Name: Yüksek çözünürlüklü elektron mikroskobu Helikobakter pilori Çağ Tip IV Salgı Sistemi Pili (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Keşfedin, Helicobacter pylori'de Cag-T4SS salgı sisteminin yüksek çözünürlüklü taramalı elektron mikroskobu ile görüntülenmesini. Demir kısıtlaması altında pilus üretiminin arttığını öğrenin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Gazi İşleri Bakanlığı Kariyer Geliştirme Ödülü 1IK2BX001701 ve Ulusal Translasyonel Bilimleri Geliştirme Merkezi'nden CTSA ödülü UL1TR000445 tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Translasyonel Bilimleri Geliştirme Merkezi'nin veya Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. Taramalı elektron mikroskobu deneyleri, kısmen, NIH hibeleri CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 ve EY08126 tarafından desteklenen VUMC Hücre Görüntüleme Paylaşılan Kaynağı kullanılarak gerçekleştirildi.

1. H. İnsan Gastrik Hücrelerine ile Demir Durumu ve Co-kültür Çeşitli Koşullar pylori Büyüme <ol><li> H. seçin Bu çalışmalar için pylori soyu PMSS1 bir sağlam cağ patojenite adası ve işleyen bir tip IV sekresyon sistemi ifade çünkü. Aynı zamanda, bir negatif kontrol olarak izogenik bir kafes mutant (PMSSI Δ kafesi) kullanmaktadır. % 5 CO2 varlığında 37 ° C&#39;de 24 saat boyunca% 5 koyun kanı (kan agar plakaları) ile takviye edilmiş TSA plakaları üzerine bakteri büyütün. NOT: reaktifleri hazırlayın ve Malzemeleri ve Ekipmanları Tablo belirtildiği gibi malzemeleri bir araya getirin. Her bir reaktifin son konsantrasyonları parantez içinde belirtilmiştir. </li><li> Steril pamuk uçlu bir aplikatör kullanılarak plaka bakteri kazıyın ve bileşenlerden hazırlanan modifiye brusella et suyu içine aşılamak (Malzeme ve Ekipmanları Tabloya bakınız) ve kolesterol ile desteklenmiş. 37 ° C&#39;de gece boyunca kültürler inkübeDakika (rpm), 200 dönüş çalkalayarak,% 5 CO2 ilave edilmiş, havada bulunan ° C. Not: Kolesterol bağlı olarak serum karmaşık olmasından fetal sığır serumu yerine kullanılır; Bu tür sonuçlar değişkenlik neden heme gibi besin demir sayısız kaynaklar içeren. </li><li> Bakteriyel kültür gününde, AGS insan gastrik epitel hücreleri, tohum (ATCC CRL-1739), 12-gözlü levhalar (oyuk başına yaklaşık 1 x 10 5 hücre) poli-D-lizin muamele edilmiş, kapak slipleri üzerine. </li><li> Ertesi gün, tadil edilmiş, Brucella et suyu, tek başına veya 100 uM FeCl3, 200 uM dipiridil (sentetik demir kenetleme maddesi) ya da 200 uM dipiridil artı 250 uM FeCl3 ile desteklenmiş 0.3 bir OD600&#39;e bakteri kültürleri seyreltin. 200 rpm&#39;de çalkalanarak,% 5 CO2 ilave edilmiş, havada bulunan 37 ° C de 4 saat süre ile, bu kültürleri inkübe edin. </li><li> 1000 xg&#39;de santrifüj bakteri hücreleri toplamak ve i resuspending önce süpernatanlan kaldırmak içinn, taze değiştirilmiş Brucella Et suyu eşit hacimde kolesterol ile takviye edilmiştir. Kültür (OD600 = 1.0 = 5.5 x 10 8 hücre / ml) ölçümü OD600 ve enfeksiyon 20 (İB) &#39;in bir çokluğu epitel hücrelerine bakteri ekleyin: 1 arasındadır. Bakteriyel hücre canlılığını değerlendirmek için kan agar plakaları üzerine seri dilüsyonlarını ve plaka bakteri hücreleri gerçekleştirin. </li><li> H. inkübe taramalı elektron mikroskobu (SEM) örnek hazırlama gerçekleştirmeden önce statik koşullarda% 5 CO2 varlığında 37 ° C&#39;de 4 saat boyunca pilori AGS insan mide epitel hücrelerinin ko-kültürler. </li></ol> 2. SEM H. Visualize&#39;a Numune Hazırlama H. pylori Çağ-T4SS Pili <ol><li> H. Kaldır H. pylori ve inkübatör ve dökme sıvı kültür süpernatanından AGS ko-kültürler (IL-8 ELISA ile) kaydedin. 