Name: Co-kültür Model Birleşmeyle GABAerjik Orta Spiny Nöronlar ve HEK293 Hücreler inhibitör Synapse Oluşumu istikrarlı bir şekilde GABA ifade A Reseptörler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Keşfedin GABAerjik sinaps oluşumunu in vitro ortamda embriyonik orta spiny nöronlar ve GABA A reseptörü ifade eden HEK293 hücreleriyle kurulan ortak kültür modeli kullanarak. Bu yöntem sinaptik etkileşimleri görselleştirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz MRC İngiltere (G0800498) mali destek kabul etmek istiyorum. Biz de antibiyotik direnci içeren pCDNA 3.1 (+) ekspresyon vektörleri sağlamak için, GABA A -R altbirim-spesifik γ2 antikor ve Profesör R. Harvey, Eczacılık UCL Okulu sağlamak için, Profesör JM Fritschy, Zürih Üniversitesi teşekkür etmek istiyorum kararlı biçimde transfekte edilmiş HEK293 hücre çizgilerinin üretilmesi için genler içerir.

<ol><li>Wang, D. D., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+role+of+GABA+in+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Defining the role of GABA in cortical development.</a> J Physiol. 587, 1873-1879 (2009).</li>
<li>Ben-Ari, Y., Khalilov, I., Kahle, K. T., Cherubini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GABA+excitatory%2Finhibitory+shift+in+brain+maturation+and+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22The+Neuroscientist+%3A+a+review+journal+bringing+neurobiology%2C+neurology+and+psychiatry%22%5BJournal%5D)">The GABA excitatory/inhibitory shift in brain maturation and neurological disorders.</a> The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 18, 467-486 (2012).</li>
<li>Structure Sieghart, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pharmacology%2C+and+function+of+GABAA+receptor+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">pharmacology, and function of GABAA receptor subtypes.</a> Adv Pharmacol. 54, 231-263 (2006).</li>
<li>Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter+action%3A+opening+of+ligand-gated+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter action: opening of ligand-gated ion channels.</a> Cell. 72, 31-41 (1993).</li>
<li>Homanics, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+devoid+of+gamma-aminobutyrate+type+A+receptor+beta3+subunit+have+epilepsy%2C+cleft+palate%2C+and+hypersensitive+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mice devoid of gamma-aminobutyrate type A receptor beta3 subunit have epilepsy, cleft palate, and hypersensitive behavior.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4143-4148 (1997).</li>
<li>Gunther, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzodiazepine-insensitive+mice+generated+by+targeted+disruption+of+the+gamma+2+subunit+gene+of+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Benzodiazepine-insensitive mice generated by targeted disruption of the gamma 2 subunit gene of gamma-aminobutyric acid type A receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7749-7753 (1995).</li>
<li>Mohler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA%28A%29+receptor+diversity+and+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">GABA(A) receptor diversity and pharmacology.</a> Cell Tissue Res. 326, 505-516 (2006).</li>
<li>Low, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+neuronal+substrate+for+the+selective+attenuation+of+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular and neuronal substrate for the selective attenuation of anxiety.</a> Science. 290, 131-134 (2000).</li>
<li>Rudolph, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzodiazepine+actions+mediated+by+specific+gamma-aminobutyric+acid%28A%29+receptor+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Benzodiazepine actions mediated by specific gamma-aminobutyric acid(A) receptor subtypes.</a> Nature. 401, 796-800 (1999).</li>
<li>Rudolph, U., Knoflach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+classical+benzodiazepines%3A+novel+therapeutic+potential+of+GABAA+receptor+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 685-697 (2011).</li>
<li>Hulst, C., Atack, J. R., Kooy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complexity+of+the+GABAA+receptor+shapes+unique+pharmacological+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">The complexity of the GABAA receptor shapes unique pharmacological profiles.</a> Drug Discov Today. 14, 866-875 (2009).</li>
<li>Essrich, C., Lorez, M., Benson, J. A., Fritschy, J. M., Luscher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+clustering+of+major+GABAA+receptor+subtypes+requires+the+gamma+2+subunit+and+gephyrin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic clustering of major GABAA receptor subtypes requires the gamma 2 subunit and gephyrin.</a> Nat Neurosci. 1, 563-571 (1998).</li>
<li>Schweizer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gamma+2+subunit+of+GABA%28A%29+receptors+is+required+for+maintenance+of+receptors+at+mature+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The gamma 2 subunit of GABA(A) receptors is required for maintenance of receptors at mature synapses.</a> Mol Cell Neurosci. 24, 442-450 (2003).</li>
<li>Belelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrasynaptic+GABAA+receptors%3A+form%2C+pharmacology%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Extrasynaptic GABAA receptors: form, pharmacology, and function.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 12757-12763 (2009).</li>
<li>Connolly, C. N., Wooltorton, J. R., Smart, T. G., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptors+is+determined+by+receptor+beta+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of gamma-aminobutyric acid type A receptors is determined by receptor beta subunits.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 9899-9904 (1996).</li>
<li>Connolly, C. N., Krishek, B. J., McDonald, B. J., Smart, T. G., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+cell+surface+expression+of+heteromeric+and+homomeric+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Assembly and cell surface expression of heteromeric and homomeric gamma-aminobutyric acid type A receptors.</a> J Biol Chem. 271, 89-96 (1996).</li>
<li>Klausberger, T., Roberts, J. D., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-+and+input-specific+differences+in+the+number+and+subtypes+of+synaptic+GABA%28A%29+receptors+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cell type- and input-specific differences in the number and subtypes of synaptic GABA(A) receptors in the hippocampus.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2513-2521 (2002).</li>
<li>Thomson, A. M., Jovanovic, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+synapse-specific+clustering+of+GABA%28A%29+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying synapse-specific clustering of GABA(A) receptors.</a> Eur J Neurosci. 31, 2193-2203 (2010).</li>
<li>Fritschy, J. M., Panzanelli, P., Tyagarajan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+heterogeneity+of+GABAergic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional heterogeneity of GABAergic synapses.</a> Cell Mol Life Sci. 69, 2485-2499 (2012).</li>
<li>Ali, A. B., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+alpha+5+subunit-containing+GABAA+receptors+mediate+IPSPs+elicited+by+dendrite-preferring+cells+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex.</a> Cereb Cortex. 18, 1260-1271 (2008).</li>
<li>Thomson, A. M., Bannister, A. P., Hughes, D. I., Pawelzik, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+sensitivity+to+Zolpidem+of+IPSPs+activated+by+morphologically+identified+CA1+interneurons+in+slices+of+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential sensitivity to Zolpidem of IPSPs activated by morphologically identified CA1 interneurons in slices of rat hippocampus.</a> Eur J Neurosci. 12, 425-436 (2000).</li>
<li>Nyiri, G., Freund, T. F., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Input-dependent+synaptic+targeting+of+alpha%282%29-subunit-containing+GABA%28A%29+receptors+in+synapses+of+hippocampal+pyramidal+cells+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Input-dependent synaptic targeting of alpha(2)-subunit-containing GABA(A) receptors in synapses of hippocampal pyramidal cells of the rat.</a> Eur J Neurosci. 13, 428-442 (2001).</li>
<li>Treutlein, B., Gokce, O., Quake, S. R., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartography+of+neurexin+alternative+splicing+mapped+by+single-molecule+long-read+mRNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cartography of neurexin alternative splicing mapped by single-molecule long-read mRNA sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1291-1299 (2014).</li>
<li>Siddiqui, T. J., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+organizing+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Synaptic organizing complexes.</a> Current opinion in neurobiology. 21, 132-143 (2011).</li>
<li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-order+architecture+of+cell+adhesion+mediated+by+polymorphic+synaptic+adhesion+molecules+neurexin+and+neuroligin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Higher-order architecture of cell adhesion mediated by polymorphic synaptic adhesion molecules neurexin and neuroligin.</a> Cell reports. 2, 101-110 (2012).</li>
<li>Krueger, D. D., Tuffy, L. P., Papadopoulos, T., Brose, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neurexins+and+neuroligins+in+the+formation%2C+maturation%2C+and+function+of+vertebrate+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">The role of neurexins and neuroligins in the formation, maturation, and function of vertebrate synapses.</a> Current opinion in neurobiology. 22, 412-422 (2012).</li>
<li>Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroligin+expressed+in+nonneuronal+cells+triggers+presynaptic+development+in+contacting+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons.</a> Cell. 101, 657-669 (2000).</li>
<li>Graf, E. R., Zhang, X., Jin, S. X., Linhoff, M. W., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurexins+induce+differentiation+of+GABA+and+glutamate+postsynaptic+specializations+via+neuroligins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neurexins induce differentiation of GABA and glutamate postsynaptic specializations via neuroligins.</a> Cell. 119, 1013-1026 (2004).</li>
<li>Dong, N., Qi, J., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+reconstitution+of+functional+GABAergic+synapses+with+expression+of+neuroligin-2+and+GABAA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular reconstitution of functional GABAergic synapses with expression of neuroligin-2 and GABAA receptors.</a> Mol Cell Neurosci. 35, 14-23 (2007).</li>
<li>Fuchs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA%28A%29+receptors+can+initiate+the+formation+of+functional+inhibitory+GABAergic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses.</a> Eur J Neurosci. 38, 3146-3158 (2013).</li>
<li>Ventimiglia, R., Lindsay, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVentimiglia%2C+R+%22Culturing+nerve+cells%3A+Rat+striatal+neurons+in+low-density%2C+serum-free+culture%22">Culturing nerve cells: Rat striatal neurons in low-density, serum-free culture</a>. , 2nd edn, MIT Press. 371-393 (1998).</li>
<li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+localization+of+GABA%28A%29+receptor+subunits+in+relation+to+rat+striatopallidal+and+pallidopallidal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential localization of GABA(A) receptor subunits in relation to rat striatopallidal and pallidopallidal synapses.</a> Eur J Neurosci. 33, 868-878 (2011).</li>
<li>Fritschy, J. M., Mohler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAA-receptor+heterogeneity+in+the+adult+rat+brain%3A+differential+regional+and+cellular+distribution+of+seven+major+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits.</a> J Comp Neurol. 359, 154-194 (1995).</li>
<li>Doig, N. M., Moss, J., Bolam, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+and+thalamic+innervation+of+direct+and+indirect+pathway+medium-sized+spiny+neurons+in+mouse+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cortical and thalamic innervation of direct and indirect pathway medium-sized spiny neurons in mouse striatum.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 14610-14618 (2010).</li>
<li>Lalchandani, R. R., Vicini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+collaterals+in+genetically+identified+medium+spiny+neurons+in+mouse+primary+corticostriatal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reports%22%5BJournal%5D)">Inhibitory collaterals in genetically identified medium spiny neurons in mouse primary corticostriatal cultures.</a> Physiological reports. 1, (2013).</li>
