Yüksek çözünürlüklü elektron mikroskobu Helikobakter pilori Çağ Tip IV Salgı Sistemi Pili

Prosedür, demir sınırlaması koşulları altında meydana gelen CAG tip dört sekresyon sistemi pii'nin hiper üretimini görselleştirir, ilk kültür h pylori demir sınırlaması koşulları altında. İkinci adım, h pylori'yi gastrik epitel hücreleri ile birlikte kültürlemektir. Daha sonra, taramalı elektron mikroskobu için ko-kültür örneklerini işleyin.

Sonuçta yüksek çözünürlüklü taramalı elektron mikroskobu olarak kullanılan CAG tip dört salgı sistemi pi göz üretiminde demir sınırlaması koşulları altında üretimin arttığını göstermektedir. Bu yazıda yer alan teknik, mide kanseri gibi h pylori ile ilişkili hastalıklar için önemlidir, çünkü CAG tip dört sekresyon sistemi negatif hastalık sonuçları riskinin artması ile ilişkilidir. Böylece, bu önemli bakteri yüzeyinin düzenlenmesinin daha iyi anlaşılması.

Organel, yeni kemoterapötik hedefleri ortaya çıkarabilir Ve yüksek çözünürlüklü taramalı elektron mikroskobunun floresan mikroskobu gibi mevcut yöntemlere göre avantajı, bireysel tip dört salgı hapı I'in görselleştirilebilmesidir. Bu elektron mikroskobu yöntemine yeni olan kişiler, prosedürle, özellikle de dikkatli bir zamanlama ve kan üzerinde hassas bir el gerektirdiğinden ıslak kimyayla ilgili sorunlar yaşarlar. Agar plakaları büyür.

H Pylori PM'ler, S bir bakteri ve işleyen bir tip dört salgı sisteminden yoksun olan izojenik CAG e mutantı. Kültürleri aşılayın ve gece boyunca büyümek için kolesterol ile desteklenmiş modifiye Ella suyu. Daha sonra, bir GS insan mide epitel hücresini, değişen demir mevcudiyeti koşulları için 12 oyuklu plakalarda polilisin ile muamele edilmiş kapak kaymaları üzerine tohumlayın.

H pylori'yi tek başına modifiye bru suyunda 600 / 0.3'lük bir optik yoğunluğa seyreltin. 100 mikro molar demir klorür, 200 mikromolar sentetik demir şelatör kepçe veya 200 mikro kepçe artı 200 mikro molar demir klorür kültürü içeren ortam. Dört saat boyunca numuneler şimdi bakterileri 1000 Gs'de santrifüjlüyor ve Resus peletleri kolesterol ile takviye edilmiş eşit hacimde taze modifiye bru suyu içinde askıya alıyor.

Bakteri yoğunluğunu ölçün. Daha sonra, epitel hücrelerini h pylori ile 20'ye bir enfeksiyon çokluğunda enfekte edin. Seri seyreltmeler yapın ve bakteri hücrelerini kan agar plakalarına yerleştirin.

Bakteri hücresi canlılığını değerlendirmek için, kokültürleri dört saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Süpernatanı h pylori I ve bir GS kokokültürlerinden boşaltın. Yapışan hücreleri 0.05 molar sodyum kaplama tamponu ile üç kez nazikçe yıkayın.

Ardından numuneleri oda sıcaklığında iki ila dört saat sabitleyin. Daha sonra, numuneleri 0.05 molar sodyum ca coate tamponu ile üç kez yıkayın. İkincil bir fiksasyon için, iki ardışık 10 dakikalık fiksasyon adımında 0.05 molar sodyum ca coate tamponuna% 0.1 osmiyum tetroksit ekleyin.

Daha sonra üç yıkamadan sonra, numuneleri artan etanol konsantrasyonları ile kurutun. Numuneleri kritik nokta kurutma makinesine yerleştirin, ardından hazneyi sıvı karbondioksit ile doldurun. Etanol hazneden boşaltılır ve hazne tekrar sıvı karbondioksit ile doldurulur.

