Name: Batı Nil Virüsü Mutant Soy Enfeksiyon MyD88-aracılı Hücresel Bağışıklık Tepki Vitro Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Öğrenin, West Nil Virüsü enfeksiyonuna karşı T hücresi yanıtlarını dendritik hücreler ve akış sitometrisi kullanarak in vitro ölçme yöntemlerini. Bu teknikler, hücresel bağışıklık araştırmalarında güvenli ve verimli alternatifler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, NIH'nin T.W.'ye (R01AI072060 ve R01AI099123) verdiği hibelerle desteklenmiştir. G. Xie, Sealy Aşı Geliştirme Merkezi Doktora Öncesi Bursu tarafından desteklendi. Dr. Richard Flavell'e (Howard Hughes Tıp Enstitüsü, Yale Üniversitesi Tıp Fakültesi, New Haven) ve Dr. Shizuo Akira'ya (Osaka Üniversitesi, Japonya) MyD88–/– fareleri sağladıkları için ve Dr. Y Cong'a (UTMB, Galveston) OTII transgenik fareler sağladıkları için teşekkür ederiz.

Tüm hayvan deneyleri Texas Tıp Şubesi Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. Enfekte-Sigara ve BNV ile enfekte fareler ile DH&#39;lere 1. izolasyonu <ol><li> Yaş ve cinsiyet maç 6-10 haftalık, vahşi tip C57BL / 6 (B6) ve MyD88 - / - fareler. Periton boşluğu içine (ip) ve Batı Nil Virüsü NS4B- P38G mutantının 500 plak oluşturan birim (pfu) ile inoküle. / - - CO 2 ile fareler gün 3 sonrası enfeksiyon, B6 ve MyD88 euthanize. Kontroller olarak her iki grupta da enfekte olmayan fareler kullanın. Her gruptan üçer fare kullanın. </li><li> Islak% 70 etanol kullanılarak kurban farenin sol tarafındaki kürk ve ön ve arka bacaklarının arasına yarım hakkında, farenin sol tarafındaki kürk kesip. Vücut boşluğu açmak kesin. Forseps kullanarak dalak çıkarın. RPMI ile Petri kabındaki dalak yerleştirin. </li><li> Göre anti-CD11c manyetik boncuk kullanılarak dalak DC&#39;leri izole edinüreticinin talimatları. </li></ol> 2. Arıtma ve OTII Transgenik Farelerde T hücrelerinin Etiketleme <ol><li> Bir naif OTII fare Hasat bir dalak Yukarıda adım 1.2 tarif ve iki slaytlar buzlu uçları arasında dalak homojenize olarak. 14 ml RPMI orta kadar ekleyin, bir 15 ml konik tüp hücre süspansiyonu aktarın. Süspansiyon 5 dakika oturup yeni bir 15 ml konik tüp bunun 13 ml aktarmak edelim. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak bir CD4 + T hücresi izolasyon kiti kullanılarak dalak CD4 + T hücreleri izole edin. </li><li> 50 ml&#39;lik bir konik tüp içine Aktarım hücreleri, PBS ile iki kez yıkanır. Süspanse ml başına 1 x 10 6 hücre,% 0.5 büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) içeren PBS içinde hücreleri ve CFSE 0.5 umol / ml ekleyin. Işıksız bir ortamda 10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> % 10 ısı ile etkisiz hale getirilen fötal sığır serumu, 5 ml soğuk tam bir ortam (RPMI-1640 ekleyin, 1/100 hacimantibiyotikler / antimikotikler, 1/100 hacim L-glutamin ve 1000 x 2-merkaptoetanol, 1 / 1,000 hacim) konuldu. </li><li> 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. Yıkama Hücreler bir kez PBS ile,% 2 PFA 0.2 x 10 6 etiketli CD4 + T hücreleri saptamak ve bir akış sitometresi üzerinde kazanır. KAKE bazal düzeyini belirlemek için bu örnek kullanın. Tam ortamda etiketli hücrelerin geri kalanını yeniden askıya. </li></ol> Batı Nil Virüsü ile enfekte Fareler DCler ile 3. Ortak kültür OTII T hücreleri <ol><li> Kültür 2 x 10 OTII farelerin 5 saflaştırılmış CD4 + T hücreleri, tek başına ya da vahşi tip veya MyD88 saflaştırılmış DCler ile - / - OVA tortu 323-339, bir 24 oyuklu bir plaka içerisinde fareleri (2 x 10 4) (1 g oyuk başına 1 mi tam bir ortamda / ml). </li><li> 5 gün boyunca 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. Hücreleri, (% 1 FBS, PBS) FACS tamponunda iki sefer yıkama ve 0.25 mi% 2 PFA sabitleyin. Vortex hemen. </li></ol> In Vitro 4. Akım Sitometri Analizi &lt;/ Em&gt; T Hücre Astar <ol><li> Edinimi için, çift yazılım simgesi flow sitometri tıklayın. SSC-A 200.000 FSC-A 200.000&#39;den ve 0 lineer FSC-A vs doğrusal SSC-A yoğunluk arsa, kanalları seçmek için 0. (Şekil 1A bakınız P2) Ardından, canlı hücreleri üzerinde bir kapı oluşturun. </li><li> KAKE floresan yoğunluğunu analiz etmek, FL1 kanalı için histogramı açmak ve kapı nüfus 20.000 olayları kazanır. Tek başına kültürlenen (Şekil 1A) OTII hücreleri için örnekler üzerinde bir işaret ayarlayın. </li><li> Vahşi tip DCler (Şekil 1B) veya MyD88 birlikte kültürlenmiş OTII hücreleri için numuneler elde edin - / - DCler (Şekil 1C) benzer bir şekilde. </li></ol> 5. izolasyonu ve sitokin tahlilleri için splenositler uyarılması <ol><li> Ste de anlatılan