Tesisinden Akışkan apoplastik çıkarımı için infiltrasyonu-santrifüj Tekniği Kullanarak bırakır Phaseolus vulgaris Bir örnek olarak

Bu prosedürün amacı, infiltrasyon santrifüjleme tekniği kullanılarak bitki yapraklarından aplastik sıvının ekstraksiyonunu göstermektir. Bu, önce bir yaprağın sızma sıvısına daldırılması ve tamamen sızması için bir şırınga veya vakum pompası kullanılarak üretilen basınç farklılıklarının kullanılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, destekleyici bir aparat kullanılarak santrifüj edilecek yaprağı hazırlamaktır.

Daha sonra, APO plast yıkama sıvısını elde etmek için yaprak nazikçe santrifüjlenir. Son adım, APO plast seyreltme faktörünü belirlemek ve alast yıkama sıvısının kalitesini test etmektir. Sonuç olarak, infiltrasyon santrifüjleme testi, çeşitli aşağı akış analizleri için kullanılabilen temsili APO plast numuneleri elde etmek için kullanılır.

Bu tekniğin diğer mevcut yöntemlere göre ana avantajı, sitoplazmik bileşiklerle minimum kontaminasyona sahip üst artı numuneler elde etmek için çeşitli yaprak türleri için optimize etmenin basit olmasıdır. Bu yöntem, APL'lerin bileşiminin bitkiler arasında nasıl değiştiğini ve farklı fizyolojik koşullar veya stresler altındaki değişiklikleri anlamanın önemli olduğu bitki fizyolojisi ve bitki mikrop etkileşimleri gibi alanlardaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. İlk adım olarak, laboratuvar önlüğü, eldiven ve gözlük kuralları giyerek güvenlik önlemleri alın.

Ardından, yaprak örneğini daldırmak için bir miktar damıtılmış su hazırlayın. Bu durumda bir numune toplamak için bir tıraş bıçağı hazırlayın, fasulye çeşidi ihale yeşilinden bir yaprak. Tıraş bıçağını bir yaprağın evcil hayvanına yerleştirin ve yaprağı bitkiden takın.

Toplandıktan sonra, yaprak yüzeyindeki kirleticileri gidermek için taze kesilmiş yaprağı damıtılmış suya batırın. Ardından yaprağın nazikçe kurumasını engellemek için emici kağıt mendil veya kağıt kullanın. Sızmaya devam etmeden önce yaprak ağırlığını ölçün.

Bu, daha sonra sızma hacmine yaklaşmada yardımcı olacaktır. Sızma işlemini 60 mililitrelik bir şırınga ile başlatın. Pistonu çıkarıldıktan sonra, yaprağı şırınganın içine dikkatlice yuvarlayın ve / veya katlayın.

Ardından, şırıngayı sızma sıvısı ile doldurun. Burada damıtılmış su kullanılıyor. Pistonu yerleştirin ve içindeki havayı dışarı atmak için şırıngayı ters çevirin.

Daha sonra karşılaştırmak için yaprak rengine dikkat edin. Küçük bir parça para param kullanarak pistonu 40 mililitre işaretine getirin. Şırınga ucunu kapatın.

Ardından, negatif basınç oluşturmak için pistonu 60 mililitre işaretine kadar çekin. Yaprak yüzeyindeki hava kabarcıklarını serbest bırakmak için şırıngayı ters çevirin. Pistonu yaklaşık iki saniye boyunca yavaşça başlangıç konumuna getirin.

Şırınga ucunu açın ve havayı boşaltın. Ardından ucu tekrar kapatın ve mütevazı miktarda pozitif basınç oluşturmak için pistona bastırın. Negatif basınç uygulamaya, havayı dışarı atmaya ve yaprak tamamen sızana kadar pozitif basınç uygulamaya devam edin.

Tam sızmanın kanıtı, sızan alanların koyu rengidir. Bu görüldüğünde, yaprağı şırıngadan çıkarın. Yüzey sıvısını çıkarmak için yaprağı emici kağıtla nazikçe bloke edin.

Daha sonra sızan yaprağın ağırlığını ölçün ve alternatif bir sızma yöntemi bir vakum şişesi kullanır. Yine, bir yaprak toplayın ve damıtılmış suyla durulayın. Kuruduktan sonra yaprak ağırlığını ölçün.

Minimum 250 mililitre kapasiteli bir yan kol şişesi edinin. Yaprağı şişeye yerleştirin ve üzerini damıtılmış suyla kaplayın. Ardından, şişeye bir tıpa yerleştirin ve yan kola bir vakum pompası takın.

Bir basınç elde etmek için şişeye yeterince uzun süre vakum uygulayın. Yaklaşık 650 milimetre cıva. Düşük basınç altındayken yapraktaki hava kabarcıklarını serbest bırakmak için şişeyi hafifçe çalkalayın.

Ardından, vakumu yaklaşık 10 saniye boyunca dikkatlice ve yavaşça serbest bırakın. Vakum uygulama, şişeyi çalkalama ve yaprak tamamen sızana kadar vakumu serbest bırakma işlemini tekrarlayın. Tam sızmanın kanıtı, sızan alanların koyu rengidir.