<li>Nusser, Z., Sieghart, W., Benke, D., Fritschy, J. M., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+synaptic+localization+of+two+major+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptor+alpha+subunits+on+hippocampal+pyramidal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differential synaptic localization of two major gamma-aminobutyric acid type A receptor alpha subunits on hippocampal pyramidal cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 11939-11944 (1996).</li>
<li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unbiased+expression+screen+for+synaptogenic+proteins+identifies+the+LRRTM+protein+family+as+synaptic+organizers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An unbiased expression screen for synaptogenic proteins identifies the LRRTM protein family as synaptic organizers.</a> Neuron. 61, 734-749 (2009).</li>
<li>Pettem, K. L., Yokomaku, D., Takahashi, H., Ge, Y., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+autism-linked+MDGAs+and+neuroligins+suppresses+inhibitory+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interaction between autism-linked MDGAs and neuroligins suppresses inhibitory synapse development.</a> J Cell Biol. 200, 321-336 (2013).</li>
<li>Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+discovery+of+glypican+as+a+receptor+for+LRRTM4+in+regulating+excitatory+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Unbiased discovery of glypican as a receptor for LRRTM4 in regulating excitatory synapse development.</a> Neuron. 79, 696-711 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bu protokol gerçekleştirmek için teknik olarak zor olmasa da, en doğru ve tekrarlanabilir ko-kültür deneyleri ulaşmak için takip edilmesi gereken birkaç kritik adımlar vardır. İlk olarak, kültürlenmiş orta spinal nöronların optimal bir yoğunlukta tohumlanmıştır gerekir. Çok seyrek numaralı seribaşı ise, nöronlar çok yavaş geliştirmek eğilimindedir ve hayatta kalma büyük ölçüde azalır. Çok yoğun tohumlanır, Öte yandan, nöronlar HEK 293 hücreleri ile temas analizini ödün bu topaklaşma eğilimi. İkinci olarak, geçici olarak sabit bir şekilde önceden ko-kültür içine Platting için GABA bir Rs eksprese eden HEK293 hücrelerinde bir flüoresan raportör, GFP veya mCherry ifade etmek için önerilmektedir. Bu durum, bu hücreler ve nöronal kültürlerinde en nadir glial hücre arasındaki şekil ve büyüklük açısından benzerlik tehlikeye olabilir HEK293 hücrelerinde, güvenilir tanınmasına imkân verir. GFP veya MCherry cDNA ile verimli transfeksiyona elde edilmesi için, HEK293 hücre çizgileri üslü büyüme fazında olması ve6-yuvalı plakalar içinde uygun bir yoğunlukta tohumlanmıştır. Transfeksiyonu takiben seyrek ekim aşırı-besleme cDNA alarak gelen hücreleri önleyecektir süre hücreleri zayıf büyümesine neden olur. Transfeksiyondan bir gün% 90 konfluent - bunlar 70 arasında olduğu İdealde Hücreler olmalıdır. Bazı hücre çizgileri diğerlerine göre daha duyarlı Üçüncü olarak, transfeksiyon, kullanılan her bir hücre hattı için optimize edilmelidir. Kurucu GABA HEK293 hücrelerinde A, R&#39;nin sentezleme hücre hayatta kalma ve transfeksiyondan sonra geri hücrelerin yeteneğini azaltan olmasıdır. Ayrıca, hayatta kalma, bazı hücre çizgileri belirgin olarak diğerlerine göre daha duyarlı olan, HEK293 hücrelerinde ifade GABAA Rs türüne bağlıdır. Lipozomal bir reaktif kullanılarak transfeksiyonu, hızlı büyüyen hücre hatları yabancı proteinlerin ifade yüksek transfeksiyon verimi ve ifade düzeyleri hem de sağlamak için bir en uygun metottur. Bununla birlikte, bu reaktifin, yavaş gelişen hücre çizgileri için çok hasara neden olurhangi düzenli olmayan bir lipozom transfeksiyon reaktif kullanın. Bu lipozomal reaktife benzer bir şekilde çalışır, ancak etkili transfeksiyon için gerekli DNA miktarı önemli ölçüde azalır. Bu, daha yüksek hücre yaşamını sağlar (aşağı yukarı 80-90% 60, elüsyon için% lipozom tepkin madde ile karşılaştırıldığında) daha düşük transfeksiyon verimi (% 60). Son olarak, kontrol HEK293 ya α1 sayısı / β2 / γ2 HEK293 nöron kültürleri ile ilave ifade eden hücrelerin optimize edilmesi gerekmektedir. Onlar çok nadir olur çünkü çok az hücre ekleme, HEK293 hücreleri ve nöronlar arasındaki temasların başarılı analizini uzlaşma. Tersine, çok fazla HEK293 hücrelerinin eklenmesi birkaç saat içinde nöronal hücre ölümüne neden olur. Embriyonik orta dikenli nöron kültürleri ideal embriyonik 15 yaş disseke striyatal doku kullanılarak hazırlanmış olmalıdır - Ancak 17. sık sık embriyolar optimal yaşında biraz daha genç veya daha yaşlı olduğunu olur. Bu durumda, bu durum nöron sayısının kültür tohumlanmış olacakdeğiştirilebilir olması gerekir. E15 daha küçük olan bir ince E17 optimum hücre hayatta kalmasını garantileyen, daha yüksek bir yoğunlukta ekildi gerekebilir daha eski olan doku iken, biraz daha düşük bir yoğunlukta ekildi gerekebilir. Ayrıca, sitosin arabinosid (ARA-C) yaşlı dokuda daha fazladır glia büyümesini önlemek için, daha eski kültürlere ilave edilmesi gerekebilir. Ko-kültürler oluşturulurken, yukarıda belirtildiği gibi, bu transfekte edilmiş HEK293 ya α1 / β2 / γ2 HEK293 ifade eden hücrelerin optimum sayısı plaka önemlidir. Bununla birlikte, bunun nedeni hayatta kalmak farklılıkları, her bir hücre hattı için bu belirlemek için gerekli olabilir. Bu koşullandırılmış ortam nöronal çok seyreltilmez sağlar ve tipik olarak 50 ul maksimum hacimde 30,000 hücre, daha önce nöronal kültür ortamında 500 ul ihtiva eden bir 24-yuvalı tabak, her bir oyuğuna ilave edilmelidir koşullar, bu Her içinde iyi, örneğin oldukça sabit kalır </em&gt; Büyüme faktörlerinin konsantrasyonu. Iyi hacimleri her fazla 50 ul ekleyerek genellikle nöronlar öldürecekti. Ko-kültür tekniğin en önemli dezavantajlarından biri, nöronal kültürler nöron normal mikro-çıkarılır ve normal anatomik organizasyonu kuramadý edilmiş olduğu anlamına gelir, bir tek tabaka olarak yetiştirilen ayrışmış hücrelerden oluşturulmuş olmasıdır. Bu nedenle sinaps gelişmenin ilk aşamalarını etkileyebilecek diğer hücrelerden uygun bağlantıları, giriş ve salgılanan molekülleri yoksundur. Örneğin, in vivo orta dikenli nöronlar yoğun bu girişler striyatal doku diseksiyonu sırasında zarar görmesinden dolayı Glutamaterjik sinapslar oluşturmak yok bizim nöronal kültürlerde, ancak, korteks, talamus ve diğer beyin bölgelerinde 34 Glutamaterjik girdiler ile innerve. Ne kültürlenmiş orta spinal nöronlarının fonksiyonel glütamaterjik sinapslarda büyük olmaması affects GABA A R&#39;leri ifade birbirleriyle ve / veya HEK293 hücreleri ile GABA&#39;erjik sinaps oluşturmak için kendi yetenek açık bir soru kalır. Bu soru, kolayca kortikal glutamaterjik nöronlar böylece onları 35 önceden HEK293 hücrelerine eklenmesinden fonksiyonel sinaps oluşturmak için izin birlikte orta spinal nöronların kültürlenmesi ile ele alınabilir. Alternatif bir yaklaşım, olgunlaşması ve sinaps oluşumu için önemli olabilir hücre mimarisini bazı korumak organotipik kesit kültürlerinde dayanan bir ko-kültürü modeli tasarım yaklaşımları olacaktır. Ancak, Organotipik dilim kültürleri burada yapılan analiz tehlikeye düşürebilecek yoğun ve heterojen neuropil var. Bu, yeteri kadar yüksek bir yüzey ekspresyonunu 30 belirli bir sinaps oluşumu için gerekli olmadığı görülmüştür, ancak ko-kültür deneyleri kullanılarak bir diğer önemli dezavantajı, GABA A TL bu nöronlar gibi toplaşmamıştır: HEK 293 hücreleri yüzeyinde ifade olmasıdır. Örneğin, rOdent beyin ve hipokampal kültürlerde, α1 GABA A, R&#39;nin alt birim arasında piramit şeklindeki hücreler her postsinaptik etki çoğu GABA sinapslar içinde bulunur. Ancak, α2 özellikle somata üzerindeki sinapslar ve dendritler bir alt kümesi bulunur ama immunofloresans ve elektron mikroskopisi 36 bildirdiği gibi son derece akson ilk segmentinde zenginleştirilmiştir. Eş kültürlerinde sinaps oluşumu hala güvenilir bir şekilde tespit edilebilir olduğu göz önüne alındığında, 30 analiz, bu HEK293 hücrelerinin hücre yüzeyinde GABAA Rs yoğunluğu sinaptik olan bu reseptörlerin yoğunluğundan daha benzer ya da daha yüksek olabileceğini düşündürmektedir nöronlarda kümeleri. Bu, en azından bu tür gephyrin gibi neuroligin sinaptik yapışma proteinleri, ve postsinaptik yoğunluğu proteinler, uygun bir şekilde monte edilmiş GABA A TL yeterli mevcut ise, eş kültürlerinde sinaps oluşumu için gerekli değildir bu yüzden kısmen üzere, açıklayabilir yoğunluğu. İyi GABA A Rs yapısal ve işlevsel heterojen olduğu belgelenen ve reseptör birim bileşimi onların hücre içi lokalizasyonu ve farmakolojik özelliklerini belirler. Alt birim hemen hemen sadece mevcut extrasynaptic GABA A Rs olduğu Örneğin, 2 alt birimlerin dahil GABAA Rs sinaptik lokalizasyonu için bir şart olduğu bilinmektedir. Sadece kombinasyonları αβ dahil reseptörleri de ağırlıklı extrasynaptic etki 12- 14 lokalize olduğu düşünülmektedir. Bu özgüllük Bizim eş-kültür sistemine muhafaza olup olmadığı kolayca, geçici olarak nöron kültürleri ile eklemeden önce, sabit bir şekilde α ve β alt-birimlerini eksprese eden HEK293 hücre çizgilerine 2 ya da alt birim cDNA&#39;lar transfekte edilmesiyle test edilebilir. Bu yaklaşımı kullanarak yapılan ön deneyler sinaptik iletişim kolaylıkla tarifhamesinden belirten, sadece 2 alt biriminin varlığında oluşmuş olduğunu ileri sürmüşlerdirin vivo olarak gözlenen, özgüllük, in vitro olarak korunmuş olması muhtemeldir (veriler gösterilmemiştir). Ayrıca, farklı α alt birimleri içeren GABA A Rs seçici presinaptik nöronların belirli tipleri ile oluşan sinaptik kişileri yerelleştirilmiş. Örneğin, globus pallidus olarak, α1-GABA A TL genel striatopallidal (STR-GP), sırasıyla, dendrit ve orta spinal nöronların somatik bölgelerinde yer almaktadır palliopallidal (GP-GP) sinaps, bulunur. Α3-GABA A Rs orta dikenli nöronların perisomatic bölgelerde bulunan ve bu nöronların distal dendritlerde bulunan ve striatum 32 girişlerine tarafından öncelikle temas α2-GABA A Rs ederken, yerel GP akson teminatlar ile temas ettirilir. Sinapsların ve farklı nöronal bölümlerinde farklı belirli α alt birimlerinin sentezlenmesi, aynı zamanda, Hipp gibi diğer beyin bölgelerinde ortaya konmuşturocampus 21 ve 18,20 neokorteks. Bu bulgular spesifik inhibitör sinapslar beyinde nasıl oluştuğunu olarak soruyu. Presinaptik terminal belirli bir tip yapışma temas noktaları içine belirli GABA A R alt tiplerinin yerleştirilmesini neden mi? Reseptörleri plazma zarı ekleme belirli bir kökeni aksonal terminallerinin yapışması için bir ön koşul olan kendi alt-birimi bileşimi göre, spesifik hücre içi yerle kaçırılan mı? Bugüne kadar, bu sorular cevapsız kalır. Bu tür ko-kültür model sistem olarak indirgenmiş modeli sistemlerinde kullanımı, sistem önemlisi, DNA yapılan ve reaktifler uygulama transfeksiyonu kolayca uyum sağlar ve bu nedenle, bu karmaşık sorulara cevap başlatmak için izin, canlı hücre görüntüleme analizi için de uygundur 30. Bu nedenle, bu model sistemi kullanarak bildiğimiz GABA bir Rs farklı türleri dahil olmak üzere tek tek moleküller, rolü test başlayabilirn sinaptik kişileri mevcut olması. Bir başka avantaj dakika içinde sonrası hızlı bir şekilde, bu model sistemi formunda sinaps, deney süresini azaltmak olmasıdır. Benzer ko-kültürü modeli sistemleri, başarılı bir şekilde yeni synaptogenic molekülleri 27,37,38 taranması için geçmişte kullanılmıştır. Merkezi sinir sistemi nasıl geliştiğini anlamak, olgunlaşır ve örnek davranış veya biliş için kontrol çok girift nöronlar arasındaki bağlantıları oluşturmaktadır, temel öneme sahiptir. Bu uzak esas ancak gelişimi esnasında tanıma ve hücre-hücre iletişiminin bireysel aşamalarını düzenleyen moleküler mekanizmaların ortaya koymayı ile elde edilir. Nedeniyle saf karmaşıklığı, Bu bir çok selüler etkileşimlerin moleküler ayrıntıları şu sadece düşürülmüş sistemleri hassasiyetle incelenebilir. Bununla birlikte bu proteinlerin çoklu kombinasyonlar sentezleyen ve nasıl inceleyerek bu sistemlerin karmaşıklığını artırmak içinbunlar, örneğin, genetik silme yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında bazı avantajlara sahiptir etkileşim. Bir gen silme etkilerinin kesin yorumlanması Genellikle, özellikle gelişmekte olan beyinde, orijinal lezyonların maskeleme etkilerini telafi eden mekanizmalarla bağlantılıdır değişikliklerden tehlikeye olmasıdır. Burada anlatılan basit ama bilgilendirici ko-kültür tekniği sinaps oluşumu GABA A Rs yapısal rolünün bir keşif izin ve GABA A R ve diğer hücre yapışma molekülleri ve / veya sinaptik matriks proteinleri birbirleri ile etkileşim nasıl araştırmak için bir olasılık açtı sinaptogenez sırasında. Sinaptik matriks proteinleri son zamanlarda Glutamaterjik sinaps oluşumu 39 önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir ki verilen özel bir öneme sahiptir. Onlar &#39;normal ve rehberlik moleküler mekanizmaları bilgimizi ilerletmek için potansiyele sahip çünkü ko-kültür modelleri daha da geliştirilmesi önemlidir# 8217; beyin gelişimi ve dolayısıyla bu mekanizmaları epilepsi, şizofreni, otizm spektrum bozuklukları ve diğerleri gibi birçok nörogelişimsel hastalıklar, değişmiş nasıl anlayışımızı artırmak.