ile aynı prosedür kullanılarak Batı Nil Virüsü NS4B-P38G mutant farelere - / - B6 ve MyD88 Infects 1.1. Günde 30 sonrası enfeksiyon anda, yeniden meydan günlerinde 8 ve ikincil enfeksiyonu takiben 21 ilköğretim sonrası Batı Nil Virüsü enfeksiyonu veya 4. günde de yabani tip BNV suşu ip 2000 PFU&#39;nun ile fareler hayatta, dalak toplanması için CO 2 ile fareler euthanize . NOT: Her bir zaman noktası için, grup başına 2-3 fare kullanıldı. </li><li> Aşama 1.2 ve adım 2.2 tarif edildiği gibi dalak tek bir hücre süspansiyonu yapmak. Hemasitometre kullanarak hücrelerin sayısı 10 ml tam orta bunları yeniden askıya. </li><li> 2.5 x 10 6 hücre / ml komple ortam ile hücrelerin seyreltin. 1.5 ml mikro santrifüj tüpü içinde splenositlerin 1 ml ilave edilir. </li><li> DMSO içinde 1 mg / ml Batı Nil Virüsü özgü NS4B ve E peptidler (SSVWNATTA ve IALTFLAV), CD8 + T hücreleri simüle sulandırmak. CD4 + T hücrelerinin uyarılması için, DMSO içinde 1 mg / ml Batı Nil Virüsü özgü NS3 ve E peptidler (RRWCFDGPRTNTILE ve PVGRLVTVNPFVSVA) seyreltin. Followe hücrelere peptidlerin 10 ul ekleBrefeldin bir solüsyonun 1 ul d. Kontroller olarak peptidler, tedavi olmaksızın hücreleri kullanır. Hücreleri karıştırın. </li><li> Tüpün kapağının bir 18 G iğne ile iki delik Punch. 5 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li></ol> 6. Hücre içi Sitokin Boyama <ol><li> Yeni bir mikro-santrifüj tüp hücreleri aktarın. 300-400 xg&#39;de 5 dakika boyunca hücreleri Spin ve süpernatant kapalı dökün. 300-400 xg&#39;de 1 ml FACS tampon, spin 5 dk ekleyin ve 120 ul FACS tamponu ile pipetleme hücreleri askıya yeniden. </li><li> 2 ul Fc engelleyici ilave edin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında kuluçkalayın. Her bir tüpe 1 mL FACS tampon ekleyin. Spin 300 5 dk - 400 x g. </li><li> 300 ul FACS hücreleri askıya Yeniden tampon ve üç tüpler (tüp başına yaklaşık 0.8 x 10 6 hücre) bölebilirsiniz. Tablo 1 &#39;de gösterildiği gibi, fare IgG-PE boyaması için her bir kültür durumda ilk tüp tutar. İkinci boru için, CD4, anti-CD4 APC 3 ul peptit ile muamele edilmiş hücreler, 3 μCD8 peptidler ile muamele edilmiş hücreler ya da peptidler, tedavi olmaksızın hücrelere iki eden antikorlara karşı anti-CD8 FITC l. Tazminat boyama üçüncü tüp kullanın. Her kültür koşulu için, APC-konjuge CD4, FITC konjuge CD8 veya FL1, FL2 ve FL4 kanalları için tazminat kontrolleri gibi yalnız PE etiketli CD3 antikorları (tüp başına 3 ul) ile boyanmış hücrelerin üç tüpleri kullanın. </li><li> Kısaca girdap hücreleri. 20 dakika boyunca buz üzerinde boş ve ışıktan korur. 1.4 mi FACS tampon ekleyin. 300-400 xg&#39;de 5 dakika Spin ve süpernatant kapalı dökün. </li><li> Hücre pelet (veya kısaca girdap) bozmaya çalkalayın. 250 ul sabitleme / permeabilizasyon solutionby pipetleme hücre pelet yeniden askıya. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir ve ışıktan korur. </li><li> 1.2 mi FACS tampon ekleyin. 300 ul FACS tampon 300-400 xg ve tekrar süspansiyon hücreleri de Spin 5 dakika. NOT: Bu noktada, hücreler u ışıktan daha fazla işlenmek üzere bir BL2 laboratuara aktarılır ve saklanan bir buzdolabı ve korunabilirÜç gün p. </li><li> 500 ul FACS tampon ekleyin. Sıkma 1x permeabilizasyon / yıkama tamponu içinde 500 ul 300-400 xg ve tekrar süspansiyon hücreleri de 5 dak. Sıkma 300-400 x g&#39;de 5 dak. </li><li> Daha önce ayrılmış bir tüp içinde aşama 6.3 ve 3.5 ul fare IgG-PE CD4 antikor ve / veya CD8 T hücresi belirleyicileri ilave boruya 3.5 ul anti-IFNy-PE eklemek, 100 ul 1x Perm / Wash hücrelerin yeniden askıya ve buz üzerinde 25 dakika süre ile, IgG kontrolü için ışıktan koruyunuz. 1x permeabilizasyon / yıkama tamponu 1.4 ml ekleyerek hücreleri yıkayın. Sıkma 300-400 x g&#39;de 5 dak. 1.4 ml 1x permeabilizasyon / yıkama tamponu ekleyerek yıkama adımı tekrarlayın. </li><li> 300-400 xg&#39;de 5 dakika Spin ve süpernatant süzün. FACS tampon 1.4 ml ilave edilmesi ve nihai edinimi için FACS tampon 400 ul yeniden askıya hücreleri yıkayın. </li></ol> Hücre içi Sitokin Boyama 7. Akım Sitometri Analizi <ol><li> Adım 4.1 aynı satın alma ayarları kullanın. Create canlı hücreler üzerinde bir kapı (P2, Şekil 2A &#39;ya bakınız). Her grup için tazminat tüpler kullanılarak gerilimleri ayarlayın. </li><li> Açık iki yeni nokta araziler, bir vs FL1 için toplanan verileri görüntülemek için. FL2 (CD8 vs. IFN-γ), diğeri vs FL4 için toplanan verileri görüntülemek için. FL2 (CD4 vs. IFN-γ). Her numunenin kapılı nüfus için 50.000 olayları Edinme. </li></ol>