0.05 M sodyum kakodilat buferi (pH 7.4) hafifçe üç kez yıkayın. ,% 2.0 paraformaldehit çözeltisi içinde 2,5, oda sıcaklığında 2-4 saat boyunca örnekleri saptamak% Gluteraldehit, ve 0.05 M sodyum kakodilat tamponu. Birincil tespit sonra örnekler 0.05 M sodyum kakodilat tamponu ile üç kez yıkayın. </li><li> İki ardışık 10 dakika sabitleştirme adımlarında 0.05 M sodyum kakodilat tampon maddesi içinde% 0.1 osmiyum tetroksit ile ikinci tespit gerçekleştirin. İkinci tespit sonra örnekler 0.05 M sodyum kakodilat tamponu ile üç kez yıkayın. </li><li> Birincil ve ikincil tespit edildikten sonra, Tablo 1 &#39;deki gibi etanol artan konsantrasyonları ile art arda yıkama ile örnekleri dihidrat. </li><li> Etanol dehidratasyon sonra sıvı karbon dioksit, sıralı üç yıkama yapar. 1073 PSI 31.1 ºC sıcaklık ve basınçta bir kritik nokta kurutma makinesi kullanılarak kritik bir noktada sonra kuru örnekleri. </li><li> Dağı alüminyum SEM örnek taslakları üzerine lamelleri ve uygun topraklama sağlamak ve SEM görüntüleme sırasında şarj önlemek için numune kenarında kolloidal gümüş ince bir çizgi ile boyayın. </li><li> Coat örnekleri 5 nm ileörnek ikincil elektron sinyal ve kenar etkisini artırmak için bir püskürtme ceket makinesi kullanarak altın-paladyum. </li></ol> Yüksek Çözünürlüklü SEM Analizleri 3. Görüntüleme Parametreleri <ol><li> Saha-Emisyon Gun Taramalı Elektron Mikroskobu (FEG-SEM) ile View örnekler. </li><li> 5-10 mm çalışma mesafesi yüksek bir vakum modunda görüntü. </li><li> 5 kV hızlandırma voltajı ayarlayın. </li><li> 2-2,5 spot boyutunu ayarlayın. </li><li> Konak-patojen arayüzü daha iyi bir görünüm elde etmek için 15-25 derece arasında örnek eğin. </li><li> Konak-patojen etkileşimlerinin bu alanlarda Pili oluşturan bakteriler için zenginleştirilmiş olarak, yüksek büyütme görüntüleme için epitel hücrelerinin kenarlarına yapışmış bakteri görüntüleme öncelik. </li></ol> 4. İstatistiksel Analizler Pili quantifications değerlendirin <ol><li> H. analiz ImageJ yazılımı kullanılarak H. pylori Çağ-T4SS piluslar piliated Phe arzeden hücre zarları / hücre sayısının yanı sıra yüzde ölçmek içinAşağıdaki talimatlara göre notype. </li><li> ImageJ yazılım açık mikrografiğidir dosyaları. Düzgün genişlikte (10-13 nm) ve uzunluğu (60-150 nm) bakteriyel hücre ve konakçı hücre arasında oluşturulan yapılar olarak Pili belirlenmesi. Not: pilus yapısı büyük ATPaz güçler tip IV sekresyon pilus düzeneği kodlayan gende bir etkisiz hale liman bu Δ kafesini mutant soylar olarak izogenik suşları ilgilidir WT bakteriyel suşlar üzerinde mevcut olan, ancak mevcut değildir. </li><li> &quot;Analiz&quot; sekmesine tıklayarak ardından düz çizgi aracıyla bir çizgi çizerek tarafından ölçme aracı kalibre. Açılan menüden &quot;Set Ölçeği&quot; seçin ve kutuya etiketli &quot;Bilinen uzaklık&quot; içine büyütme bar değerini girin ve uygun ayarı (nm) uzunluğu birimini ayarlayın. &quot;Tamam&quot; ı tıklayın. </li><li> Pilus uzunluğu veya genişliği boyunca çizmek için düz çizgi aracını kullanarak Çağ-T4SS Pili ölçün ve sonra her Pilus ölçmek için &quot;Ctrl-M&quot; tuşuna basın. Ölçülen değerler ile bir diyalog kutusu gözlemlemek. Bu değerleri kaydedin veya kopyalayın ve bir elektronik tablo programı yapıştırın. </li><li> Uzunluğu kullanın ve genişlik parametreleri önceden Çağ-T4SS profilini uymayan 24, göz ardı özellikleri kurdu. Sonra 10-13 nm genişlik ve 60-150 nm uzunluk eşik dahilinde değerlere dayalı pili sayısını ölçmek. </li><li> GraphPad Prism yazılımı kullanılarak iki kuyruklu Student t testi ile istatistiksel pili ve miktarının analiz. </li></ol> 5. İsteğe bağlı: IL-8 salgısını değerlendirilmesi Pilus üretimi ile ilişkilendirir için <ol><li> Adım 2.1 süpernatanlarm kullanarak, kit ile üreticinin talimatlarına (Malzeme ve Ekipmanları Tablo bakınız) başına bir IL-8 ELISA gerçekleştirin. </li><li> IL-8 konakçı hücreler tarafından salgılanan analiz eder ve tek başına ortam içinde yetiştirildiğinde, WT PMSS1 göre yüzde IL-8, indüksiyon hesaplar. Böylece GraphPad Prism kullanılarak iki kuyruklu Student t testi kullanılarak istatistiksel analizftware. </li></ol>