GABA en bol uyarıcı nörotransmiter glutamat 1 önceki embriyonik beyinde bulunan erken nörotransmitterlerin biridir. Gelişimi sırasında, GABA eksitotoksisiteyi yaratmadan hücre çoğalması, göç ve nöral ağların oluşumunu düzenleyen önemli bir rol oynayan, olgunlaşmamış nöronlar depolarizes ve heyecanlandırıyor. Yetişkin beyin GABA A reseptör kanalları için olan ters potansiyel nedeniyle klorid hücre içi konsantrasyonundaki bir azalma daha negatif potansiyellere kaydırılır. Bu değişim, paralel, yukarı-regülasyonu hücre dışına klorür taşımaları potasyum klorür ko-transporter (KCC2), ve neden, ve aşağı regülasyonu olan sodyum-potasyum klorür transporter (NKCC1), ve ters etkisi 2. Beyinde, GABA, esas olarak, hızlı veya yavaş sinaptik önlenmesine aracılık eder GABA A ya da GABAB ya reseptörlerine, ilgili bağlananly. GABA A TL ayrıca heteropentamerik iyonotropik veya ligand-kapılı Cys-köprüsü iyon kanalları olarak da bilinen reseptörlerinin bir sınıfıdır. GABA iki molekül, bikarbonat iyonları, klorür iyonlarının ve daha düşük bir dereceye kadar geçirgen olan reseptörün aktivasyonu için gereklidir. Klorit iletimindeki artış sinaptik sonrası nöronu 3 aktive edilmesinde depolarize edici, uyarıcı etkinlikleri etkinliğini azaltmaktadır. GABA A Rs yapısal çeşitlilik uzun fonksiyonel ve farmakolojik özellikleri onların geniş belirlemede önemli bir faktör olarak kabul edilmiştir. Ortak olan α (1-6), β (1-3), γ (1-3), π, ε, δ ve θ 3: Doğal GABA A TL olarak sınıflandırılan çok sayıda izoformları ile alt üniteden oluşan hetero pentamerler olan Büyük bir N-terminali hücre-dışı alanını, dört transmembran (TM) ve TM&#39;lerin 3 ve 4 4 arasında büyük bir hücre içi alanı içeren zar topolojisi.Bu alt birimlerinin genetik silinmesini taşıyan fareler doğumdan 5,6 sonra ölmek için β3 ve γ2 alt birimleri, sinaptik inhibisyonu ve organizma hayatta kalmak için gerekli. Bunun aksine, α alt birimi tek tek izoformları, anksiyete, sedasyon, uyarılma ve diğerleri gibi farklı davranışlar ile bağlantılı beyin özel sinaptik bağlantıların fonksiyonu için önemli olan, fakat, ayrı ayrı, yaşam 7-9 için gerekli değildir. GABA A Rs güçlü sedatif, hipnotik, anksiyolitik ve benzodiazepinler, barbitüratlar, nörosteroidler ve anestezik 7,10,11 gibi antikonvülzan etkileri ile ilaçların çeşitli eylem ana yerleridir. Sinaptik GABA A TL tipik olarak γ2 altbirim (en yaygın β2 veya β3) iki β alt birimi ve iki α alt birimi (α1, α2, α3 veya α5) 12,13 ihtiva etmektedir. Extra-sinaptik reseptörlerinin baskın sınıfı, kombinasyon halinde δ alt ünitesinden oluşurİki α-birimden (α4 veya α6) ve iki β alt birimlerine (β2 veya β3), 14 ile. Plazma zarına aksonlar, dendrit ya soma ve sokulmasından GABAA Rs alt hücre lokalizasyonu, β-alt-birimlerinin 15,16 varlığına bağlıdır. Ancak, farklı GABA A R seçici eklenmesi spesifik α alt birimden (α1, α2, α3 veya α5) 7,17,18 varlığı ile iyi korelasyon sinapsların farklı türlerde alt tipleri. Önemlisi, farelerde α1 veya α2 alt biriminin silinmesi inhibitör sinapsların 19 de ultrastrüktürel değişikliklere neden olur. Bu GABA A sinaps oluşumunu düzenleyen doğrudan bir rol oynayabileceğini kendilerini rs düşündürmektedir. Kanıt GABA&#39;erjik sinaps gelişimi nöronal hedefleri de farklı inhibitör akson türleri ve öbeklendirilmiştir reseptörleri tarafından temas eden olaylar hassas bir şekilde koordine dizisi olduğunu gösteririnhibitör sinaps her sınıf seçici ve 17,20-22 işlevsel alıştırılır. GABA&#39;erjik sinaps spesifisitesinin temel ilke öncesi ve postsinaptik ortakları sinaptik bağlantıları başlatılması sırasında birbirini tanımasını nasıl olduğu sorusunu gündeme getirmektedir. İn vitro ko-kültür deneyleri, sinaps oluşumu bazı mekanizmaların çalışma ve bu işlem tek tek sinaptik geçişli proteinlerin rolünü test etmek için başarılı bir şekilde uygulanmıştır. Sinaps oluşumu ve olgunlaşması aracılık ettiği iki-yönlü olarak işlev gören ortak bir şekilde trans-sinaptik etkileşimli protein kombinasyonlarının biri Neurexins (Nrxns) ve Neuroligins (NLS) bulunmaktadır. Nrxns çok farklı izoform 23 sebebiyet veren kendi laminin neurexin-seks hormonu bağlayıcı protein alanları içindeki alternatif birleştirme sergileyen presinaptik proteinlerdir. Nrxns başka proteinlerle de etkileşime giren birlikte, NLS bunların her yerde postsinaptik pa olduğu düşünülmektedir24 rtners. Birlikte bu proteinler yakın ve sert appozisyonun 25 presinaptik ve postsinaptik membranlar tutarak katkıda bulunur. En bol iki izoformu uyarıcı ve inhibitör sinaps, sırasıyla 26 mevcut olan NL-1 ve NL-2 bulunmaktadır. Trans-sinaptik protein etkileşimlerini incelemek üzere tasarlanmış ilk ko-kültür modeli sistemlerinde biri, nöronal olmayan hücrelerin farklı kullanılan, örneğin aşırı ifade NL- üzere, insan embriyonik böbrek (HEK) 293 hücreleri gibi en yaygın olarak ölümsüz hücre çizgileri 2. Bu hücreler pontin nöronlarla kültürlenmiştir zaman, HEK hücre yüzeyine yakın presinaptik protein birikimi sinaps benzeri kontaktların oluşumunu gösteren gözlenmiştir. Bu ko-kültürlerde çözünebilir β-neurexin ilavesi Nrxns ve UL&#39;lere arasında, trans-sinaptik etkileşimleri sinaptik iletişim oluşumu 27 için gerekli olduğunu düşündürmektedir temas oluşumunu inhibe etmiştir. Ayrıca, geçici sentezlemeCOS β-neurexin ayrışan hipokampal glutamaterjik ve GABAerjik nöronlar postsinaptik proteini gephryin ve GABA A, R&#39;nin alt birimlerinin ile uyarılan ifadesi, birlikte kültürlenmiş bir (Cı V-1 (O rigin olarak) maymun ve S V40, genetik malzeme taşıyan), hücrelerin Bu iki hücre tiplerinde 28 arasındaki temas noktalarında γ2 ve α2. Sinaps oluşumunu araştırmak için kullanılan bir ko-kültür modeli başka örnek geçici GABA A R ile α2 / β3 / γ2 ve NL-2 ve hipotalamus nöronları 29 karışık bir nüfus alt birimleri transfekte HEK293 hücrelerinin, çıkıyor. Bu çalışma, NL-2&#39;nin ifadesi önleyici sinaps oluşumu için mutlak bir gereklilik olduğu sonucuna varıldı. Ancak, son ko-kültür çalışmasında, stabil olarak aktarılan α1 / β2 / γ2 GABA A HEK293 hücrelerinde TL fonksiyonel sinaps oluşturmak için yeterli olduğu bulunmuştur birlikte kültüre edildiğinde, GABAerjik MedEk-trans-sinaptik ya da sinaps sonrası yapışma proteinleri için gerek kalmadan yum dikenli nöronlar. NL-2 GABA A Rs 30 ile birlikte eksprese edilmiştir, ancak, sinaps oluşumu ve mukavemetinde önemli bir artış gözlenmiştir. Bu, bu ko-kültürü modeli sistemi, daha önce tarif edildiği model sistemler, en açık artan bir hassasiyet ve sinaptik kontak algılama güvenilirliği üzerinde avantajlara sahip olduğunu göstermektedir. Sinaptik temasların saptanmasında genel iyileşmeye katkıda bulunan iki önemli faktörler şunlardır: i), ayrı ayrı hücrelerin yüzeyi GABA A, Rt alt-birimlerinin yüksek ve tutarlı bir ifade ile stabil olarak transfekte edilmiş HEK 293 hücre çizgilerinin kullanılması. Bu tutarlılık, farklı ko-kültür koşulları arasındaki nicel karşılaştırmalar kolaylaştırır. ii) embriyonik striatuma 31 kültüre GABA&#39;erjik orta dikenli bir nöron saf nüfusun kullanımı allo komplikasyonları ve karışık nöronal nüfus ve kullanımından kaynaklanan belirsizlikleri kaldırırsi, örneğin, sinaps oluşumu sırasında birbiriyle mukayese edilebilir, en uygun olan, postsinaptik GABA A, R&#39;nin tiplerinin tespiti. Sinaps oluşumu öncesi ve postsinaptik hücre yapışması komplekslerinin içinde birçok trans-sinaptik sinyalleri içerdiği düşünülmektedir. Nedeniyle sinaptik sinyalleri ve hücre adezyon moleküllerinin sırf sayılar çift yönlü doğası, bu sinaps oluşumunda yer alan temel bileşenleri tespit etmek zordur. Bu nedenle, bir nöronal olmayan hücre içine tek bir hücre yapışma proteini transfekte (bu durumda, in vivo, GABAerjik orta spinal nöronların için iki en yaygın post-sinaptik hedefler, α1 / β2 / γ2 veya α1 / β3 / γ2 GABA A TL 32), büyük ölçüde postsinaptik yüzeyde temin şekilde trans-sinaptik sinyallerin karmaşıklığını azaltır ve sinaps oluşmasını teşvik bu proteinin etkinliğini hassas analiz edilmesine olanak sağlamıştır.

