağlanmış heparin yüzey kaplı kan odacıkları üzerine dikkatlice katmanlanır.Daha sonra, bu kan endotel hücre odaları, kan ve endotel hücreleri arasındaki etkileşimi kolaylaştırmak için hafifçe döndürülür. Sonuç olarak, kan ve endotel hücreleri arasındaki hücreden hücreye etkileşimler ve sonuçta ortaya çıkan trombin antitrombin kompleksi üretimi sırasıyla immünofloresan mikroskobu ve Eliza ile değerlendirilebilir. Bu tekniğin, hayvan modellerini kullananlar gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, burada deneye başlamadan önce vasküler hastalığı araştırmak için bir insan model sisteminin kullanılabilmesidir.18 gauge hipodermik bir iğneyi iki milimetre iç çaplı bir heparin yüzey kaplı silikon boru parçasına bağlayın. Pıhtılaşmanın spesifik olmayan aktivasyonunu önlemek için plastik yüzeyler heparin ile kaplanmıştır. Örneğin, bu görüntüde, bu kaplanmamış odacıkta bir pıhtı açıkça görülmektedir.30 dakikalık kan temasından sonra, odayı heparin yüzeyi ile tedavi etmek, kanı kontrolsüz aktivasyondan korur ve sonuçların endotel hücresi kan etkileşimlerinden kaynaklanmasını sağlar. Sadece boruyu bağladıktan sonra, sağlıklı bir donörden açık sistem damar delme ile 50 mililitrelik heparin yüzey kaplı bir tüpe dikkatlice bir kan örneği alın. Toplanan kanı, mililitre başına 0.75 IU'luk bir nihai konsantrasyona ulaşmak için fraksiyone edilmemiş heparin ile destekleyin ve hafifçe karıştırmak için tüpü iki ila üç kez ters çevirin.İlk kan proteini konsantrasyonunun analizi için, 30 mikrolitre 10 milimolar K üç EDTA içeren mikro santrifüj tüplerinde tüp başına bir mililitre kanı dikkatlice karıştırın ve tüpleri buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, her bir heparin yüzey kaplı kan endotel hücre odasına 1,5 mililitre kan aktarmak için heparin yüzey kaplı bir pipet ucu kullanın ve aktivasyonu önlemek için kanın yavaş ve kabarcık oluşturmadan akmasına dikkat edin. Daha sonra, üreticinin talimatlarına göre endotel hücre kültürü slaytlarından plastik duvarları çıkarın ve endotel hücrelerini nazikçe yıkayın.PBS ile, kültürlerin kurumasına izin vermeden hücrelerden mümkün olduğunca çok yıkamayı hareket ettiriyoruz ve slaytları, hücreler kana bakacak şekilde kan odalarının üzerine yerleştiriyoruz. Ardından ek destek için plastik slaytlar kullanın. Hücre kültürü slaytlarının kırılmasını önlemek için, slaytları sabitlemek için her bir kan endotel hücre odasının etrafına bir kelepçe yerleştirin.Şimdi, odaları 37 santigrat derece su banyosunda 0,5 G'de 30 dakika boyunca dönen bir tekerlek üzerinde döndürün. Rotasyondan sonra, kan endotel hücre odalarını sökün, hücre kültürü slaytlarını PBS'de yıkayın ve hücreleri 10 dakika boyunca buz gibi% 1 paraldehit içinde sabitleyin. Son olarak, aktive edilmiş kan protein konsantrasyonunun değerlendirilmesi için, her odadan bir mililitre kanı 30 mikrolitre 0.34 molar K üç EDTA içeren mikro santrifüj tüplerinde karıştırın ve tüpleri en fazla bir saat boyunca buz üzerine yerleştirin.Daha sonra hücreleri döndürdükten sonra, plazmayı daha fazla analize kadar eksi 70 santigrat derecede yeni mikro santrifüj tüplerinde saklayın. Pıhtılaşma faktörlerinin aktivasyonunun, aktive edilmiş faktörler arasındaki etkileşim olasılığı arttıkça durgun kanda meydana gelme olasılığı daha yüksektir. Gerçekten de, hava kabarcıkları tarafından herhangi bir hareket olmaksızın kan hacmi iki buçuk kat daha büyüktür.1.5 mililitre kan kullanıldığında odaya 1.75 mililitre kan eklendiğinde, ölçülen trombin antitrombin değerleri, artmış kan hacmi ile birlikte artmış bir trombin antitrombin oluşumunu gösterir. İlginç bir şekilde, her iki hacimde tam kan ile inkübe edildiğinde, iki grup arasında hiçbir fark kaydedilmez, bu da endotel hücrelerinin TNF alfa'nın lökosit alımı üzerindeki etkisini incelemek için pıhtılaşmanın aktivasyonunu modüle edebileceğini düşündürür. Bu deneyde, qve, kan temasından dört saat önce mililitre başına 20 nanogram TT NF alfa ile muamele edildi, daha sonra CD 16 pozitif hücrelerin sayısı ölçüldü.CD 16 pozitif hücrelerin alımı, TNF alfa tedavisi ile milimetre kare ve 1.5 litre kan başına 100'den 256 CD 16 pozitif hücreye ve 172'den 378 ve 1.75 mililitre kana önemli ölçüde artmıştır. Trombin antitrombin komplekslerinin oluşumu daha sonra TNF alfa ile muamele edilmiş veya muamele edilmemiş hücrelerle inkübe edilmiş kandan karşılık gelen plazma örneklerinde ölçüldü. Beklendiği gibi, TNF alfa ile uyarılan hücreler, geliştirilmesinden sonra tedavi edilmeyen kontrollere kıyasla trombin antitrombin komplekslerinin yaklaşık iki katına çıkmasına neden oldu.Bu teknik, immünoloji alanındaki araştırmacıların, insan birincil hücrelerini ve insan tam kanını kullanarak in vitro bir modelde keşfetmeleri, tamamlamaları ve pıhtılaşmaları için yol açacaktır.