<ol><li>Campbell, G. L., Marfin, A. A., Lanciotti, R. S., Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">West Nile virus.</a> Lancet Infect. Dis. 2, 519-529 (2002).</li>
<li>Welte, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+an+attenuated+West+Nile+virus+NS4B-P38G+mutant+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Immune responses to an attenuated West Nile virus NS4B-P38G mutant strain.</a> Vaccine. 29, 4853-4861 (2011).</li>
<li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+control+of+the+adaptive+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor control of the adaptive immune responses.</a> Nat. Immunol. 5, 987-995 (2004).</li>
<li>Akira, S., Hemmi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+pathogen-associated+molecular+patterns+by+TLR+family%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR family.</a> Immunol. Lett. 85, 85-95 (2003).</li>
<li>Xie, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+West+Nile+virus+NS4B-P38G+mutant+strain+induces+adaptive+immunity+via+TLR7-MyD88-dependent+and+independent+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">A West Nile virus NS4B-P38G mutant strain induces adaptive immunity via TLR7-MyD88-dependent and independent signaling pathways.</a> Vaccine. 31 (38), 4143-4151 (2013).</li>
<li>Fang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammadelta+T+cells+promote+the+maturation+of+dendritic+cells+during+West+Nile+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">gammadelta T cells promote the maturation of dendritic cells during West Nile virus infection.</a> FEMS Immunol. Med. Microbiol. 59, 71-80 (2010).</li>
<li>Silva, M. C., Guerrero-Plata, A., Gilfoy, F. D., Garofalo, R. P., Mason, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+activation+of+human+monocyte-derived+and+plasmacytoid+dendritic+cells+by+West+Nile+virus+generated+in+different+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Differential activation of human monocyte-derived and plasmacytoid dendritic cells by West Nile virus generated in different host cells.</a> J. Virol. 81, 13640-13648 (2007).</li>
<li>Shrestha, B., Samuel, M. A., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+Cells+Require+Perforin+To+Clear+West+Nile+Virus+from+Infected+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">CD8+ T Cells Require Perforin To Clear West Nile Virus from Infected Neurons.</a> J. Virol. 80, 119-129 (2006).</li>
<li>Wang, Y., Lobigs, M., Lee, E., Mullbacher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+cells+mediate+recovery+and+immunopathology+in+West+Nile+virus+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">CD8+ T cells mediate recovery and immunopathology in West Nile virus encephalitis.</a> J. Virol. 77, 13323-13334 (2003).</li>
<li>Plebanski, M., Katsara, M., Sheng, K. C., Xiang, S. D., Apostolopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+measure+T-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Methods to measure T-cell responses.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 595-600 (2010).</li>
<li>Lyons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysing+cell+division+in+vivo+and+in+vitro+using+flow+cytometric+measurement+of+CFSE+dye+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution.</a> J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).</li>
<li>Kraus, A. A., Priemer, C., Heider, H., Kruger, D. H., Ulrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Hantaan+virus-containing+samples+for+subsequent+investigations+outside+biosafety+level+3+facilities%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Hantaan virus-containing samples for subsequent investigations outside biosafety level 3 facilities.</a> Intervirology. 48, 255-261 (2005).</li>
<li>Saxena, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hamster-derived+west+nile+virus+isolate+induces+persistent+renal+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl.+Trop.+Dis%22%5BJournal%5D)">A hamster-derived west nile virus isolate induces persistent renal infection in mice.</a> PLoS Negl. Trop. Dis. 7, 2275(2013).</li>
<li>Welte, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vgamma4%2B+T+cells+regulate+host+immune+response+to+West+Nile+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Vgamma4+ T cells regulate host immune response to West Nile virus infection.</a> FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 183-192 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

BNV bir BL3 patojendir. Nedeniyle güvenlik yönetmeliklerine, WNV-enfekte örnekleri ile immünolojik testler genellikle BL3 tesisleri veya gerçekleştirmek için daha uzun ve sıkıcı bir ekipman durumu ile sınırlıdır. Yeni bir çalışmada, biz Batı Nil Virüsü enfeksiyonu 5. sırasında hücre aracılı bağışıklık yanıtlarını incelemek için iki akış sitometri tabanlı yöntemler kullanılır. Analizlerde, Batı Nil Virüsü ile enfekte edilmiş hücreler,% 1-2 PFA doğrudan ya da% 4 PFA içeren sabitleme / permeabilizasyon çözeltisi...