<table><tbody><tr><td>DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı)</td> <td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11960-044</td><td>37 ° C'de ılık su banyosu; Kullanmadan önce C</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15070-063</td><td>Tehlike: tahriş edici</td></tr><tr><td>FBS (Fetal Sığır Serumu)</td> <td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10106-169</td><td></td></tr><tr><td>Nöralbazal</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>21103-049</td><td>37 ° C'de ılık su banyosu; Kullanmadan önce C</td></tr><tr><td>B27 Takviyesi Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10X)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1X)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA 3.1(+) Memeli Ekspresyon Vektörü (Geneticin-selection)</td><td>Life Technologies</td><td>V790-20</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA 3.1(+) Memeli Ekspresyon Vektörü (Zeosin seçimi)</td><td>Life Technologies</td><td>V860-20</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA 3.1(+) Memeli Ekspresyon Vektörü (Higromisin-seçimi)</td><td>Life Technologies</td><td>V870-20</td><td></td></tr><tr><td>Kararlı HEK ve alfa; 1 ve beta; 2&gama; 2 satır</td><td>Sanofi-Synthelabo, Paris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1149</td><td></td></tr><tr><td>G418 disülfat tuzu (Geneticin)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>G5013</td><td>Tehlike: tahriş edici</td></tr><tr><td>Fleomisin D1 (Zeosin)</td> <td>Yaşam Teknolojileri</td><td>R25001</td><td></td></tr><tr><td>Higromisin B</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10687-010</td><td>Tehlike: toksik, tahriş edici ve aşındırıcı</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25300-054</td><td>37 ° C'de ılık su banyosu; Kullanmadan önce C. Tehlike: tahriş edici.</td></tr><tr><td>Poli-L-lizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6282</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>100 & mu; m Naylon Hücre Süzgeci</td><td>VWR</td><td>734-0004</td><td></td></tr><tr><td>Sitozin ve beta;-D-arabinofuranosid (Ara-C)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td>Tehlike: Tahriş edici</td></tr><tr><td>Şelatlama maddesi (Versene)</td><td>Life Technologies</td><td>15040-033</td><td></td></tr><tr><td>Lipozomal transfeksiyon tamponlama reaktifi (PLUS reaktifi) ile lipozomal transfeksiyon reaktifi (Lipofektamin LTX).</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15338-100</td><td>Alternatif transfeksiyon yöntemi: Effectene Reaktif</td></tr><tr><td>Lipozomal olmayan transfeksiyon reaktifi (Effectene reaktifi)</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>İndirgenmiş serum ortamı (Opti-MEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr>Cy5 <td>Sinaptik Sistemlere</td><td>konjuge fare anti-Sinaptotagmin antikoru</td><td>105311C5</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal A</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür (NaCl)</td> <td>VWR</td><td>27810.364</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1726</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Sığır Serum Albümini)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Gine domuzu anti-&gama; 2 GABAA reseptör antikoru</td><td>Prof. Jean Marc Fritschy</td><td>N/A</td> <td>(Zürih Enstitüsü, İsviçre) Fritschy, JM ve Mohler, H. J. Comp. Neurol. 359 (1), 154-194 (1995).</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5141</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-Glutamat Dekarboksilaz (GAD)65 antikoru</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB351</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-sinapsin antikoru</td><td>Sinaptik Sistemler</td><td>106-011</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-&beta; 2/3 antikor (BD17)</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB341</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-&alfa; 1 GABAA reseptör antikoru</td><td>Profesör Anne Stephenson</td><td>N/A</td> <td>(UCL Eczacılık Okulu, Londra) FA Stephenson et al. J. Comp. Neurol. 416 (2), 158-172</td></tr><tr>Cy5 antikoru <td>Merck Millipore</td><td>AP1085</td><td></td><td>ile konjuge keçi anti-kobay</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 antikoru</td><td>Merck Millipore</td><td>AP124S</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-fare Alexa Fluor 405 antikor</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A31553</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-fare Alexa Fluor 555 antikor</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A21422</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan Alexa Fluor 488 antikor</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Montaj reaktifi (Prolong Gold)</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td>Oda sıcaklığında kullanın</td></tr></tbody></table>