<ol><li>Cover, T. L., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori in health and disease.</a> Gastroenterology. (6), 1863-1873 (2009).</li>
<li>Sycuro, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+crosslinking+relaxation+promotes+Helicobacter+pylori%27s+helical+shape+and+stomach+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan crosslinking relaxation promotes Helicobacter pylori's helical shape and stomach colonization.</a> Cell. 141 (5), 822-833 (2010).</li>
<li>Kodaman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+Helicobacter+pylori+coevolution+shapes+the+risk+of+gastric+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Human and Helicobacter pylori coevolution shapes the risk of gastric disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (4), 1455-1460 (2014).</li>
<li>Tegtmeyer, N., Wessler, S., Backert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+cag-pathogenicity+island+encoded+type+IV+secretion+system+in+Helicobacter+pylori+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Role of the cag-pathogenicity island encoded type IV secretion system in Helicobacter pylori pathogenesis.</a> FEBS J. 278 (8), 1190-1202 (2011).</li>
<li>Fischer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+molecular+mode+of+action+of+the+Helicobacter+pylori+Cag+type+IV+secretion+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Assembly and molecular mode of action of the Helicobacter pylori Cag type IV secretion apparatus.</a> FEBS J. 278 (8), 1203-1212 (2011).</li>
<li>Odenbreit, S., Puls, J., Sedlmaier, B., Gerland, E., Fischer, W., Haas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+Helicobacter+pylori+CagA+into+gastric+epithelial+cells+by+type+IV+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translocation of Helicobacter pylori CagA into gastric epithelial cells by type IV secretion.</a> Science. 287 (5457), 1497-1500 (2000).</li>
<li>Bourzac, K., Guillemin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori-host+cell+interactions+mediated+by+type+IV+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori-host cell interactions mediated by type IV secretion.</a> Cell Microbiol. 7 (7), 911-919 (2005).</li>
<li>Bronte-Tinkew, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+cytoxin-associated+gene+A+activates+the+signal+transducer+and+activator+of+transcription+3+pathway+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori cytoxin-associated gene A activates the signal transducer and activator of transcription 3 pathway in vitro and in vivo.</a> Cancer Res. 69 (2), 632-639 (2009).</li>
<li>Johnson, E. M., Gaddy, J. A., Cover, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+Helicobacter+pylori+triggered+by+contact+with+gastric+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Cell.+Infect.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Alterations in Helicobacter pylori triggered by contact with gastric epithelial cells.</a> Front. Cell. Infect. Microbiol. (2), 17(2012).</li>
<li>Rohde, M., Puls, J., Buhrdorf, R., Fischer, W., Haas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+sheathed+surface+organelle+of+the+Helicobacter+pylori+cag+type+IV+secretion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A novel sheathed surface organelle of the Helicobacter pylori cag type IV secretion system.</a> Mol. Microbiol. 49 (1), 219-234 (2003).</li>
<li>Cover, T. L., Peek, R. M. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet%2C+microbial+virulence+and+Helicobacter+pylori+induced+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Diet, microbial virulence and Helicobacter pylori induced gastric cancer.</a> Gut Microbes. 4 (6), 482-493 (2013).</li>
<li>Queiroz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+gastric+IL-1%CE%B2+concentration+and+iron+deficiency+parameters+in+Helicobacter+pylori+infected+children%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Increased gastric IL-1β concentration and iron deficiency parameters in Helicobacter pylori infected children.</a> PLoS One. 8 (2), 57420(2013).</li>
<li>Harris, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori-associated+hypochlorhydria+and+development+of+iron+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori-associated hypochlorhydria and development of iron deficiency.</a> J. Clin. Pathol. 66 (4), 343-347 (2013).</li>
<li>Noto, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+deficiency+accelerates+Helicobacter+pylori-induced+carcinogenesis+in+rodents+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Iron deficiency accelerates Helicobacter pylori-induced carcinogenesis in rodents and humans.</a> J. Clin. Invest. 123 (1), 479-492 (2013).</li>
<li>Tan, S., Noto, J. M., Romero-Gallo, J., Peek, R. M. Jr, Amieva, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+perturbs+iron+trafficking+in+the+epithelium+to+grow+on+the+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori perturbs iron trafficking in the epithelium to grow on the cell surface.</a> PLoS Pathog. 7 (5), (2011).</li>
<li>Danielli, A., Roncarati, D., Delany, I., Chiarini, V., Rappouli, R., Scarlato, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dissection+of+the+Helicobacter+pylori+Fur+regulatory+circuit+by+genome-wide+location+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">In vivo dissection of the Helicobacter pylori Fur regulatory circuit by genome-wide location analysis.</a> J. Bacteriol. 188 (13), 4654-4662 (2006).</li>
<li>Pich, O. Q., Carpenter, B. M., Gilbreath, J. J., Merrell, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+analysis+of+Helicobacter+pylori+Fur-regulated+promoters+reveals+a+Fur+box+core+sequence+and+novel+Fur-regulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detailed analysis of Helicobacter pylori Fur-regulated promoters reveals a Fur box core sequence and novel Fur-regulated genes.</a> Mol. Microbiol. 84 (5), 921-941 (2012).</li>
<li>Cassat, J. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+in+infection+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Iron in infection and immunity.</a> Cell Host Microbe. 13 (5), 509-519 (2013).</li>
<li>Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-pathogen+interactions+in+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Urol%22%5BJournal%5D)">Host-pathogen interactions in urinary tract infection.</a> Nat. Rev. Urol. 7 (8), 430-441 (2010).</li>
<li>Brickman, T. J., Cummings, C. A., Liew, S. Y., Relman, D. A., Armstrong, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+the+iron+starvation+response+in+Bordatella+pertussis+provides+new+insights+into+siderophore+utilization+and+virulence+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of the iron starvation response in Bordatella pertussis provides new insights into siderophore utilization and virulence gene expression.</a> J. Bacteriol. 193 (18), 4798-4812 (2011).</li>
<li>Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+factors+associated+with+disease+development%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori factors associated with disease development.</a> Gastroenterology. 113 (6), 21-28 (1997).</li>
<li>Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+requirements+and+antibiotic+resistance+patterns+of+Helicobacter+species+in+chemically+defined%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined.</a> J. Clin. Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).</li>
<li>Senkovich, O., Ceaser, S., McGee, D. J., Testerman, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+host+iron+utilization+mechanisms+of+Helicobacter+pylori+revealed+with+iron-deficient+chemically+defined+media%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Unique host iron utilization mechanisms of Helicobacter pylori revealed with iron-deficient chemically defined media.</a> Infect. Immun. 78 (5), 1841-1849 (2010).</li>
<li>Shaffer, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+exploits+a+unique+repertoire+of+type+IV+secretion+system+components+for+pilus+assembly+at+the+bacteria-host+cell+interface%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori exploits a unique repertoire of type IV secretion system components for pilus assembly at the bacteria-host cell interface.</a> PLoS Pathog. 7 (9), (2011).</li>
<li>Barrozo, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+plasticity+in+the+type+IV+secretion+system+of+Helicobacter+pylori%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Functional plasticity in the type IV secretion system of Helicobacter pylori.</a> PLoS Pathog. 9 (2), (2013).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Demir, bakteriyel patojenler dahil olmak üzere yaşamın birçok formları için önemli bir mikrobesleyicidir. Mikroorganizmaları istila canlılığı kısıtlamak için bir çaba, omurgalı ana &quot;beslenme dokunulmazlığı&quot; 18 olarak bilinen bir süreç içinde besin demir müsadere. Buna karşılık olarak, bakteriyel patojenler çevrelerini algılamak ve demir toplama sistemleri, toksinler ve toksin salgı makine 19,20 olarak virülans özelliklerinin detaylandırılması düzenleyen küresel bir sinyal molekülü olarak ...