Batı Nil virüsü (BNV), bir nörotrop, artı-hissedilen flavivirüs, gelişmekte olan bir halk sağlığı tehdidi olduğunu. Şu anda, hiçbir aşı beşeri 1 için onaylanmıştır. Yapısal olmayan (NS) 4B protein bir P38G yer değişimine bir zayıflatılmış Batı Nil Virüsü soyu, vahşi tip Batı Nil Virüsü NY99 suşu 2&#39;den farelerde hiçbir farelerde ölümcül bulunmuştur ancak daha yüksek doğal sitokin ve T hücresi tepkilerini teşvik ettiği bilinmektedir. NS4B-P38G mutant ile bağışıklık kazandırılmış fareler öldürücü doğal tipte Virüsü ile ikinci bir sorun korundu. Bu NS4B-P38G mutant ideal aşı adayı için uygun özelliklere sahip olduğunu göstermektedir. NS4B-P38G mutant yüksek koruyucu adaptif bağışıklığı hangi mekanizmalar henüz net olarak anlaşılamamıştır. Patojen ilişkili moleküler desenleri tanımaya Toll benzeri reseptörler (TLR), viral enfeksiyon karşı doğal bağışıklığın başlamasında önemli bir rol oynamaktadır. Çekirdek TLR sinyal yolu miyeloid farklılaşma birincil yanıt ge kullanırBirincil adaptörü 3,4 olarak ne 88 (MyD88). Yeni bir çalışmada, MyD88 sinyal farelerde 5 Batı Nil Virüsü NS4B- P38G mutant enfeksiyonu esnasında hücre aracılı bağışıklığın gelişiminde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Dentritik hücreler (DC&#39;ler), viral enfeksiyonun 6,7 sırasında birincil T hücresi tepkilerini başlatmak için benzersiz kapasitesini gösteren en önemli antijen sunan hücreler bulunmaktadır. CD4 + ve CD8 + T hücreleri, uzun süreli koruyucu bağışıklık katkı ve vahşi tip Batı Nil Virüsü enfeksiyonu 8,9 Aşağıdaki ana yaşaması için önemliyse her ikisi. İki immünolojik tahliller NS4B-P38G mutant amacıyla enfeksiyon bulaştırılan farelerde bu hücrelerin fonksiyonlarını belirlemek için bu çalışmada kullanılmıştır. - / - Farelerde İlk olarak, in vitro T hücre prime deney Batı Nil Virüsü ile enfekte edilmiş yabani tip ve MyD88 arasında DC&#39;lerin antijen sunan yeteneği karşılaştırmak için kullanılmıştır. Tahlil, naif CD4 &lt;duyarlılığını artırmak içinCFSE (WNV enfekte edilmiş farelerin 339 DCler saflaştırıldı ve karboksiflüoresein süksinimidil paskalya birlikte kültürlenmiş - destek&gt; + T hücreleri, 323 (OVA) peptidi tavuk ovalbümin için Vα2 / Vβ5 TCR ifade OTII transgenik farelerden izole edilmiştir OVA peptidi varlığında) -etiketli CD4 + T hücreleri. Ko-kültür içinde 5 gün sonra, hücreler hasat edilmiş ve paraformaldehit (PFA) ile tespit edilmiş ve akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. Çoğalma tahlilleri geleneksel bir 5-bromo-2&#39;-deoksiüridin (BrdU) veya toz haline getirilmiş timin deoxyriboside (3 HTdr) 10 arasında dahil edilmesi yoluyla gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, bu deneyler radyoaktif ve / veya BNV çalışmalarının yapıldığı biyogüvenlik düzeyi (BL) 3 tesislerde, özel ekipman ihtiyacı ya vardır. CFSE, daha yaygın hale imünolojik deneylerde kullandı vital boyanın flüoresan yoğunluğu seri yarılanmasına lenfosit çoğalmasının akış sitometrik analizi, boya daha stabil olduğu gibive eşit, hücrelere dahil flow sitometri ile kolayca tespit ve 11 radyoaktif olmayan bir. Tahlil, aynı zamanda, hücre bölünmesini belirlemek için yeteneği vardır. Batı Nil Virüsü çalışmalarda, bu tahlili kullanarak bir büyük avantajı,% 1-2 PFA ile enfekte olmuş hücrelerde tespiti, bir BL2 laboratuarda bir akış sitometresinde numune toplama sağlayacak WNV 12, etkisiz olmasıdır. Daha sonra, bir tadil edilmiş hücre içi sitokin boyama (ICS) prosedürü MyD88 NS4B-P38G mutantı ile enfekte olmuş farelerde Batı Nil Virüsü spesifik T hücre karşılıklarının düzenlenmesinde sinyalleme rolünü incelemek için kullanılmıştır. Bu tahlilde, enfekte farelerinden yalıtılmış splenositlerin Batı Nil Virüsü spesifik peptidler ile in vitro muamele edildi. Brefeldin bir hücre içinde sitokin tutmak için ilave edildi. 5 saat inkübasyondan sonra, hücreler toplandı, yıkandı ve T hücre alt-gruplar için boyandı. Hücreler daha sonra, PFA sabit geçirgenleştirildi ve interferon (IFN) -γ boyanmış ve akış sitometrisi ile analiz edilmiştir.Hücreler tespit ve PFA içeren permeabilizasyon tampon maddesi ile muamele edilmiş bir kez başka akış sitometrisi bazlı bir deneyde olduğu gibi, enfekte örnekleri daha fazla işleme ve analizi için bir BL2 laboratuara aktarılır. Birkaç yayınlanan çalışmalarda, biz WNV-enfekte farelerde 13,14 T hücresi efektör fonksiyonları ölçmek için ICS kullandık. Iyi kurulmuş oluyor rağmen, bu testin bir büyük dezavantajı prosedürü çok uzun ve BL3 tesisleri içinde yapıldığında alıcı daha fazla zaman olabilir olduğunu. Burada, mikro-santrifüj tüpü tabanlı ICS yöntem daha uygun, daha kolay devam etmek ve daha az zaman BL3 laboratuar içinde gerçekleştirilen zaman alıcı olduğu gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875</td><td>37 ° C'de ısınma & C</td></tr><tr><td>anti-CD11c manyetik boncuklar</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-001</td><td>üreticiyi takip edin S talimatları</td></tr><tr><td>anti-CD4 manyetik boncuklar</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-248</td><td>üreticiyi takip edin s talimatları</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>OVA kalıntısı 323-339</td><td>Genscript Corporation</td><td>RP10610</td><td></td></tr><tr><td>Peptitler</td><td>Proimmün</td><td>PC0AD-D</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A çözeltisi</td><td>BD Bioscience</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>Fare Fc Engelleyici</td><td>e-Bioscience</td><td>14-0161-85</td><td></td></tr><tr><td>APC konjuge CD4</td><td>e-Bioscience</td><td>17-0041-81</td><td></td></tr><tr><td>FITC-konjuge CD8</td><td>e-Bioscience</td><td>11-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>Fiksasyon/Geçirgenleştirme Çözeltisi</td><td>BD-Bioscience</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>Geçirgenleştirme/yıkama tamponu</td><td>BD-Bioscience</td><td>554723</td><td></td></tr><tr><td>anti-IFN&gamma;-PE</td><td>e-Bioscience</td><td>12-7311-82</td><td></td></tr><tr><td>Accuri akış sitometresi</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