co-kültür model birleşmeyle gaba'erjik orta spiny nöronlar ve hek293 hücreler inhibitör synapse oluşumu istikrarlı bir şekilde gaba ifade a reseptörler

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

İnhibitör nöronlar, nöronal ağların dinamiklerini ve uzaysal-zamansal koordinasyonunu düzenlemek için merkezi sinir sisteminde hareket eder. GABA (γ-aminobütirik asit) beyindeki baskın inhibitör nörotransmiterdir. Sinapslar olarak bilinen son derece özelleşmiş hücreler arası bağlantılar içindeki inhibitör nöronların presinaptik terminallerinden salınır ve burada sinaps alan, postsinaptik nöronların plazma zarında bulunan GABAA reseptörlerine (GABAARs) bağlanır. Bu GABA kapılı iyon kanallarının aktivasyonu, klorür akışına yol açar ve bu nöronların aksiyon potansiyelleri üretme olasılığını azaltan postsinaptik potansiyel değişikliklere neden olur. 
Gelişim sırasında, farklı morfolojik, elektrofizyolojik ve nörokimyasal özelliklere sahip çeşitli inhibitör nöron tipleri, hedef nöronlarını tanıma ve spesifik GABAARs alt tiplerini içeren sinapslar oluşturma yeteneğine sahiptir. Nöronal hedeflerin bu seçici innervasyon prensibi, uygun sinaptik ortakların birbirlerini nasıl tanımladıkları sorusunu gündeme getirmektedir. 
Altta yatan moleküler mekanizmaları aydınlatmak için, embriyonik striatumdan izole edilen oldukça homojen bir nöron popülasyonu olan orta dikenli GABAerjik nöronların, farklı GABAA'yı eksprese eden stabil şekilde transfekte edilmiş HEK293 hücre hatları ile kültürlendiği yeni bir in vitro ko-kültür model sistemi kurulduR alt türleri. Sinapslar bu sistemde hızlı, verimli ve seçici bir şekilde oluşur ve miktar tayini için kolayca erişilebilir. Sonuçlarımız, çeşitli GABAAR alt tiplerinin sinaps oluşumunu teşvik etme yeteneklerinde farklılık gösterdiğini göstermektedir, bu da bu indirgenmiş in vitro model sisteminin, en azından kısmen, uygun sinaptik ortakların tanınması ve spesifik sinapsların oluşumu için gerekli olan in vivo koşulları yeniden üretmek için kullanılabileceğini düşündürmektedir. Burada, orta dikenli nöronların kültürlenmesi ve GABAAR'leri eksprese eden HEK293 hücre hatlarının üretilmesi için protokoller ilk önce açıklanır, ardından bu iki hücre tipinin ko-kültürde nasıl birleştirileceği ve sinaptik temasların oluşumunun nasıl analiz edileceğine dair ayrıntılı talimatlar verilir.