a-novel-vitro-model-for-studying-interactions-between-human-whole

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Mikrovasküler ölçekli kanallar (&lt;30 um) ile bir mikroakışkan cihazın bütün iç yüzeyi boyunca kültürün 3B, endotel hücre mono tabakasında için bir yöntem tarif edilmiştir.

Hematolojik Hastalıklarında Mikrovasküler Etkileşimleri Öğrenmenin Endothelialized Mikroakiskan

Bakterilerin kesme gerilimi altındaki kan damarları ile etkileşimini incelemek için, vasküler yapışmaya katkıda bulunan bakteri ve konak faktörlerini incelemeye izin veren bir akış odası ve in vivo mezenterik intravital mikroskopi modeli tanımlanmıştır.

In Vitro ve İn Vivo Modeli Gemi Duvar Altında Akış Koşulları Bakteriyel Yapışma Eğitim için

Bu protokol, hastalık patolojilerinde hücre yanıtını belirlenmesinde yardımcı olmak için, in vitro olarak fizyolojik veya patolojik kan akışını çoğaltır. Kan pompası alt bölmeyi sönümleme bir basınç katılmasıyla, damar boyunca kan akımı değinmeyecek edilebilir ve vasküler endotelyum, ya da taklit eden ko-kültür, bir tek tabaka üzerine koydu.

Vasküler Hücre Remodeling Soruşturma Fizyolojik in vitro Modeli ve Uygulaması ile Patolojik Kan Akış

Birincil insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC'ler), bir mikroakışkan ağ cihazı içinde birleşecek şekilde büyütüldü. Endotel hücre bağlantısı ve F-aktin dağılımları gösterildi ve adenozin trifosfata (ATP) yanıt olarak hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve nitrik oksit üretimindeki değişiklikler, bireysel hücre seviyelerinde gerçek zamanlı olarak ölçüldü.