batı nil virüsü mutant soy enfeksiyon myd88-aracılı hücresel bağışıklık tepki vitro analizi

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Farelerde, vahşi tip Batı Nil Virüsü daha yüksek doğal sitokin ve T hücresi tepkilerini bağlı bir zayıflatılmış Batı Nil virüsü (WNV), bir yapısal olmayan (NS) 4B-P38G mutantı. Son zamanlarda, miyeloid farklılaşma faktörü 88 (MyD88) sinyal Batı Nil Virüsü NS4B-P38G mutant enfeksiyon sırasında, ilk T hücresi uyarılması ve bellek T hücresi gelişimi için önemli olduğu gösterilmiştir. Bu çalışmada iki sitometri tabanlı yöntemler akış - Bir in vitro T hücre prime deneyi ve bir hücre içi sitokin boyama (ICS), - dendritik hücreler (DC) ve T hücre fonksiyonlarını değerlendirmek için kullanılmıştır. OTII transgenik farelerin, CD4 + T hücreleri etiketli - deneyi emişli T hücresi, hücre çoğalması karboksiflüoresein süksinimidil ester (CFSE) ile farelerin her iki grup DC&#39;lerin ko-kültür, aşağıdaki akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. Önemli ölçüde gelenek daha genel duyarlılık geliştirilmiş olan bu yaklaşım, CD4 + T hücreleri çoğalan yüzdesi doğru belirlenmesi sağlanırark radyoaktif reaktifler ile deneyleri. Bir mikrosantrifüj tüpü sistemi ICS protokolünün iki hücre kültürü ve sitokin boyama prosedürleri kullanılmıştır. Geleneksel doku kültürü plaka tabanlı sisteme kıyasla, bu değiştirilmiş prosedür biyogüvenlik düzeyi (BL) 3 tesislerinde gerçekleştirmek için daha kolay oldu. Ayrıca, WNV- enfekte olmuş hücreler BL3 dışındaki daha sonraki analiz etkin analizlerde içinde paraformaldehit ile işleme tabi tutuldu. Genel olarak, bu in vitro bağışıklık tahlilleri, etkili bir Batı Nil Virüsü enfeksiyonu esnasında hücre-aracılı bağışıklık karşılıklarının değerlendirmek için de kullanılabilir.

- / - OVA peptidlerinin varlığında veya yokluğunda, farelerde T hücresi priming tahlilde, CFSE etiketli, CD4 + T hücreleri, NS4B-P38G mutantı ile enfekte edilmiş yabani tip ve MyD88 arıtılmış DCler ile kültürlenmiştir. 5 gün negatif kontroller olarak kullanılmıştır için etiketli T hücreleri ya da OVA olmaksızın tek başına kültürlenmiştir. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, toplam T hücre FL1 kanal flüoresans yoğunluğu analizi için kapı edildi. işaretleyici DC'lerin ko-kültür olmadan ço...

Farelerde Batı Nil virüsü mutant enfeksiyonuna karşı dendritik hücrelerin antijen sunma kapasitesini ve antijene özgü T hücresi yanıtlarını ölçmek için iki akış sitometrisi tabanlı yöntem - bir in vitro T hücre hazırlama testi ve hücre içi sitokin boyama kullanıldı.