Bu nöron-HEK 293 hücre ko-kültür model sistemi için protokol ince optimum hücre yaşamasına izin ayarlı olmuştur. Bu sistemde, sinaps benzeri kontaktların oluşumu ve analiz, bir işlevsel reseptörü içine monte üç GABA A, R'nin alt birimlerinin sabit ve sürekli ekspresyonuna dayanır. Bu nöron kültürleri ile eklemeden önce, HEK293 hücre yüzeyinde alt birim ekspresyonunu test etmek için imüno sito kimyasal analiz kullanmak için önemlidir. Bu deneylerde, α1, β2 ve γ2 birimden (Şekil 1A) veya α1, β3 ve γ2 birimden (Şekil 1B), hücre yüzey ifadesi, bu alt-birimlerin hücre-dışı epitopuna bağlanabilir alt-spesifik antikorlar kullanılarak tespit edildi. HEK293 yüzeyinde, bu alt-birimleri arasında eş-lokalizasyonu yüksek derecede gösterilmiştir. GABA A yüzey ifadesi ve ko-lokalizasyonunu doğrulandıktan sonraHEK293 hücreleri, ko-kültürlerde R, alt-birimleri α1 / β2 / γ2 GABA A, R'nin alt birimleri ve 14 gün boyunca (in vitro 14 gün (DIV)) kültürlendi orta spinal nöronların eksprese eden HEK293 hücreleri kullanılarak hazırlanmıştır. Ko-kültür Hücreler sabitlendi, 24 saat boyunca kuluçkaya bırakıldı ve immünositokimya ve konfokal mikroskopi kullanılarak analiz edilmiştir. Kontakt Analizi GAD65-pozitif GABA'erjik akson terminalleri kontrol HEK293 hücreleri (Şekil 2A, 2B) ile tek tük kişileri oluştuğunu belirtti. 4 saat sonra tespit temasların sayısı HEK 293 hücre başına 7.3 ± 0.9, ve bu sayı kültür nöronları için HEK293 hücrelerinin ilave 24 saat sonra HEK 293 hücre başına 5.5 ± 0.5 bağlantıları (ortalama ± SEM) düşürülmüştür. Buna karşılık, GAD65-pozitif GABA'erjik akson terminalleri GABA A R'leri ifade HEK293 hücreler ile çok sayıda sinaps gibi kişileri kurdu. HEK293 hücrelerinin ekledikten sonra 4 saatte elde edilen kontakların sayısı HEK293 hücre başına 28.3 ± 4.7 idi ve bu sayının daha da artması oldu52.1 ± 6.3 D ko-kültür, 24 saat (Şekil 2A, 2B) HEK 293 hücre başına (ortalama ± SEM). Bu sinaps benzeri iletişim olup olmadığını belirlemek için, 'aktif,' yani veziküler verici serbest desteklenen bir vezikül-luminal etki alanına özel anti-synaptotagmin Cy5-konjüge edilmiş antikor, kuluçkalama 23 saat sonra eş-kültür ortamına ilave edildi. Bu antikor, sadece presinaptik sinir terminalleri içine dahil edildiği zaman, sinaptik vezikül lumen ve nörotransmitter serbest bırakılması sırasında, sinaptik aralık içinde hücre dışı sıvı arasında bir gözenek oluşur. Salınmasını takiben, gözenek Cy5-konjüge edilmiş floresan antikor vezikül içinde synaptotagmin bağlı synaptotagmin bırakarak kapatır. Bu şekilde, aktif nöro-ileticinin salıverilmesine yapan sadece veziküller antikor ile etiketlenir. Birkaç Bu deneylerde herhangi bir kumanda arasındaki temaslar HEK293 hücreleri ve orta dikenli nöron terminalleri olsaydı 'aktif &amp; #8217; HEK293 hücrelerinde presinaptik GAD65 / synaptotagmin floresans ve MCherry floresan (Şekil 3A) arasında eş-lokalizasyonu eksikliği ile gösterildiği gibi. Buna karşılık, birçok etkin 'iletişim orta spinal sinir terminalleri ve α1 / β2 / γ2 salgılayan GAD65 / synaptotagmin ve mCherry arasındaki eş-lokalizasyonu yüksek derecede ortaya koyduğu gibi, HEK293 hücreleri, spesifik olarak HEK293 hücrelerinde ifade edilen (arasında oluşmuştur Şekil 3B). Orta spinal nöronların ile HEK293 hücrelerinin sentezleyen GABA A, R'nin farklı bir alt tipi, aynı zamanda, in vitro olarak sinaps benzeri oluşumunu teşvik olup olmadığını test etmek için, adres ortak-kültürlenir α1 / β3 / γ2. Yine, kontrol HEK293 hücreleri ender ulaşan sinapsin pozitif presinaptik terminali ile temas alınan ± 0.48, 10.8 ko-kültür (Şekil 4A, sol, 4B) 'de, 24 saat sonra HEK 293 hücre başına temas (ortalama ± SEM). Bununla birlikte, HEK293 hücreleri sentezleyensinapsin pozitif presinaptik ko-kültür 24 saat sonra HEK293 hücre başına 25.3 ± 0.27 (ortalama ± SEM) kişileri ulaşan orta dikenli nöron terminalleri (Şekil 4A hakkı ile sinaps gibi rehber α1 / β3 / γ2 GABA A TL formu önemli ölçüde daha fazla, 4B). Onların gücü α1 / β2 / γ2 içeren GABA A R'leri kuvvetine göre daha düşük olsa bu α1 / β3 / γ2 GABA A TL HEK293 hücrelerinde ifade olduğunu gösterir, aynı zamanda sinaptik iletişim oluşumunu teşvik edebiliyoruz. Bu deneyler laboratuvarda geliştirilen ko-kültürü modeli sistemi bu işlemde GABAA Rs farklı alt tipi etkinliğinin sayısal in vitro sinaptik iletişim oluşumu analizinin yanı sıra değerlendirmesine izin verir olduğuna işaret etmektedir. Bu deneyler ayrıca, GABAerjik sinaps kritik fonksiyonel bileşenlerini olmanın yanı sıra bu GABA A Rs, göstermek önemli bir rol oynayabilirtanınması ve bağımsız bir şekilde, diğer sinaptik yapışma proteinlerinin önleyici sinirlerle ve uygun nöronal hedef hücreleri arasında olduğu, sinaptik temasların oluşum sürecinde. <img alt="Şekil 1," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52115/52115fig1highres.jpg" width="600"> Şekil 1. immünositokimyasal GABA A, R'nin α1 ekspresyon analizi / β2 / γ2 veya sabit bir HEK293 hücre hattında α1 / β3 / γ2. GABA A, R'nin alt ünitelerinin hücre dışı alanları tanıyan antikorlar, hücre yüzeyinde eksprese etiket reseptörleri kullanıldı. ( A), HEK 293 hücre hattı ifade α1 (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) ve yüksek düzeyde γ2 (Cy5). (B), HEK 293 hücre hattı ifade α1 (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) ve γ2 (Cy5)yüksek seviyelerde alt-birimlerini. Ölçek çubuğu:. 10 mikron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig1highres.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52115/52115fig2highres.jpg" width="600"> Şekil 2. GABA'erjik orta dikenli nöronlar ko-kültür HEK293 hücrelerinin ifade α1 / β2 / γ2- ile sinaps gibi kişileri oluşturur. (A), (sağ mavi,), floresan anti-GAD65 antikorları ile presinaptik terminallerin etiketleme (yeşil) ve veya GABA A, R'nin γ2 alt birimi (kırmızı sol olarak) mCherry ile HEK293 hücreleri, bunlar arasında eş-lokalizasyonu noktaları ortaya ko-kültür, 4 veya 24 saat sonra, sinaps benzeri kontaktların oluşumunu gösteren belirteçler. Ölçek çubuğu:. 10 mikron (B) sinaps gibi co kantitatif analizi rmal. Her a optik bölümünde göz ile sayılabilecektir DIC görüntüleme ve / veya ekspresyon MCherry, ve GAD-65 pozitif puncta (yeşil) ve HEK293 hücrelerinde yüzeyi arasındaki temasların sayısı ile ortaya çıktığı gibi, HEK293 hücreleri, şekil dayanarak belirlenmiştir Z yığın serisi (8-10) görüntüleme yazılımı kullanılarak hücre başına, ve kişiler / hücre sayısı olarak ifade edilmiştir. Grafik ko-kültür, 4 ve 24 saat sonra orta dikenli nöronların ve kontrol HEK293 hücreleri (açık gri) veya α1 / β2 / γ2-HEK293 hücreleri (siyah) arasındaki temasların sayısını gösterir (ortalama ± SEM, n = her 8 İki bağımsız deneyden gelen durum). Bu rakam Fuchs ve ark modifiye edilmiştir. (2013) 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> reklam / 52.115 / 52115fig3highres.jpg "width =" 600 "/&gt; Şekil 3. GABA A RS sinaps gibi GAD65 için pozitif orta dikenli nöron terminaller arasındaki ko-kültür 24 saat sonra oluşan kontakları (Alexa Fluor 405 mavi) ve (A) kontrol HEK293 hücrelerinin. Immunolabeling aktif sinaptik bağlantıları oluşumunu teşvik veya (B) HEK293-α1 / β2 / γ2 hücreler, geçici mCherry transfekte hem (kırmızı) inşa. Aktif iletişim presinaptik terminallerde hem vesikül lümen etki alanına özel anti-synaptotagmin antikoru (Cy5) ve GAD65 özgü antikor arasında eş-lokalizasyonu ile tanımlanır, ve MCherry HEK293 hücrelerinde ifade edilmiştir. Ölçek çubuğu:. 10 mikron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig3highres.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> igure 4 "fo: içerik-width =" 6in "src =" / files / ftp_upload / 52.115 / 52115fig4highres.jpg "width =" 600 "/&gt; Şekil 4. GABA'erjik orta dikenli nöronlar ko-kültür HEK293 hücrelerinin ifade α1 / β3 / γ2- alt birimi ile sinaps gibi kişileri oluşturur. (A), bir anti-synapsin (sol) antikorlarının (yeşil) ve kontrol HEK293 hücreleri veya α1 olan presinaptik terminallerin floresan etiketleme / β3 / γ2 HEK293 hücrelerinin ifade eden, her iki geçici olarak (kırmızı) mCherry ile transfekte edilmiş, noktalarını ortaya ko-kültür 24 saat sonra sinaps gibi temasların oluşumunu gösteren bu işaretlerin arasında co-lokalizasyon. Ölçek çubuğu: 10 mikron (B). Sinaps gibi temasların kantitatif analizi. HEK293 hücreleri MCherry ifade ile tespit edildi ve sinapsin bir pozitif puncta (yeşil) ve HEK293 hücrelerinde yüzeyi arasındaki temasların sayısı Z yığın serinin her bir optik bölümünde göz ile sayıldı (8-10) görüntüleme yazılımı kullanılarak hücre başına ve rehber / hücre sayısı olarak ifade edilir. Grafik orta dikenli nöronlar ve kontrol HEK293 hücreleri (açık gri) veya α1 / β3 / γ2-HEK293 hücreleri (siyah) ko-kültür 24 saat sonrası arasında temasların sayısını gösterir (ortalama ± SEM, n = 8-12 hücreleri iki bağımsız deneyden her koşul). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig4highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Ontojenliği sırasında inhibitör GABA&#39;erjik sinaps oluşumunu koordine moleküler mekanizmalar tam olarak bilinmemektedir. Bu işlemleri incelemek için, fonksiyonel GABA A reseptörleri eksprese eden stabil olarak transfekte edilmiş insan embriyonik böbrek 293 (HEK293) hücreleri ile birlikte kültürlendi embriyonik orta spinal GABAerjik nöronlar içeren bir ko-kültürü modeli sistemini geliştirdik.