H. pylori enfeksiyonu mide kanseri için önemli bir risk faktörüdür1. Bununla birlikte, hastalık sonuçları değişir ve konak genetiği, H. pylori suşlarının genetik çeşitliliği ve konakçı diyeti gibi çevresel unsurlar gibi çok sayıda faktöre bağlıdır11. Önceki raporlar, H. pylori enfeksiyonu, demir eksikliği (azalmış kan ferritin ve hemoglobin konsantrasyonları ile ölçüldüğü gibi) ve sonuçta mide hastalığının ilerlemesinin artmasına yol açan IL-8 sekresyonu dahil olmak üzere artmış proinflamatuar sitokin üretimi arasında bir korelasyon olduğunu ortaya koymuştur12. Akut H. pylori enfeksiyonu, konakçının besin demirini emme yeteneğini bozan ve sonuçta demir homeostazında değişikliklere yol açan hipoklorhidri ile de ilişkilidir13. Bu klinik bulgular, gaz nişi içindeki demir mevcudiyetinin hastalık sonuçlarında önemli bir faktör olabileceğini düşündürmektedir. Aslında, H. pylori enfeksiyonunun hayvan modelleri, düşük diyet demir tüketiminin mide hastalığını şiddetlendirdiğini göstermiştir14. Bu hayvanlarda azalan demir seviyeleri, H. pylori'nin bakteri replikasyonu için gerekli demiri elde etmek için bir demir edinme tepkisi oluşturmasını gerektirir. H. pylori, CagA'ya bağımlı bir şekilde bakteri replikasyonunu kolaylaştırmak için konakçı hücreler içindeki demir kaçakçılığını bozma kapasitesine sahiptir15. İlginç bir şekilde, cag-patojenite adasının demire duyarlı transkripsiyon faktörü Fur16,17 tarafından düzenlendiği gösterilmiştir. Ayrıca, Cag + suşları, artan inflamasyon ve kanser gibi mide hastalıkları ile ilişkilidir1. Bu bulgular, H. pylori'nin, demir tükenmiş bir ortamda bulunan konakçı hücrelerden demir elde etmek amacıyla Cag-T4SS ekspresyonunu değiştirdiği ve bunun da hastalık sonuçlarının şiddetlenmesine neden olduğu bir modeli desteklemektedir. 
İnflamasyonu ve morbiditeyi artıran iki faktör Cag ekspresyonu ve düşük diyetle demir alımıdır. Bu gerçekler, azalmış demir mevcudiyetinin konak patojen arayüzünde Cag-T4SS pili üretimini arttırdığı ve bunun da daha kötü mide hastalığı11-14 ile sonuçlandığı hipotezini desteklemektedir. Bu yazıda sağlanan yöntemin amacı, Cag-T4SS pilus biyogenezinin düzenlenmesinde mikro besin demirinin rolünü belirlemektir. Önceki çalışmalarda, Cag-T4SS ekspresyonunda demire bağlı bir artışı gözlemlemek için iki yaklaşım kullandık. İlk olarak, yüksek ve düşük demir diyetlerinde tutulan hayvanlardan elde edilen çıktı suşları analiz edildi ve düşük demir diyet çıktı suşlarının, yüksek demir diyet suşlarından daha fazla Cag-T4SS pili ürettiği ortaya çıktı14. İkincisi, H. pylori 7.13 suşunun in vitro olarak demir dolu koşullarda büyütülmesi, pili oluşumunun azalmasına neden olurken, bir demir şelatörünün varlığında büyüyen hücreler önemli ölçüde daha fazla pil üretti. 
Cag-T4SS pili fenotipinin demire bağlı regülasyonunu araştırmaya devam ettik ve ek bir Helicobacter pylori suşu olan PMSS1 ile gerçekleştirilen aşağıdaki optimize edilmiş protokolü ve temsili sonuçları sunuyoruz. Bu tekniğin geliştirilmesinin ardındaki mantık, artmış Cag-T4SS pilus oluşumu ile demir sınırlama koşullarında artmış Cag-T4SS aktivitesini ilişkilendirmekti. Bu tekniğin daha geniş bir şekilde kullanılması ve kullanılması, Cag-T4SS pili'nin üretiminin artmasıyla sonuçlanan optimize edilmiş kültür koşulları sağlayacaktır. Bu tahlil, bu önemli bakteri yüzey özelliğini zenginleştirerek Cag-T4SS'nin bileşimini ve mimarisini belirlemek isteyen araştırmacılar için faydalı olacaktır. Alan emisyon tabancası elektron mikroskobu ile numune hazırlama ve görselleştirme, Cag-T4SS'yi görselleştirmek için ışık mikroskobu yöntemleri gibi alternatif tekniklere göre çok sayıda avantaja sahiptir ve bu organelindüzenlenmesini incelemek isteyen araştırmacılar için uygun olacaktır 10.