Batı Nil Virüsü Mutant Soy Enfeksiyon MyD88-aracılı Hücresel Bağışıklık Tepki Vitro Analizi

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Bu çalışmanın genel amacı, in vitro T hücresi hazırlama testi, dendritik hücreler veya West Nll virüsü ile enfekte farelerden saflaştırılmış dc'lerde Batı Nil virüsü enfeksiyonuna hücre aracılı immün yanıtı ölçmek için iki akış sitometrisi tabanlı immünolojik testi tanıtmaktır. Ova peptidi varlığında OT iki transgenik fareden saflaştırılmış naif CFSE etiketli T hücreleri ile bir ko-kültür. T hücrelerinin proliferasyon tepkisi daha sonra Batı Nil virüsü ile enfekte farelerden modifiye edilmiş hücre içi sitokin boyama testinde PLE sitleri, bir mikro santrifüj tüpünde Batı Nil spesifik peptitleri ile uyarılmış ex vivo bir biyogüvenlik seviyesi iki laboratuvarında akış sitometrisi ile analiz edilir ve daha sonra hücre içi sitokin üretimi için sürdürülür ve biyogüvenlik seviyesi iki laboratuvarında akış sitometrisi ile tüpte analiz edilir.Sonuç olarak, bu yöntemler, Batı Nil virüsü ile enfekte hayvanlarda T hücrelerinin aktivasyonunda spesifik sinyal yollarının rolünü incelemek için kullanılabilir ve biyogüvenlik seviye üç tesislerindeki performans süresini önemli ölçüde azaltır. Bu yöntem, batı N virüsü hücresel bağışıklığı hakkında bilgi sağlayabilse de, in vitro T hücresi hazırlama testi için diğer biyogüvenlik seviyesi üç patojene de uygulanabilir. Batı Nil virüsü ile aşılanmış vahşi tip C 57 siyah altı A, my D sekiz sekiz nakavt fareden splenik dendritik hücreleri izole ederek başlayın ve üreticinin talimatlarına göre anti CD 11 C manyetik boncuklarla enfekte olmamış hayvanları kontrol edin.Daha sonra T hücrelerini izole etmek için, bir OT iki fareden diseke edilen dalağı iki slaytın buzlu uçları ile homojenize edin, hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın, ardından 40 mililitrelik bir nihai hacme RPMI ortamı ekleyin. Hücrelerin beş dakika oturmasına izin verin ve ardından 30 mililitre supinvent'i 50 mililitrelik yeni bir konik tüpe aktarın. Daha sonra, CD dört pozitif T hücresini sıralamak için üreticinin talimatlarına göre bir CD dört pozitif T hücresi izolasyon kiti kullanın ve daha sonra toplanan hücreleri 50 mililitrelik bir konik tüpe aktarın ve ardından PBS'de iki yıkama yapın İkinci yıkamadan sonra, hücreleri PBS'de% 0.5 sığır serum albümini ile mililitre başına altı hücrenin yüzde biri ve 37 santigrat derecede CFSE'nin mililitresi başına 0.5 mikromolar ile inkübe edin 10 dakika sonra ışıktan, hücreleri beş mililitre soğukta inkübe edin, beş dakika boyunca buz üzerinde tam bir ortam.Daha sonra başka bir PBS yıkamasından sonra,% 2 PFA'da altı CFSE etiketli CD dört pozitif T hücresine 0.2 kez 10 sabitleyin ve akış sitometrisi ile T hücresinin CFSE ekspresyonunun bazal seviyesini belirleyin. CFSE etiketli hücrelerin geri kalanını, eksik, orta olanı yeniden askıya alın ve daha sonra iki kez 10 ila beş saflaştırılmış veya iki CD dört pozitif T hücresi tek başına veya iki kez 10 ila dört saflaştırılmış vahşi tip veya D sekiz sekiz nakavt dcs'm 24 oyuklu bir plakada kalıntı 3 23 3 39 üzerinde bir mililitre tam ortamda 37'de kuyu başına tam ortamda Beş gün sonra Santigrat derece, hücreleri hasat edin ve bunları iki kez yıkayın, gerçek tampon ve peletleri 0.25 mililitre% 2 PFA içinde sabitleyin ve akış sitometrisi veri toplama için örnekleri hemen girdaplayın. Akış sitometrisi yazılımına çift tıklayın ve bir yoğunluk grafiği oluşturmak için ileri saçılmada sıfır ila 200.000 ve yan saçılmada sıfır ila 200.000 arasındaki kanalları seçin.Ardından, CFSE'nin floresan yoğunluğunu analiz etmek için canlı kuyular üzerinde bir kapı oluşturun. FL one kanalı için histogramı açın ve geçitli popülasyonda 20.000 olay alın. Ardından, tek başına kültürlenen OT iki hücre için numuneler üzerinde bir işaretleyici ayarlayın.Hücre içi sitokin boyama testi için benzer şekilde vahşi tip veya D sekiz sekiz nakavt dcs ile OT iki hücreli ko-kültür için veri elde edin. Batı