Co-kültür Model Birleşmeyle GABA'erjik Orta Spiny Nöronlar ve HEK293 Hücreler inhibitör Synapse Oluşumu istikrarlı bir şekilde GABA ifade A Reseptörler

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Bu prosedürün amacı, in vitro GABAerjik sinaps oluşumunu kaplayan moleküler mekanizmaları incelemek için embriyonik, orta spinli nöronlar ve GABA A reseptörlerini stabil bir şekilde eksprese eden HEC 2 9 3 hücreleri arasında kokültür kurmaktır. Bu, ilk olarak stri AUM'nin E 16 ila 17 sıçan veya fare embriyosundan diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, stri AAL hücreleri kapak kızakları üzerine kaplanır.24 oyuklu bir plakada, sonraki HEC 2 9 3 hücreleri, GABA A reseptörlerini stabil bir şekilde eksprese eden bir M kiraz floresan indikatörü ile transfekte edilir. Son adımda, transfekte edilen hücreler, fiksasyondan 24 saat önce in vitro olarak 14 günde orta dikenli nöronlarla birlikte kültürlenir. Sonuç olarak, iki hücre alt kümesi arasındaki sinapsların oluşumu, immünofloresan ve konfokal mikroskopi ile görselleştirilebilir.GABAerjik sinapslar nöronal hücrelerin aktivitesini koordine ettiğinden ve merkezi sinir sistemindeki nöronal devrelerin birçok temel yapısal ve fonksiyonel unsurundan sorumlu olduğundan, bu tekniğin etkileri birçok nörolojik bozukluğun tedavisine kadar uzanır. Deneye başlamadan önce, 13 milimetre poliol lizin kaplı örtü fişlerini gece boyunca inkübe edin. 24 oyuklu bir plakada, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit ertesi gün nemli, fazla poliol lizini aspire edin ve örtü fişlerini steril suda iki on saniyelik ve iki beş dakikalık yıkama ile yıkayın.Daha sonra kapak fişlerini deney gününde aynı koşullar altında laminin içinde gece boyunca inkübe edin. İlk olarak, hamile bir fareyi sırtüstü pozisyonda etanol dezenfekte edilmiş bir diseksiyon pedine yerleştirin. Daha sonra cildi cımbızla sıkıştırın ve iç organları ve uterusu ortaya çıkarmak için karın çevresini cilt kası ve periton yoluyla kesin.Daha sonra, embriyonik gün 16 ila 17 embriyoyu uterustan çıkarın ve bunları soğutulmuş PBS içeren bir Petri kabına yerleştirin. Kafaları soğutulmuş HBSS ile yeni bir Petri kabına teslim etmek için embriyoları laminer akış başlığına aktarın ve ardından beyinlerin her birini incelemek için kavisli ve düz forseps kullanın. Beyinleri, soğutulmuş HBSS içeren yeni bir Petri kabında toplayın.Ve sonra her beyin için, iki serebral hemisferi ayırın ve meninksleri dikkatlice çıkarın. Daha sonra, hipokampus çizgisi boyunca kesin ve striatumu ortaya çıkarmak için korteksi geri soyun. Yarım kürenin ön tarafındaki doymuş beyaz bir yapı, korseden doku dahil etmekten kaçınmak için tabakayı çok dikkatli bir şekilde parçalara ayırır ve yeni bir Petri kabına yerleştirir.Soğutulmuş HBSS içeren: Kavisli forsepsleri kullanarak atoru çok küçük bir ila iki milimetrelik parçalar halinde kesin. Ardından, dokuyu steril 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarmak için ateşle parlatılmış bir makarna pipeti kullanın. Doku süspansiyonunun hacmini toplam bir mililitreye düşürün ve çözeltiyi dört ila altı kez daha pipetleyin, pipetin ucunu orijinal çapının yaklaşık% 30'una kadar biyolojik olarak parlatın, çözelti homojen göründüğünde çözeltiyi dört kez daha üçe katlayın, hücre bulamacına yerleştirilmiş, 100 mikrometrelik bir naylon süzgeçten steril bir 50 mililitrelik santrifüj tüpüne.Daha sonra, plakayı yedi kez 10 ila dört hücrenin kuvvetini 500 mikrolitre nöronal kültüre saydıktan sonra, orta güç 24 kuyulu bir doku kültürü plakasına iyi bir şekilde yerleştirin. Kuyu soldan sağa çalkalayın ve ardından hücreleri ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi 14 gün boyunca inkübe edin. Hücre kültürü ortamını aspire edin ve hücreleri altı oyuklu plakadan ayırmak için her bir kuyucuğu PBS ile iki kez kısaca yıkayın.Her bir oyuğa tripsin EDTA çözeltisi ekleyin ve reaksiyonu durdurmak ve söndürmek için 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksiti beş dakika boyunca nemle inkübe edin ve her oyuğa bir mililitre hücre kültürü ortamı ekleyin ve içeriği 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 440 kez G'de santrifüjleyin, Supinatı çıkarın ve peleti 500 mikrolitre nöronal kültürde tamamen yeniden süspanse edin. Tohum sayımından sonra hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek, nöronları içeren 24 oyuklu doku kültürü plakasında oyuk başına üç kez 10 ila dört hücre ve hücreleri dağıtmak için plakayı çalkalayın. Ko kültürleri 37 santigrat derecede nemlendirilmiş% 5 karbondioksit atmosferinde 24 saat inkübe edin.Bu görüntülerde, alfa bir, beta iki ve gama iki GABA AR alt biriminin veya alfa bir, beta üç ve gama iki GABA AR alt biriminin hücre yüzeyi ekspresyonu, HC 2 93 hücreleri üzerinde yüksek derecede kolokalizasyon ile gözlenmiştir. Burada. HC 2 93 hücreleri ile nöronal hücreler arasındaki hücreden hücreye temasların 14 günde in vitro analizi, GAD 65 pozitif GABAerjik Akson terminallerinin, alfa olanı ifade eden HEC 2 93 hücreleri arasında oluşan çok sayıda sinaps benzeri kontaklara kıyasla, kontrol HEC 2 9 3 hücreleri ile sadece sporadik temaslar oluşturduğunu gösterir, beta iki gama iki GABAA reseptörü. Bu deneylerde, sadece nörotransmitter salınımına aktif olarak katılan veziküller, antis synap toin antikor gerçekten görünümü ile etiketlendi.Kontrol HEC 2 9 3 hücreleri ile orta spining nöron terminalleri arasındaki temaslardan herhangi biri aktifse. Bu, presinaptik GAD 65 sinaptik tein floresansı ile HEC 2 93 hücreleri içindeki mCherry floresansı arasındaki kolokalizasyon eksikliği ile gösterilmiştir. Buna karşılık, besiyerleri bağlayan nöron terminalleri ile HEC 65 sinap Taman ve spesifik olarak HEC 2 93 hücrelerinde eksprese edilen M kiraz floresansı arasında yüksek derecede kolokalizasyon ile ortaya çıktığı gibi, HEC 2 93 hücrelerini eksprese eden alfa bir, beta iki gama iki gabaa reseptörü arasında birçok aktif temas oluşturulmuştur.Bu son görüntülerde, GABA AR'nin farklı bir alt tipini stabil bir şekilde eksprese eden HEC 2 93 hücreleri, orta dikenli nöronlarla birlikte kültürlendi. Analiz, 24 saat sonra terminaller üzerinde bir pozitif GABAerjik etki ve alfa bir, B, iki, üç, gama, iki eksprese eden HEC 2 9 3 hücreleri arasında çok sayıda sinaps benzeri temas oluştuğunu göstermektedir. Ko-kültürde, bu teknik, moleküler sinirbilim alanındaki araştırmacıların GABAerjik sinapsların oluşumunda rol oynayan çeşitli sinaptik adezyon moleküllerinin rolünü keşfetmelerinin önünü açma potansiyeline sahiptir.

