A Novel In vitro İnsan Tüm Kan ve Endotelyumunun Arasındaki Etkileşimler incelenmesi için Model

Bu prosedürün genel amacı, yeni bir kan endotel odası testi kullanarak kan ve endotel hücreleri arasındaki etkileşimleri incelemektir. Bu, önce sağlıklı bir gönüllüden açık sistem damar delinmesi ile kan alınarak gerçekleştirilir. İkinci adımda, kan, endotel hücre kültürü kaplı slaytlara bağlanmış heparin yüzey kaplı kan odacıkları üzerine dikkatlice katmanlanır.

Daha sonra, bu kan endotel hücre odaları, kan ve endotel hücreleri arasındaki etkileşimi kolaylaştırmak için hafifçe döndürülür. Sonuç olarak, kan ve endotel hücreleri arasındaki hücreden hücreye etkileşimler ve sonuçta ortaya çıkan trombin antitrombin kompleksi üretimi sırasıyla immünofloresan mikroskobu ve Eliza ile değerlendirilebilir. Bu tekniğin, hayvan modellerini kullananlar gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, burada deneye başlamadan önce vasküler hastalığı araştırmak için bir insan model sisteminin kullanılabilmesidir.

18 gauge hipodermik bir iğneyi iki milimetre iç çaplı bir heparin yüzey kaplı silikon boru parçasına bağlayın. Pıhtılaşmanın spesifik olmayan aktivasyonunu önlemek için plastik yüzeyler heparin ile kaplanmıştır. Örneğin, bu görüntüde, bu kaplanmamış odacıkta bir pıhtı açıkça görülmektedir.

30 dakikalık kan temasından sonra, odayı heparin yüzeyi ile tedavi etmek, kanı kontrolsüz aktivasyondan korur ve sonuçların endotel hücresi kan etkileşimlerinden kaynaklanmasını sağlar. Sadece boruyu bağladıktan sonra, sağlıklı bir donörden açık sistem damar delme ile 50 mililitrelik heparin yüzey kaplı bir tüpe dikkatlice bir kan örneği alın. Toplanan kanı, mililitre başına 0.75 IU'luk bir nihai konsantrasyona ulaşmak için fraksiyone edilmemiş heparin ile destekleyin ve hafifçe karıştırmak için tüpü iki ila üç kez ters çevirin.

İlk kan proteini konsantrasyonunun analizi için, 30 mikrolitre 10 milimolar K üç EDTA içeren mikro santrifüj tüplerinde tüp başına bir mililitre kanı dikkatlice karıştırın ve tüpleri buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, her bir heparin yüzey kaplı kan endotel hücre odasına 1,5 mililitre kan aktarmak için heparin yüzey kaplı bir pipet ucu kullanın ve aktivasyonu önlemek için kanın yavaş ve kabarcık oluşturmadan akmasına dikkat edin. Daha sonra, üreticinin talimatlarına göre endotel hücre kültürü slaytlarından plastik duvarları çıkarın ve endotel hücrelerini nazikçe yıkayın.

PBS ile, kültürlerin kurumasına izin vermeden hücrelerden mümkün olduğunca çok yıkamayı hareket ettiriyoruz ve slaytları, hücreler kana bakacak şekilde kan odalarının üzerine yerleştiriyoruz. Ardından ek destek için plastik slaytlar kullanın. Hücre kültürü slaytlarının kırılmasını önlemek için, slaytları sabitlemek için her bir kan endotel hücre odasının etrafına bir kelepçe yerleştirin.

Şimdi, odaları 37 santigrat derece su banyosunda 0,5 G'de 30 dakika boyunca dönen bir tekerlek üzerinde döndürün. Rotasyondan sonra, kan endotel hücre odalarını sökün, hücre kültürü slaytlarını PBS'de yıkayın ve hücreleri 10 dakika boyunca buz gibi% 1 paraldehit içinde sabitleyin. Son olarak, aktive edilmiş kan protein konsantrasyonunun değerlendirilmesi için, her odadan bir mililitre kanı 30 mikrolitre 0.34 molar K üç EDTA içeren mikro santrifüj tüplerinde karıştırın ve tüpleri en fazla bir saat boyunca buz üzerine yerleştirin.

Daha sonra hücreleri döndürdükten sonra, plazmayı daha fazla analize kadar eksi 70 santigrat derecede yeni mikro santrifüj tüplerinde saklayın. Pıhtılaşma faktörlerinin aktivasyonunun, aktive edilmiş faktörler arasındaki etkileşim olasılığı arttıkça durgun kanda meydana gelme olasılığı daha yüksektir. Gerçekten de, hava kabarcıkları tarafından herhangi bir hareket olmaksızın kan hacmi iki buçuk kat daha büyüktür.

1.5 mililitre kan kullanıldığında odaya 1.75 mililitre kan eklendiğinde, ölçülen trombin antitrombin değerleri, artmış kan hacmi ile birlikte artmış bir trombin antitrombin oluşumunu gösterir. İlginç bir şekilde, her iki hacimde tam kan ile inkübe edildiğinde, iki grup arasında hiçbir fark kaydedilmez, bu da endotel hücrelerinin TNF alfa'nın lökosit alımı üzerindeki etkisini incelemek için pıhtılaşmanın aktivasyonunu modüle edebileceğini düşündürür. Bu deneyde, qve, kan temasından dört saat önce mililitre başına 20 nanogram TT NF alfa ile muamele edildi, daha sonra CD 16 pozitif hücrelerin sayısı ölçüldü.

CD 16 pozitif hücrelerin alımı, TNF alfa tedavisi ile milimetre kare ve 1.5 litre kan başına 100'den 256 CD 16 pozitif hücreye ve 172'den 378 ve 1.75 mililitre kana önemli ölçüde artmıştır. Trombin antitrombin komplekslerinin oluşumu daha sonra TNF alfa ile muamele edilmiş veya muamele edilmemiş hücrelerle inkübe edilmiş kandan karşılık gelen plazma örneklerinde ölçüldü. Beklendiği gibi, TNF alfa ile uyarılan hücreler, geliştirilmesinden sonra tedavi edilmeyen kontrollere kıyasla trombin antitrombin komplekslerinin yaklaşık iki katına çıkmasına neden oldu.

Bu teknik, immünoloji alanındaki araştırmacıların, insan birincil hücrelerini ve insan tam kanını kullanarak in vitro bir modelde keşfetmeleri, tamamlamaları ve pıhtılaşmaları için yol açacaktır.