Numune daha sonra 31.1 santigrat derece ve 1073 PSI olan kritik noktaya alınır, şimdi kapak fişlerini alüminyum SEM numune saplamalarına monte edin ve topraklama için numune kenarına ince bir kolloidal gümüş çizgi boyayın. SEM görüntüleme sırasında, bir püskürtme kaplama makinesi kullanarak, örnek ikincil elektron sinyalini ve kenar etkisini artırmak için örnekleri beş nanometre altın paladyum ile kaplayın. Numuneleri, beş ila 10 milimetrelik bir çalışma mesafesinde yüksek vakum modunda bir alan emisyon tabancası taramalı elektron mikroskobu görüntüsü ile inceleyin.

Hızlanma voltajını beş kilovolta ayarlayın. Ardından spot boyutunu iki ila 2,5 olarak ayarlayın. Şimdi, yüksek büyütmeli görüntüleme için konak patojen arayüzünün daha iyi bir görünümünü elde etmek için numuneyi 15 ila 25 derece arasında eğin.

Konakçı patojen etkileşimleri açısından zenginleştirilmiş PI ömrünü ısıtan bakteriler için epitel hücrelerinin kenarlarına yapışan bakterilerin görüntülenmesine öncelik verin. Mikrograf dosyalarını image J yazılımında açın. Pi li'yi, bakteri hücresi ile konak hücre arasında 10 ila 13 nanometre genişliğinde ve 60 ila 150 nanometre uzunluğunda oluşan yapılar olarak tanımlayın.

Düz çizgi aracıyla bir çizgi çizerek ve ardından açılır menüden analiz sekmesine tıklayarak ölçüm aracını kalibre edin. Ölçeği ayarla'yı seçin ve bilinen mesafe altına büyütme çubuğu değerini girin ve uzunluk birimini nanometreye ayarlayın. Ardından Tamam'ı tıklayın.

Şimdi pilotların uzunluğunun veya genişliğinin üzerini çizmek için düz bir çizgi aracı kullanın ve ardından her bir pilotu ölçmek ve ölçülen değerleri bir elektronik tablo programına kaydetmek için M kontrolüne basın. CAG tip dört salgı sisteminin profiline uymayan özellikleri göz ardı etmek için önceden belirlenmiş uzunluk ve genişlik parametrelerini kullanın. Daha sonra, aralık içindeki değerlere dayalı olarak PI I sayısını ölçün, istatistiksel olarak analiz edin, iki kuyruklu bir öğrenci T-testi kullanarak PI LI'nin bir nicelleştirmesini analiz edin.

Bu deneyde, h pylori, büyümeyi önemli ölçüde inhibe etmeyen konsantrasyonlarda sentetik şelatör daldırma parital kullanılarak demir tükenmiş koşullarda kültürlendi. Bakteriler, insan mide hücreleri ile ko-kültür yaparken çok sayıda CAG tip dört salgı sistemi PII üretti. Tersine, dışsal bir besin demir kaynağı mevcut olduğunda, CAG tip dört sekresyon sistemi PII'sinin oluşumu baskılanır.

Konakçı patojen arayüzündeki PII'nin miktar tayini, demir kısıtlaması koşullarında, h pylori'nin CAG tip dört sekresyon sistemi PI gözünde iki kat artış gösterdiğini, kazıklı hücrelerin yüzdesinin, tek başına ortamda yetiştirilen hücrelere kıyasla% 11 arttığını ortaya koymaktadır. İlginç bir şekilde, konakçı IL sekiz sekresyonu ile ölçülen CAG tip dört sekresyon sistemi aktivitesi, demir kısıtlaması koşulları altında arttırılmasına ve aşırı demir mevcudiyeti koşulları altında baskılanmasına rağmen, PI LI boyutları, tüm demir mevcudiyeti koşulları arasında tutarlı kalmaktadır. CAG tip dört sekresyon sisteminin katılımı ile tutarlı olarak, demir mevcudiyeti, bir CAG e mutantının yüzeyindeki PI LI'nin biyogenezini değiştirmez Gelişiminden sonra.

Bu SEM tekniği, CAG tip dört salgı sistemi alanındaki araştırmacıların protein lokalizasyonunu keşfetmelerinin yolunu açtı. CAG tipi dört salgı sistemi yastığı ile ilgili olarak. Son zamanlarda, efektör protein CAG a'nın tip dört salgı hapının ucuna lokalize olduğu keşfedilmiştir.