<table><tbody><tr><td>Kazeinden modifiye brusella suyu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pepton (10 g/L)</td><td>Sigma</td><td>70172</td><td></td></tr><tr><td>Hayvan dokusunun peptik sindirimi (10 g/L)</td><td>Sigma</td><td>70174</td><td></td></tr><tr><td>Maya özütü (2 g/L)</td><td>Sigma</td><td>92144</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroz (1 g/L)</td><td>Sigma</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür (5 g/L)</td><td>Thermo Fisher</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol (250X) (4 ml/L)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12531018</td><td></td></tr><tr><td>Ferrik klorür (100 veya 250 uM)</td><td>Sigma</td><td>157740-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dipiridil (200 uM)</td><td>Sigma</td><td>D216305-100G</td><td></td></tr><tr><td>Modifiye RPMI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI+HEPES (1X)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>22400-121</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu ( 100 ml/L)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10438-026</td><td></td></tr><tr><td>Elektron Mikroskobu Hazırlama</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit (%2.0 sulu)</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldehit (%2.5 sulu)</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum kakodilat (0.05 M)</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>Osmiyum tetroksit (% 0.1 sulu)</td> <td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (mutlak)</td> <td>Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Kolloidal gümüş boya</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>12630</td><td></td></tr><tr><td>SEM örnek taslakları</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>75220</td><td></td></tr><tr><td>Lameller</td><td>Thermo Fisher</td><td>08-774-383</td><td></td></tr><tr><td>IL-8 Sekresyon Değerlendirmesi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantikine IL-8 ELISA kiti</td><td>R& D Sistemleri</td><td>D8000C</td><td></td></tr></tbody></table>

yüksek çözünürlüklü elektron mikroskobu helikobakter pilori Çağ tip iv salgı sistemi pili

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Helicobacter pylori, insan popülasyonunun yarısının insan mide nişini kolonize eden sarmal şekilli, gram negatif bir bakteridir1,2. H. pylori mide kanserinin birincil nedenidir ve dünya çapında kansere bağlı ölümlerin ikinci önde gelen nedenidir3. Mide hastalığı riskinin artmasıyla ilişkilendirilen bir virülans faktörü, H. pylori kromozomu içinde tip IV sekresyon sistemini ve aynı kökenli efektör molekülCagA 4,5'i kodlayan 40 kb'lık bir bölge olan Cag-patojenite adasıdır. Cag-T4SS, CagA ve peptidoglikanın konak epitel hücrelerine5,6 translokasyonundan sorumludur. Cag-T4SS'nin aktivitesi, sitokin ekspresyonunun yukarı regülasyonu, proinflamatuar yolların aktivasyonu, hücre iskeletinin yeniden şekillenmesi ve onkojenik hücre sinyal ağlarınınindüksiyonu dahil olmak üzere konakçı hücre biyolojisinde çok sayıda değişikliğe neden olur 5-8. Cag-T4SS, iç ve dış zarı kapsayan ve hücreden dışarıya doğru hücre dışı boşluğa uzanan alt montaj bileşenlerinden oluşan bir makromoleküler makinedir. Cag-T4SS'nin hücre dışı kısmı "pilus" olarak adlandırılır5. Çok sayıda çalışma, Cag-T4SS pili'nin konak-patojen arayüzünde9,10 oluştuğunu göstermiştir. Bununla birlikte, bu önemli organelin biyogenezini düzenleyen çevresel özellikler büyük ölçüde belirsizliğini korumaktadır. Son zamanlarda, düşük demir mevcudiyeti koşullarının Cag-T4SS aktivitesini ve pilus biyogenezini arttırdığını bildirdik. Burada, insan gastrik epitel hücreleri ile ko-kültürden önce değişen demir mevcudiyeti koşullarında H. pylori'yi büyütmek için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, yüksek çözünürlüklü taramalı elektron mikroskobu analizleri ile demir kısıtlı koşullarda sergilenen hiper piliated fenotipin görselleştirilmesi için kapsamlı bir protokol sunuyoruz.