Nil virüsünden toplanan dalaklardan tek hücreli bir süspansiyon oluşturulduktan sonra, enfekte fareler uygun zaman noktalarında hücreleri sayar ve daha sonra bunları mililitre konsantrasyonunda altı hücrenin yüzde 2.5 katına kadar tam bir ortamla seyreltir. Daha sonra Eloqua, sitlerin bir mililitresini 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne koyun.Daha sonra CD'yi sekiz pozitif T hücresi ile uyarmak için, 10 mikrolitre taze seyreltilmiş Western spesifik peptitler ve ardından bir mikrolitre feld ekleyin. Bir çözelti içinde, hücre süspansiyonlarını dikkatlice karıştırın ve daha sonra 18 gauge bir iğne ile tüpün kapağına iki delik açın ve hücreleri beş saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktardıktan ve bir mililitre faks tamponunu yıkadıktan sonra döndürdükten sonra, ikinci peleti 120 mikrolitre faks tamponunda yeniden askıya alın.Daha sonra spesifik olmayan bağlanma bölgelerini FC bloğu ile bloke edin ve tüpleri tabloda belirtildiği gibi uygun deneysel ve kontrol antikorları ile etiketleyin. Daha sonra, hücreleri fiksasyon ve geçirgenlik tamponunda inkübe edin ve daha sonra hücreleri, tabloya göre kontrol veya anti interferon gama antikorları ile etiketlemek için laboratuvara bir biyogüvenlik seviyesine aktarın. Hücre içi sitokin üretimini ölçmek için, az önce gösterildiği gibi ileri doğru bir yan yana saçılma grafiği oluşturun ve ardından voltajları gerektiği gibi ayarlamak için kompanzasyon tüplerini kullanarak canlı hücreleri kapılayın.CD sekiz pozitif ve interferon gama pozitif hücreler için toplanan verileri görüntülemek için bir nokta grafiği oluşturun, ardından CD dört pozitif ve interferon gama pozitif hücreler için bir tane daha oluşturun ve her numunenin kapılı popülasyonu için 50.000 olay elde edin. Bu deneyde, bazal T hücresi proliferasyon hızını belirlemek için toplam C hücreleri kapılandı. DCS ile ortak kültürün yokluğunda.T hücreleri, Batı Nil virüsü ile enfekte hayvanlardan izole edilen DC ile ko-kültür olduğunda, CFSE pozitif T hücreleri, %87'lik bir proliferasyon sergiledi CFSE etiketli T hücreleri Ko-kültür, D sekiz nakavt faremden elde edilen DCS ile %74.5'ten fazla proliferasyon oranı sergiledi, bu da my D sekiz sekiz sinyal yolundaki eksikliğin, mutant bir West null sırasında dcs tarafından bozulmuş bir antijen sunma kapasitesine yol açtığını düşündürmektedir virüs enfeksiyonu. Batı Nil virüsü ile enfekte vahşi tip farelerden izole edilen splenik CD dört pozitif interferon gama pozitif ve CD sekiz pozitif interferon gama pozitif T hücrelerinin yüzdeleri bu temsili şekilde sırasıyla %0.4 ve %1.7 idi. Batı Nil virüsü ile enfekte olmuş D sekiz nakavt fareden izole edilen çift pozitif splenik T hücrelerinin yüzdeleri sadece %0.2 ve %0.6 iken, enfekte olmayan farelerden izole edilen sitlerle benzer analizler yapıldı ve iki grup arasında çift pozitif popülasyon T hücrelerinin yüzdesinde fark gözlenmedi.Ayrıca, enfekte vahşi tip farelerden alınan CD dört pozitif ve CD sekiz pozitif T hücrelerinin tek pozitif popülasyonları, toplam kapılı SP sitlerinin %21 ve %13.3'ü iken, enfekte gruplara kıyasla D sekiz sekiz nakavt SP sitiğimin sadece %15.9 ve %11.2'si olarak belirlenirken, hem CD dört pozitif hem de CD sekiz pozitif T hücresi yanıtları, D sekiz nakavt faremde karşılaştırıldığında azaldı Mutant Batı Salyangozu Virüsü enfeksiyonu sonrası sekizinci günde vahşi tip gruba. Özetle, D sekiz sekiz sinyalim, her iki popülasyonun ilk T hücresi aktivasyonunda rol oynar ve enfeksiyonun daha sonraki bir aşamasında CD dört pozitif T hücresi yanıtına katkıda bulunur. CFSE etiketli OT iki T hücresinde kullanılan in vitro tcell primaz bazlı grip sitometrisi, mevcut standart protokollerden önemli ölçüde geliştirilmiş genel duyarlılık ile proliferatif CD4 pozitif T hücresi yüzdesinin daha doğru bir şekilde belirlenmesini sağlar.Mikro alan tüpü olan ICS Math third, araştırmacılar için hem daha ekonomik hem de daha esnek bir seçenek sunan herhangi bir özel alet gerektirmez.