Gelişim ve karakterizasyonu<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mikrodamar Ağ ve Endotel kantitatif ölçümleri [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; I</sub&gt; Ve Nitrik Oksit Üretimi

Biz matris jel fiş anjiyogenez testinin bir varyasyon kullanarak fare insan endotel-pericyte etkileşimleri incelemek için bir protokol mevcut.

Fare Matrix Jel Plug Test kullanma İnsan endotel-pericyte Etkileşim Vivo Çalışmasında

Biz bütün, anticoagulated kan çalışma ve koagülasyon analizini sağlayan bir vitro modeli mevcut. Anticoagulation sistemi sağlıklı endotel hücreleri doğal anticoagulation etkisi bağlıdır ve endotel hücre aktivasyonu pıhtılaşma içinde sonuçlanır.

Endotel hücreleri kullanarak 3D hücre kültürü ve sigara anticoagulated tam kan antikoagülan ve anti-enflamatuar özellikleri değerlendirilmesi

Bu protokol, lazer kesim nörovasküler implantlar kullanılarak kanla temas eden cihazların kapsamlı bir hemouyumluluk değerlendirmesini açıklamaktadır. Taze, heparinize insan kanı ile bir akış döngüsü modeli kan akışını taklit etmek için uygulanır. Perfüzyon sonrası çeşitli hematolojik belirteçler analiz edilir ve test edilen cihazların hemokompatibilite değerlendirmesi için kan alındıktan sonra doğrudan elde edilen değerlerle karşılaştırılır.

İnsan Kan Akışını Taklit Eden Akış Döngüsü Modelinde Kanla Temas Eden İmplantların Hemokomuuyum Testi

Hasta kaynaklı endotel ile tam kan etkileşimini araştırmak için in vitro vasküler hastalık modeli salıyoruz. Bu sistem çeşitli koşullar altında primer endotel hücrelerinin trombojenik özelliklerinin incelenmesini sağlar. Bu yöntem özellikle pıhtılaşmanın farklı aşamalarında situ trombojenite ve antikoagülasyon tedavisinin değerlendirilmesi için uygundur.

In Vitro Mikroakışkan Hastalık Modeli Gerçek Zamanlı Olarak Tam Kan-Endotel Etkileşimleri ve Kan Pıhtısı Dinamikleri Çalışma

Burada sunulan bir standart in vitro hemodinamik döngü modeli için bir protokoldür. Bu model perfüzyon tüpleri veya vasküler stentlerin hemouyumluluğunun ISO (International Organization for Standardization) standardı 10993-4'e uygun olarak test edilmesine olanak sağlar.

Vasküler Tıbbi Cihazların Hemositokomisyonla uyumluluğunu ve Konak Hücre Aktivasyonunu Araştırmak için Bir In Vitro Hemodinamik Döngü Modeli

Burada açıklanan, endotel hücrelerini insan pluripotent kök hücrelerinden ayırt etmek için basit bir iş akışı ve ardından mekanik stimülasyonları için ayrıntılı bir protokoldür. Bu, endotel hücrelerinin gelişimsel mekanobiyolojisinin incelenmesine izin verir. Bu yaklaşım, mekanik stimülasyondan sonra kültür çipinden toplanan canlı hücrelerin aşağı akış testleriyle uyumludur.

In Vitro Gelişimsel Mekanobiyolojiyi İncelemek için Çip Üzerinde Fetal İnsan Gemisi Modeli

Keşfedin, kan-endotelyal hücre etkileşimlerini incelemek için yeni bir in vitro model. Bu yöntem, trombin-antitrombin kompleks oluşumunu ve TNF-alfa'nın lökosit rekrütmanına etkisini değerlendirir.

A Novel In vitro İnsan Tüm Kan ve Endotelyumunun Arasındaki Etkileşimler incelenmesi için Model

Daha fazla video keşfet