Bu yazıda, demir kullanılabilirliği değişen koşulları H. modüle kapasitesine sahip olduğunu göstermiştir ana patojen arayüzünde pilori Çağ-T4SS pilus biyogenez. H. tek başına ortamda kültürlenen zaman H. pylori 3 Pili / hücre ortalama oluşturur. H. H. pylori demir yetiştirilir tüketen bakteri büyümesi (Şekil 1), alt inhibitördür (sentetik kenetleyici dipiridil kullanılarak) şartları altında, bakteriler üreten bir çok Çağ-T4SS pili (~ 7 pili / hücre) için kull...

Burada, Cag Tip IV Salgı Sistemi (Cag-T4SS) olarak bilinen onkojenik bakteri organelini görselleştirmek için bir yöntem açıklıyoruz. Cag-T4SS'nin, değişen demir mevcudiyeti koşullarına yanıt olarak H. pylori'nin yüzeyinde farklı şekilde üretildiğini bulduk.

Yüksek çözünürlüklü elektron mikroskobu Helikobakter pilori Çağ Tip IV Salgı Sistemi Pili

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

Prosedür, demir sınırlaması koşulları altında meydana gelen CAG tip dört sekresyon sistemi pii'nin hiper üretimini görselleştirir, ilk kültür h pylori demir sınırlaması koşulları altında. İkinci adım, h pylori'yi gastrik epitel hücreleri ile birlikte kültürlemektir. Daha sonra, taramalı elektron mikroskobu için ko-kültür örneklerini işleyin.Sonuçta yüksek çözünürlüklü taramalı elektron mikroskobu olarak kullanılan CAG tip dört salgı sistemi pi göz üretiminde demir sınırlaması koşulları altında üretimin arttığını göstermektedir. Bu yazıda yer alan teknik, mide kanseri gibi h pylori ile ilişkili hastalıklar için önemlidir, çünkü CAG tip dört sekresyon sistemi negatif hastalık sonuçları riskinin artması ile ilişkilidir. Böylece, bu önemli bakteri yüzeyinin düzenlenmesinin daha iyi anlaşılması.Organel, yeni kemoterapötik hedefleri ortaya çıkarabilir Ve yüksek çözünürlüklü taramalı elektron mikroskobunun floresan mikroskobu gibi mevcut yöntemlere göre avantajı, bireysel tip dört salgı hapı I'in görselleştirilebilmesidir. Bu elektron mikroskobu yöntemine yeni olan kişiler, prosedürle, özellikle de dikkatli bir zamanlama ve kan üzerinde hassas bir el gerektirdiğinden ıslak kimyayla ilgili sorunlar yaşarlar. Agar plakaları büyür.H Pylori PM'ler, S bir bakteri ve işleyen bir tip dört salgı sisteminden yoksun olan izojenik CAG e mutantı. Kültürleri aşılayın ve gece boyunca büyümek için kolesterol ile desteklenmiş modifiye Ella suyu. Daha sonra, bir GS insan mide epitel hücresini, değişen demir mevcudiyeti koşulları için 12 oyuklu plakalarda polilisin ile muamele edilmiş kapak kaymaları üzerine tohumlayın.H pylori'yi tek başına modifiye bru suyunda 600 / 0.3'lük bir optik yoğunluğa seyreltin. 100 mikro molar demir klorür, 200 mikromolar sentetik demir şelatör kepçe veya 200 mikro kepçe artı 200 mikro molar demir klorür kültürü içeren ortam. Dört saat boyunca numuneler şimdi bakterileri 1000 Gs'de santrifüjlüyor ve Resus peletleri kolesterol ile takviye edilmiş eşit hacimde taze modifiye bru suyu içinde askıya alıyor.Bakteri yoğunluğunu ölçün. Daha sonra, epitel hücrelerini h pylori ile 20'ye bir enfeksiyon çokluğunda enfekte edin. Seri seyreltmeler yapın ve bakteri hücrelerini kan agar plakalarına yerleştirin.Bakteri hücresi canlılığını değerlendirmek için, kokültürleri dört saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Süpernatanı h pylori I ve bir GS kokokültürlerinden boşaltın. Yapışan hücreleri 0.05 molar sodyum kaplama tamponu ile üç kez nazikçe yıkayın.Ardından numuneleri oda sıcaklığında iki ila dört saat sabitleyin. Daha sonra, numuneleri 0.05 molar sodyum ca coate tamponu ile üç kez yıkayın. İkincil bir fiksasyon için, iki ardışık 10 dakikalık fiksasyon adımında 0.05 molar sodyum ca coate tamponuna% 0.1 osmiyum tetroksit ekleyin.Daha sonra üç yıkamadan sonra, numuneleri artan etanol konsantrasyonları ile kurutun. Numuneleri kritik nokta kurutma makinesine yerleştirin, ardından hazneyi sıvı karbondioksit ile doldurun. Etanol hazneden boşaltılır ve hazne tekrar sıvı karbondioksit ile doldurulur.Numune daha sonra 31.1 santigrat derece ve 1073 PSI olan kritik noktaya alınır, şimdi kapak fişlerini alüminyum SEM numune saplamalarına monte edin ve