Tamamen sızmış yaprağı şişeden çıkarın ve yaprağı emici kağıtla nazikçe kurulayın. Yüzey sıvısını çıkarmak için, yaklaşık sızma hacminin belirlenmesine izin vermek için sızan yaprağın ağırlığını ölçün. Bir yaprak tamamen sızdıktan sonra, santrifüjleme için hazırlayın.

Dört inç genişliğinde bir para film parçası yerleştirin. Yaprağı para filmin üzerine yerleştirin. Daha sonra beş mililitrelik bir pipet ucu kullanarak yaprağı para filmde yuvarlayın.

Piston çıkarılmış olarak 20 mililitrelik bir şırınga gövdesi alın ve kıvrılmış yaprağı pipet ucuyla yerleştirin. Kesilen yaprak kenarlarını piston ucuna bakacak şekilde konumlandırın. 50 mililitrelik bir polietilen veya polikarbonat tüp alın ve şırıngayı içine yerleştirin.

Sallanan bir kova rotoru olan bir santrifüj kullanın. Sızan yaprağı içeren tüpü ve 10 dakika boyunca dört santigrat derece ve 1000 G'lik santrifüjü yükleyin. Santrifüjlemeden sonra, sızma sıvısının çoğunluğunun dışarı atılıp atılmadığını belirlemek için yaprağı inceleyin.

Santrifüj tüpü şimdi geri kazanılmış APO plast yıkama sıvısını içerir, geri kazanılan alast yıkama sıvısını taze 1,5 mililitrelik tüplere pipetleyerek devam edin. APO plast yıkama sıvısı örneklerini santrifüje yerleştirin ve herhangi bir hücreyi veya partikül maddeyi çıkarmak için beş dakika boyunca 15.000 G'de döndürün. Santrifüjlemeden sonra supinatı taze tüplere pipetleyin.

Numuneleri eksi 80 santigrat derecede saklanana kadar buz üzerinde tutun. APO plaka yıkama sıvısının kalitesini değerlendirmenin bir yöntemi, APO plaka seyreltme faktörünü hesaplamaktır. Bunu yapmak için, bu durumda her biri bir hacme birkaç sızma için yeterli olan iki hacim sızma sıvısı damıtılmış su hazırlayın.

İndigo karmin tozunu 50 mikromolar nihai konsantrasyona ekleyin. Diğerine hiçbir şey eklemeyin. 96 Kuyulu bir mikroplaka elde edin, üç kuyuyu 200 mikrolitre infiltrasyon solüsyonu ile doldurun.

İndigo karmin ile, her bir sıvının emilimini ölçmek için mikroplakayı okuyucuya yerleştirin, 200 mikrolitre katkısız sızma solüsyonu ile üç tane daha doldurun. 610 nanometrede, indigo karminli sıvı için ortalama emici eksi sıvı için ortalama emici, infiltratın düzeltilmiş emilimini verir. Ardından, sızma çözümlerinin her biri için yaprak sızma protokolünü üç kez çoğaltın.

Bir yaprak örneğini suya batırın. İndigo Karmin infiltrasyon solüsyonunu kullanırken negatif ve pozitif basınç uygulayın, yaprak yüzeyinden kalan indigo karmini çıkarmak için sızmadan sonra yaprakları damıtılmış suda durulayın. Santrifüjleme kullanarak son yıkama sıvısını geri kazanın.

Son yıkama sıvısını geri kazandıktan sonra, mikroplakanın kuyucuklarındaki plaka okuyucuya geri dönün. İndigo karmin içermeyen ekstraksiyonların her birinden 200 mikrolitre ve ayrıca her bir indigo karmin alast yıkama sıvısı ekstraksiyonundan 200 mikrolitre yerleştirildi. Düzeltilmiş absorbansı elde etmek için numunelerin absorbansını 610 nanometrede ölçün.

Her sayı kümesinin ortalamasını alın ve farkı alın. Aplastik sıvıdaki konsantrasyonların veya aktivitelerin tahminlerini elde etmek için APL seyreltme faktörünü belirlemek için sızıntının düzeltilmiş emilimini ve aplastik yıkama sıvısının düzeltilmiş emilimini kullanın. İmplanter, alast yıkama sıvısından elde edilen konsantrasyon veya aktivite değerlerini, fasi vulgaris çeşidinden ekstrakte edilen alast yıkama sıvısından ekstrakte edilen seyreltme faktörü ile çarpar.

Bu gaz kromatografisi kütle spektrumlu organik asitleri üretmek için ihale yeşili kullanıldı. Basit şekerler ve amino asitler, tanımlanabilir metabolitlerin büyük kısmını temsil eder. İşte SDS sayfasının, fasi vulgarus alast yıkama sıvısı yaprak özlerinin Kumasi leke jellerinin bir karşılaştırması.

Ekstraksiyonlar sitoplazmik kontaminasyon miktarında farklılık gösterir. Bu, alçı enzimi rubis'in farklı miktarları olarak gözlenir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, bu prosedürü takiben herhangi bir doku hasarına veya sitoplazmik kontaminasyona neden olmamak için en azından mümkün olduğunca nazik olmayı unutmamak önemlidir.

Aplastik sıvının bileşimi ile ilgili ek soruları yanıtlamak için protein veya metabolit kütle spektrometresi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Aplastik yıkama sıvısı, aplastik kimyasalların bitki dokularını kolonize eden mikroorganizmalar üzerindeki etkisini incelemek için brüt bir ortam olarak da kullanılabilir.