inhibitory-synapse-formation-co-culture-model-incorporating-gabaergic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

In vitro MSS akson glia etkileşim araştırmaları için bir roman çok bölmesi nöron ko-kültür mikrosistem platformu geliştirdi. Platform altı paralel olarak bağımsız deneyler yapma yeteneğine sahiptir ve yeni geliştirilmiş bir makro / mikro hibrid imalat yöntemi kullanılarak imal edildi.

Çok bölmesi MSS Nöron glia Co-kültür mikroakışkan Platformu

Burada GABA hipokampal nöronlar bir reseptör yüzey lokalizasyonu ve, endositoz ölçmek için α-bungarotoksin bağlanmış flüoresan Alexa boya kullanımını göstermektedir. Α-bungarotoksin, plazma zar proteini endositik ticaretinin analiz elde edilebilir bağlanan kısa bir hücre dışı bir etiket taşıyan konstruktların kullanımı yoluyla.

GABA A reseptör Membran Yerelleşme ve Ticareti Eğitim için bir α-bungarotoksin Bağlama Sitesi Tag Kullanımı

Bu protokol nöron glia etkileşimlerinin bölümlere analizi için dolaylı nöron astrosit kokültürü açıklar.

Dolaylı nöron astrosit Coculture Deneyi: Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Nöron glia Etkileşimleri Detaylı Soruşturma Set-up

Burada, GABAA reseptörleri, fizyoloji ve farmakoloji bağlama, aktif bileşikler keşfetmek için protokolleri mevcut.

Bir Neurotransmission roman bileşikleri bir gama - aminobütirikasit reseptör oransal keşfi için yöntemleri yazın

Bu iletişim kuralı, ayrışmış birleştirerek insan pluripotent kök hücre elde edilen nöronlar için tekrarlanabilir bir yöntemi açıklamak için amacımız ve astrocytes 3D içine birlikte cocultures, bunlar yuvar ücretsiz kayan koşulları ve daha sonra korumak küre immunoanalysis ve multielectrode dizi kayıtları ile küre sinaptik devre etkinliğin ölçülmesi.

Sinaptik Microcircuit modelleme 3D Cocultures Astrocytes ve Neurons insan Pluripotent kök hücre ile

Bu protokol, bir hücre sıralama temel yöntem, floresan gabaergic veya glutamaterjik nöronların neokorteks ve Hippocampus gelen postnatal fareler veya farelerin arıtma ve kültürü için açıklar.

Floresans ile kurulan Purified Gabaerojik veya glutamaterjik nöronların primer hücre kültürü-aktif hücre sıralama

Burada, nöron ve astrositle zenginleştirilmiş kültürlerin veya embriyonik korteksten nöron-glia kültürlerin kurulmasını sağlayan, yüksek verim ve tekrarlanabilirlik ile özel kültür ortamı nı kullanarak basit bir yaklaşım salıyoruz.

İskemide Nöron-Glia Etkileşimlerinin Rolünü Nörade İncelemek İçin Hücre Kültürü Modeli

Burada, dev bir ankyrin-G'nin yokluğu nedeniyle önceden monte edilmiş AIS'den yoksun hipokampal nöronların akson başlangıç segmentlerinin (AIS) montajını ve yapısını nicel olarak incelemek için bir protokol tanımladık.

Axon İlk Segmentlerinin Montajını İncelemek için Birincil Kültürlü Hipokampal Nöronların Kullanımı

Omurilik insan kaynaklı pluripotent kaynaklı astrositleri ve nöronları ve elektrofizyolojik kayıt için ortak kültürlerini ayırt etmek için bir yöntem tanımladık.

ALS'yi Bölgesel Olarak Spesifik İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Astrositler ve Nöronlarla Modellemek için Bir Elektrofizyolojik Platformun Kurulması

Kullanıma hazır dondurulmuş bir nöron stoğu, sinaptik fonksiyonları değerlendirmek için güçlü bir araçtır. Burada, 96 delikli bir plaka kullanarak dondurulmuş stoktan kolay, düşük yoğunluklu bir birincil kültürü tanıtıyoruz.

Embriyonik Hipokampal Nöronların Dondurulmuş Stoğunu Kullanarak Kolay ve Tekrarlanabilir Düşük Yoğunluklu Birincil Kültür

Bu çalışma, DNA'dan protein fonksiyonuna ve nöral davranışa kadar uzanan çok ölçekli bir çerçeve sunmaktadır. GABAA reseptör alt biriminde öngörülen patojenik mutasyonları araştırmak için yeni bir yaklaşım sunar ve patojenik olarak tahmin edilen epileptojenik mutasyonların ve proksimal mutasyonların CA1 piramidal nöron modeli üzerinde benzer etkiler üretebileceğini varsaymaktadır.

Hipokampal Piramidal Nöronlardaki Rolleri İçin Pozisyona Özgü GABAA Reseptör Alt Birimi Yanlış Algılama Varyantlarının Tanımlanması ve Sınıflandırılması

Keşfedin GABAerjik sinaps oluşumunu in vitro ortamda embriyonik orta spiny nöronlar ve GABA A reseptörü ifade eden HEK293 hücreleriyle kurulan ortak kültür modeli kullanarak. Bu yöntem sinaptik etkileşimleri görselleştirmeyi sağlar.

Co-kültür Model Birleşmeyle GABAerjik Orta Spiny Nöronlar ve HEK293 Hücreler inhibitör Synapse Oluşumu istikrarlı bir şekilde GABA ifade A Reseptörler (Video) | JoVE Journal

Co-kültür Model Birleşmeyle GABA'erjik Orta Spiny Nöronlar ve HEK293 Hücreler inhibitör Synapse Oluşumu istikrarlı bir şekilde GABA ifade_A Reseptörler

Daha fazla video keşfet