topraklama için numune kenarına ince bir kolloidal gümüş çizgi boyayın. SEM görüntüleme sırasında, bir püskürtme kaplama makinesi kullanarak, örnek ikincil elektron sinyalini ve kenar etkisini artırmak için örnekleri beş nanometre altın paladyum ile kaplayın. Numuneleri, beş ila 10 milimetrelik bir çalışma mesafesinde yüksek vakum modunda bir alan emisyon tabancası taramalı elektron mikroskobu görüntüsü ile inceleyin.Hızlanma voltajını beş kilovolta ayarlayın. Ardından spot boyutunu iki ila 2,5 olarak ayarlayın. Şimdi, yüksek büyütmeli görüntüleme için konak patojen arayüzünün daha iyi bir görünümünü elde etmek için numuneyi 15 ila 25 derece arasında eğin.Konakçı patojen etkileşimleri açısından zenginleştirilmiş PI ömrünü ısıtan bakteriler için epitel hücrelerinin kenarlarına yapışan bakterilerin görüntülenmesine öncelik verin. Mikrograf dosyalarını image J yazılımında açın. Pi li'yi, bakteri hücresi ile konak hücre arasında 10 ila 13 nanometre genişliğinde ve 60 ila 150 nanometre uzunluğunda oluşan yapılar olarak tanımlayın.Düz çizgi aracıyla bir çizgi çizerek ve ardından açılır menüden analiz sekmesine tıklayarak ölçüm aracını kalibre edin. Ölçeği ayarla'yı seçin ve bilinen mesafe altına büyütme çubuğu değerini girin ve uzunluk birimini nanometreye ayarlayın. Ardından Tamam'ı tıklayın.Şimdi pilotların uzunluğunun veya genişliğinin üzerini çizmek için düz bir çizgi aracı kullanın ve ardından her bir pilotu ölçmek ve ölçülen değerleri bir elektronik tablo programına kaydetmek için M kontrolüne basın. CAG tip dört salgı sisteminin profiline uymayan özellikleri göz ardı etmek için önceden belirlenmiş uzunluk ve genişlik parametrelerini kullanın. Daha sonra, aralık içindeki değerlere dayalı olarak PI I sayısını ölçün, istatistiksel olarak analiz edin, iki kuyruklu bir öğrenci T-testi kullanarak PI LI'nin bir nicelleştirmesini analiz edin.Bu deneyde, h pylori, büyümeyi önemli ölçüde inhibe etmeyen konsantrasyonlarda sentetik şelatör daldırma parital kullanılarak demir tükenmiş koşullarda kültürlendi. Bakteriler, insan mide hücreleri ile ko-kültür yaparken çok sayıda CAG tip dört salgı sistemi PII üretti. Tersine, dışsal bir besin demir kaynağı mevcut olduğunda, CAG tip dört sekresyon sistemi PII'sinin oluşumu baskılanır.Konakçı patojen arayüzündeki PII'nin miktar tayini, demir kısıtlaması koşullarında, h pylori'nin CAG tip dört sekresyon sistemi PI gözünde iki kat artış gösterdiğini, kazıklı hücrelerin yüzdesinin, tek başına ortamda yetiştirilen hücrelere kıyasla% 11 arttığını ortaya koymaktadır. İlginç bir şekilde, konakçı IL sekiz sekresyonu ile ölçülen CAG tip dört sekresyon sistemi aktivitesi, demir kısıtlaması koşulları altında arttırılmasına ve aşırı demir mevcudiyeti koşulları altında baskılanmasına rağmen, PI LI boyutları, tüm demir mevcudiyeti koşulları arasında tutarlı kalmaktadır. CAG tip dört sekresyon sisteminin katılımı ile tutarlı olarak, demir mevcudiyeti, bir CAG e mutantının yüzeyindeki PI LI'nin biyogenezini değiştirmez Gelişiminden sonra.Bu SEM tekniği, CAG tip dört salgı sistemi alanındaki araştırmacıların protein lokalizasyonunu keşfetmelerinin yolunu açtı. CAG tipi dört salgı sistemi yastığı ile ilgili olarak. Son zamanlarda, efektör protein CAG a'nın tip dört salgı hapının ucuna lokalize olduğu keşfedilmiştir.

high-resolution-electron-microscopy-helicobacter-pylori-cag-type-iv

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bir sentetik operon kodlama hem salgı cihaz ve curli liflerin yapısal monomerlerin tasarımı açıklanmaktadır. Bu amiloidleri ve yapışık polimerlerin aşırı bir bağlılık ölçülebilir bir kazanç...

Tek Sentetik Curli Operon Oluşturma tarafından Mühendislik Bağlanan Bakteriler

Bu makale, ilgilenilen bir protein ile E. coli'deki diğer faktörler arasındaki etkileşimleri izlemek için bölgeye özgü fotoçapraz bağlama ile birlikte nabız kovalama radyo etiketlemesinin kullanımını göstermektedir. Geleneksel kimyasal çapraz bağlama yöntemlerinden farklı olarak, bu yaklaşım, canlı bir hücredeki düzenli bir montaj yolunun yüksek çözünürlüklü "anlık görüntülerini" oluşturur.