in-vitro-analysis-myd88-mediated-cellular-immune-response-to-west

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Rift Vadisi ateşi virüs MP-12 aşı suşu için ters genetik sistemi ek MP-12 mutantlar artan zayıflama ve immünojenite oluşturmak için yararlı bir araçtır. Biz NSS mutant suşlar oluşturmak ve karakterize etmek için protokol açıklar.

Rift Vadisi Ateşi Virüsü Aşı Güvenliği ve Etkinliği Artırmak İçin MP-12 Gerinim NSS Gen işleyin Ters Genetik kullanma

γ-herpesvirüslerinin (γ-HVS) ev sahibi ömür boyu kalıcılığı kurmak. Enfeksiyon γ-HV68 ile farelerin genetik çözülebilir...

Farelerde γHV68 Enfeksiyon ölçümü

İnsan Kaposi sarkomu ile ilişkili Herpes (KSHV) ve Epstein-Barr virüsü (EBV) ile yakından ilgili olan bir model herpesvirüs, kemirgen gamma herpes virüsü 68 (γ HV68) ile enfekte olan fareler içindeki antiviral sitokin üretimini ölçmek için bir protokolü tarif eder. Genetik olarak modifiye edilmiş olan fare soyları ve fare embriyonik fibroblastlar (MEF'ler) kullanarak, biz antiviral sitokin üretimini in vivo ve ex vivo hem de değerlendirildi. Lentiviral transdüksiyonu ile nakavt embriyonik...

Sitokin Üretimi Viral Evasion Doğuştan Bağışıklık Sinyalizasyonu Diseksiyon

Ortaya çıkan bir patojen olan Zika Virüsü (ZIKV), fetal gelişimsel anormallikler ve mikrosefali ile bağlantılıdır. Etkili bir enfeksiyöz hücre kültürü sisteminin kurulması, ZIKV replikasyonu çalışmalarının yanı sıra aşı ve ilaç geliştirme çalışmaları için de çok önemlidir. Bu çalışmada ZIKV ile ilgili çeşitli virolojik analizler gösterilmiş ve tartışılmıştır.

Zika Virüs Bulaşıcı hücre kültürü sistemine ve<em&gt; İn Vitro</emİnterferonların&gt; profilaktik etkisi

Grip A virüs (IAVs) önemli insan solunum patojenler vardır. İnsan fizyolojisi taklit hayvan modelleri IAVs patojenitesi anlamak ve preklinik roman aşı yaklaşımlar sınamasını gerçekleştirmek için gereklidir. Burada, biz IAV Patogenez, humoral yanıt ve enfeksiyon bir fare modeli kullanarak aşı etkinliğini değerlendirmek için teknikler açıklanmaktadır.

Grip A virüs enfeksiyonu bir fare modeli çalışmalarda

Ifnar1- / - fare modeli immunoprivileged organlarda Zika virüs (ZIKV) enfeksiyon için antijen spesifik T-hücre yanıtları değerlendirmek için bir protokol açıklanmıştır. Bu yöntem koruma hücresel mekanizmaları ve immunopathogenesis ZIKV aşı soruşturma için çok önemli ve aynı zamanda onların etkinliğini değerlendirme için değerlidir.

Virüslü Ifnar1- / - farelerin Immunoprivileged organlarında Zika virüs özgü T hücreli yanıt-e doğru değerlendirilmesi

Burada, Abdovirüs çoğaltma ve Abdovirüs çoğaltma kısıtlamak 2) ökaryotik ana faktörler teşvik 1) virüs kodlanmış immunomodulators tanımlamak için protokolleri mevcut. Floresan ve ışıldama dayalı yöntemlerin araştırmacılar hızla düşük sinyal noise oranları ile basit deneyleri Abdovirüs çoğaltma nicel veriler elde etmek için izin verir.

Araçlar Viral Immunomodulators ve ana bilgisayar Antiviral faktörler tanımlanması için eleme olarak Abdovirüs enfeksiyonlar

Burada, nöropati gelişimini görüntülemek için bir immünopetik ıCR (Kanser Araştırma Enstitüsü) merkezi sinir sistemi enfeksiyonu murine modeli oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Akut viral ensefalitik bozuklukların aynı hastalık puanları ile izlenmesi, Dang virüse bağlı nöropati içinde vivo göstermek için gerçekleştirilebilir.

Dang humması virüs kaynaklı akut viral Ensefalitis-benzeri hastalık bir Murine modeli

Protokolün amacı, enfeksiyon sonrasında faredeki birden fazla organdan Zika virüsünü izole ederek ve ölçerek viral hastalıkları araştırmak için kullanılan teknikleri göstermektir.

Farede Birden Fazla Organdan Zika Virüsünün İzolasyon ve Nicelikselleştirilmesi

Bu makalede, influenza virüs enfeksiyonunun fare modelinde Tfh ve GC B yanıtını değerlendirme protokolleri açıklanmaktadır.

Farelerde grip A Virüs Enfeksiyonu Sırasında T Foliküler Yardımcı Hücrelerin ve Germinal Merkez Yanıtının Değerlendirilmesi

Hücre içi Wolbachia'yı tespit etmek için birbirini tamamlayan ve Aedes albopictus'tan türetilmiş Aa23 ve Aa23-T'nin Wolbachia enfeksiyonunun antibiyotik kullanılarak tedavi edilen Wolbachia enfeksiyonunun tespit doğruluğunu artıran  dört yöntem kullanıldı.

Aedes albopictus Hücre Hatlarında Wolbachia Suşu wAlbB'nin Tespiti

Öğrenin, West Nil Virüsü enfeksiyonuna karşı T hücresi yanıtlarını dendritik hücreler ve akış sitometrisi kullanarak in vitro ölçme yöntemlerini. Bu teknikler, hücresel bağışıklık araştırmalarında güvenli ve verimli alternatifler sunar.

Batı Nil Virüsü Mutant Soy Enfeksiyon MyD88-aracılı Hücresel Bağışıklık Tepki Vitro Analizi

Daha fazla video keşfet