Bölgeye Özgü Çapraz Bağlama Kullanarak Salgılanan Bir Bakteriyel Virülans Faktörünün Montajının İzlenmesi

Bu makale SPHIRE yazılım paketini kullanarak cryo-EM görüntüleri işlemek için bir protokol sunmaktadır. Mevcut protokol, neredeyse atomik çözünürlüğü hedefleyen hemen hemen tüm tek parçacılı EM projeleri için uygulanabilir.

SPHIRE Kullanılarak Elektron Kriyo-mikroskopi Görüntülerinden Yüksek Çözünürlüklü Tek Parçacık Analizi

Fareler enfeksiyon ve gastrointestinal mikroorganizmalar tarafından neden olduğu hastalıklar çalışmaya bir çok değerli vivo içinde modeli temsil. Burada, bakteriyel kolonizasyon ve Helicobacter pylorifare modelleri histopatolojik değişiklikleri incelemek için kullanılan yöntemleri tarif-hastalığı ile ilgili.

Fare modelleri Helicobacter enfeksiyonu ve gastrik patolojiler

Bir araç ve yöntemleri transmisyon elektron mikroskopi nanoliter ölçekli örnek birimleri hazırlanması için sunulmaktadır. Hiçbir kağıt kurutma işlem, böylece bu önemli ölçüde örnek kaybı azaltılması ve tek hücre için görsel proteomik lysate analizini sağlayan proteinler için olabilir zararlı sonuçları kaçınarak gereklidir.

Kırılan numune hazırlama için iletim elektron mikroskobu

Mycobacterium tuberculosis düşük demir koşullarına yanıt olarak ekstrasellüler üretimi ve salınımını gösterir. Bu çalışma, demir eksikliğine yanıt olarak salınan mikobakteriyel ekstrasellüler saflaştırma ve karakterizasyonu için düşük demir koşulları ve yöntemleri oluşturmak için bir protokol ayrıntıları.

Demir sınırlı Mycobacteria tarafından üretilen Ekstrasellüler Veziküllerin İzolasyon ve Karakterizasyonu

Bakteri hücrelerinin görüntülenmesi, büyük makromoleküler makinelerin işlevini belirleyen statik ve dinamik süreçleri tanımlamaya odaklanmış yeni ortaya çıkan bir sistem biyolojisi yaklaşımıdır. Burada Lejyonella pnömophila tip IV salgı sistemi mimarisi ve fonksiyonlarını incelemek için kantitatif canlı hücre görüntüleme ve kriyo-elektron tomografisi entegrasyonu kullanılmaktadır.

Legionella pnömophila Dot/Icm Salgı Sisteminin Spatiotemporal Özelliklerini Çözmek İçin Canlı Hücre Görüntüleme ve Kriyo-Elektron Tomografisi Uygulama

CryoEM kullanılarak makromoleküler komplekslerin yapı tespiti, belirli protein ve kompleks sınıfları için rutin hale gelmiştir. Burada, bu işlem hattı özetlenmiştir (numune hazırlama, tarama, veri toplama ve işleme) ve okuyucular daha zorlu numuneler durumunda değiştirilebilecek daha ayrıntılı kaynaklara ve değişkenlere yönlendirilir.

Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskopisi: Numuneden Yapıya

Makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü kriyo-EM haritaları da 200 kV TEM mikroskopları kullanılarak elde edilebilir. Bu protokol, 200 kV TEM kullanarak yüksek çözünürlüklü veri kümelerinin başarılı bir şekilde toplanması için gerekli olan doğru optik hizalamaları, veri toplama şemalarını ve görüntüleme alanlarının seçimini ayarlamak için en iyi uygulamaları gösterir.

200 KV İletim Elektron Mikroskobu Kullanarak Yüksek Çözünürlüklü Kriyo-EM Veri Kümelerinin Rutin Toplanması

Protokol zarı proteinleri kullanarak kriyo-elektron tomografisi ve 3D görüntü işleme yapıları belirlemek için yüksek verimli bir yaklaşımı açıklar. Numune hazırlama, veri toplama, veri işleme ve yorumlama kapsar ve yaklaşım, HIV-1 zarf glikoprotein bir temsilcisi hedef üretim ile son bulur. Bu hesaplama prosedürleri, araştırmacılar ve öğrenciler uzaktan çalışma ve veri işleme ve yapısal analiz için katkıda bulunmayı sağlayan bir şekilde dizayn edilmiştir.

Cryo-Elektron Tomografi ve Otomatik Sub-tomogram Ortalaması kullanarak HIV Zarf Glikoproteinler Moleküler Yapılarının Belirlenmesi

Keşfedin, Helicobacter pylori'de Cag-T4SS salgı sisteminin yüksek çözünürlüklü taramalı elektron mikroskobu ile görüntülenmesini. Demir kısıtlaması altında pilus üretiminin arttığını öğrenin.

Yüksek çözünürlüklü elektron mikroskobu Helikobakter pilori Çağ Tip IV Salgı Sistemi Pili

Daha fazla video keşfet